專利名稱：一種目的蛋白制備方法及其用途的制作方法
一種目的蛋白制備方法及其用途
技術領域：
本發明涉及基因工程技術，特別涉及一種目的蛋白制備方法及其用途。
背景技術：
神經生長因子(NGF)是1951年是由諾貝爾生理學和醫學獎獲得者R. Levi-Montalcini和S. Cohen在小鼠肉瘤細胞內發現的[1，2]。NGF在神經元的發育、生長、分化以及軸突的生長、遞質的合成及細胞的凋亡等階段均起著重要作用。它促進發育中 的交感、感覺神經元的分化和成熟。維持成年交感神經元的正常功能。經典的NGF是從小鼠頜下腺中分離所得的分子量為140000的糖蛋白，由a、P、Y三種肽鏈按a 20 Y2的比例構成，在NGF三種亞基中，^亞單位是NGF的活性區，因而習慣上所謂的NGF就是指其3亞單位，由兩個118個氨基酸組成的單鏈通過非共價鍵結合而成二聚體，與人體NGF的結構具有高度的同源性，生物效應也無明顯的種間特異性[3，4]。天然NGF蛋白主要是從成年雄性小鼠頜下腺分離和純化而得的，方法包括，利用Varon等(1967，1972)的方法通過輔助修飾分離出7s NGF復合物；利用Smith等(1968)的方法分離出7s NGF中的P-NGF亞單位，即用0. 05M,pH 10. 3硼酸鈉緩沖液(sodium boratebuffer)(含有 1.5M NaCl)從 CM 纖維柱(CM-cellulose column)上洗脫得到 P-NGF ;利用Bocchini和Angeletti (1969)的方法可制備2. 5s NGF ;利用Smith等(1968)的方法亦可獲得7s NGF的a和Y亞單位，較為經典的是Mobley等(1976)的方法。用基因工程方法表達和純化人神經生長因子，近年來一直備受關注，有報道用昆蟲、酵母細胞和大腸桿菌等表達系統表達NGF [5-8]。目前，存在的主要問題是如何提高表達量、易于純化和保持良好的生物學活性。目前需要一種解決以上問題的蛋白制備方法。
發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種提高表達量、易于純化和保持良好的生物學活性的蛋白制備方法。為實現上述目的，本發明提供以下技術方案，包括以下步驟目的蛋白核苷酸序列片段的獲得；目的蛋白重組表達載體的構建；目的蛋白的誘導表達；目的蛋白的純化；純化產物的切割；所述目的蛋白的核苷酸序列片段的前面插入單體切割的識別位點；所述目的蛋白通過PCR擴增得到，通過引物引入單體切割的識別位點；優選的，目的蛋白是人神經生長因子，胸腺肽、虎紋克胰肽、虎紋鎮痛肽。在純化之前還包括鑒定蛋白表達的步驟。
所述目的蛋白重組表達載體構建中的目的蛋白基因是一個或一個以上拷貝；所述目的蛋白基因的一個以上拷貝數通過將含有一個以上拷貝目的蛋白基因的表達盒與表達載體構建來實現。所述的單體切割的識別位點是根據密碼子規則編碼的氨基酸序列，優選地，切割位點序列編碼為單個氨基酸或兩個氨基酸或三個氨基酸或六個氨基酸；更優選地，所述單個氨基酸為R或W或M或D或E或K ;兩個氨基酸為D-P或N-G ;三個氨基酸為R-K-R或R-R-R ;六個氨基酸為L-V-P-R-G-S。所述的英文大寫字母為氨基酸的代碼，比如R表示精氨酸，W表示色氨酸,M表示甲硫氨酸,D表示天冬氨酸,E表示谷氨酸,P表示脯氨酸,N表示天冬酰氨，G表示苷氨酸，K表示賴氨酸，L表示亮氨酸，V表示纈氨酸，S表示絲氨酸。遵守20種氨基酸的密碼子表。所述的單體切割的識別位點可通過定點突變目的基因來實現；優選地將人神經生長因子的第158和第213位的甲硫氨酸突變為蘇氨酸。 當所述目的蛋白基因是一個以上拷貝時，是以目的蛋白表達盒為單位進入表達載體進行克隆的；優選地，當得到一個拷貝數的重組表達載體時，在此基礎上經過酶切連接等手段重組得到兩個拷貝數的重組表達載體；依次類推，得到一個以上拷貝數的各重組表達載體。每個單拷貝均含有完整的表達盒，其中包含目的基因、標簽蛋白編碼序列和各類表達元件的完整操縱子序列，確切的，標簽蛋白編碼序列包括但不限于6XHis或GST蛋白或MBP蛋白編碼序列，表達元件包括啟動子、操縱子、核糖體結合位點、多克隆位點和轉錄終止信號，并且，采用該方法構建P-hNGF串聯多拷貝時，具有定向連接特征。所述的表達載體為原核表達系統，優選為pET系統、pGEX系統、pMAL系統；優選地，原核表達系統經過了改造，以使載體上的酶切位點不被相應的酶識別，其中所述酶切位點在后期被用于目的蛋白與表達載體的構建；比如，改造后的PET系統的多克隆位點上的BamHI.Sall和XhoI酶切位點已被消除，且載體轉錄啟動子上游含有BglII酶切位點，而轉錄終止子下游添加串聯的BamHI、SalI和XhoI酶切位點；上述酶切位點在載體上的前后順序為 XhoI、Sail、BamHI、BglII。所述的目的蛋白的純化為采用親和層析柱進行純化，優選為，親和層析柱的標簽為His標簽、GST標簽、MBP標簽；任選地，所述純化產物的切割包括化學試劑或酶切割，以獲得純化的目的蛋白重組蛋白；優選地，化學試劑為溴化氰、甲酸或羥胺，酶試劑為胰蛋白酶、梭菌蛋白酶、弗林蛋白酶、凝血酶或亮氨酸氨肽酶；本發明還保護由該方法所得的目的蛋白制品。本發明還保護由該方法所得的目的蛋白制品用于醫藥的用途。本發明以人神經生長因子P -hNGF為例來說明本發明的方法。本發明提供的方法具有普遍應用性，其具有如下設計方案I、設計擴增P -hNGF的特異性引物，從人胎盤中PCR擴增獲得P -hNGF基因編碼序列。設計的3 -hNGF引物具有如下特征編碼鏈和模板鏈的5’端上游及3’端下游含有改造后載體MCS的不相同的酶切位點，使得P-hNGF基因能正向插入改造后的原核表達載體中，且插入的P -hNGF基因位于設計的BamHI、Sail和XhoI串聯酶切位點之間。
2、利用寡核苷酸雜交之后與載體連接的方法消除載體多克隆位點(MCS)的BamHI、Sail和XhoI切點，同時在轉錄終止子下游引入串聯的BamHI、Sail和XhoI酶切位點，該串聯酶切位點序列為5’ -CTCGAGTCGACGGATCC-3’。所述改造載體用兩對同尾酶(Bglll/BamHI和Sall/Xhol)及T4連接酶多次酶切連接后，可構建P -hNGF定向多拷貝克隆體。3、在P -hNGF基因的5’端上游序列引入切割位點序列，切割位點序列具有如下特征根據密碼子規則編碼的氨基酸序列可被化學試劑或酶切割。優選的，所述切割位點序列編碼為單個氨基酸或兩個氨基酸或六個氨基酸，確切的，單個氨基酸為R或W或M或D或E或K ;兩個氨基酸為D-P或N-G ;三個氨基酸為R-K-R或R-R-R ;六個氨基酸為L-V-P-R-G-S。4、所述多拷貝構建體亞克隆至原核表達載體中形成原核表達構建體。所述構建體可在原核表達系統中進打原核表達，所述原核表達系統包括pET系統、pGEX系統、pMAL系統等，不排除其他原核表達系統。5、所述原核表達構建體在所述原核表達系統中原核表達后的產物可利用原核表達系統中的標簽進行親和層析純化，所述標簽包括His標簽、GST標簽、MBP標簽等，不排除其他親和層析標簽。6、所述原核表達產物可被化學試劑或酶切割，獲得純化的P-hNGF重組蛋白，確切的，化學試劑包括溴化氰、甲酸和羥胺，酶試劑包括胰蛋白酶(Trypsin)、梭菌蛋白酶(Clostripain)、弗林蛋白酶(Furin)、凝血酶(Thrombin)和亮氨酸氨肽酶(Leucineaminopeptidase)。7、所述純化后的P -hNGF重組蛋白，采用PC12細胞或雞胚背根神經節進行培養檢測，具有顯著生物活性，與鼠頜下腺中提取的天然NGF無明顯差異。8、采用本發明方法構建重組P -hNGF,降低了目的蛋白二硫鍵復性與構象折疊的難度，基因表達產物即為目的蛋白單體，不帶額外氨基酸殘基，既保證了產物活性，也省去了多拷貝的切割成本，純化簡單，易于大量生產。本發明的一個實施例提供了用本發明的方法制備人神經生長因子制品的步驟，與現有技術相比，本發明的制備方法表達量高、易于純化、并保持了目的蛋白良好的生物學活性。本發明的一個實施例通過雞胚背根神經節培養鑒定試驗證明了該方法得到的人神經生長因子單體產物具有3 -NGF的活性。在本發明中，術語“定向”是指感興趣多肽基因DNA片段按照編碼鏈5’ -3’方向相互連接，還指表達多肽產物按氨基端-羧基端方向相互連接。在本發明中，術語“多拷貝”是指感興趣多肽基因DNA片段大于或等于兩個拷貝數。
圖I為PCR介導的定點誘變技術的原理圖。圖2為hNGF與其他同源NGF序列保守性分析圖。圖3為表達盒(帶有P -hNGF基因)串聯構建流程圖。圖4為檢測pET28a_NGFl，2，3酶切產物凝膠電泳圖。
圖5為雞胚背根神經節培養鑒定P -NGF的結果圖。
具體實施方式
下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。以下目的蛋白是以P -hNGF為例來進行說明本發明的方法，其它目的蛋白類似。以下引物合成、序列合成和序列測序均為Invit rogen公司實施例I :利用串聯多拷貝表達盒的方法高效表達P -hNGF
I、原核表達質粒的改造I. I 消除 pET_28a ( + )載體多克隆位點(MCS)中的 BamHI-SalI-XhoI 切點合成如下寡核苷酸片段pET28a-deBam-Xho-F:5’ -GATCTGAATTCGAGCTCCTGCAGCAAGCTTGCGGCCGCA-3’ (SEQID NO:I)pET28a-deBam-Xho-R:5， -TCGATGCGGCCGCAAGCTTGCTGCAGGAGCTCGAATTCA-3’ (SEQID NO :2)pET28a-deBam-Xho-F和pET28a-deBam_Xho-R變性雜交形成雜交片段產物，如下示例5’-GATCTGAATTCGAGCTCCTGCAGCAAGCTTGCGGCCGCA-3’I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I3，-ACTTAAGCTCGAGGACGTCGTTCGAACGCCGGCGTAGCT-5’將雜交產物與經BamHI/XhoI雙酶切的pET_28a ( + )載體片段回收產物連接，轉化DH5 a感受態細胞；挑選10個單菌落進行PCR鑒定，引物為pET_28a ( + )載體通用上下游引物；T7:5，-TAATACGACTCACTATAGGG-3，(SEQ ID NO:3)T7TER:5’-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’ (SEQ ID NO:4)菌落PCR鑒定為陽性的克隆經質粒提取后直接送測序公司測序，測序結果提示正確的克隆命名為pET28a-de-Bam-Xho。I. 2利用PCR介導的定點誘變技術(原理見圖1，其中F和R為載體通用引物，IM和2M為誘變引物)在上述步驟所得的pET28a-de-Bam-Xho載體多克隆位點緊挨著轉錄終止子的下游引入BamHI-SalI-XhoI酶切位點。I)合成如下寡核苷酸片段pET28a-4383-F* :GGTTGCATTCGATTCCTGTT (SEQ ID NO:5)pET28a-647-R* CCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGT (SEQ ID NO:6)pET28a-Bam-Sal-Xho-F** :ATACTCGAGTCGACGGATCCGGATATAGTTC (SEQ IDN0:7)pET28a-Bam-Sal-Xho-R** :TCCGTCGACTCGAGTATGGCGAATGGGACGC (SEQ IDN0:8)注*為外圍引物；**為誘變引物。2)突變位點片段擴增以pET_28a ( + )載體為模板，利用pET28a_4383_F*/pET28a-Bam-Sal-Xho-R# 引物和 pET28a-Bam-Sal-Xho-F#/pET28a_647-R* 引物分別擴增獲得帶有突變位點的5’側翼和3’側翼的擴增產物。PCR反應體系
權利要求
1.一種目的蛋白的制備方法，其特征是包括如下步驟， 目的蛋白核苷酸序列片段的獲得； 目的蛋白重組表達載體的構建； 目的蛋白的誘導表達； 目的蛋白的純化； 純化產物的切割； 所述目的蛋白核苷酸序列片段的前面插入單體切割的識別位點； 所述目的蛋白通過PCR擴增得到，通過引物引入單體切割的識別位點； 優選的，目的蛋白是人神經生長因子，胸腺肽、虎紋克胰肽、虎紋鎮痛肽。
2.權利要求I的制備方法，其特征在于，在純化之前還包括鑒定蛋白表達的步驟。
3.權利要求I或2的制備方法，其特征在于，所述目的蛋白重組表達載體構建中的目的蛋白基因是一個或一個以上拷貝； 任選地，所述目的蛋白基因的一個以上拷貝數通過將含有一個以上拷貝目的蛋白基因的表達盒與表達載體構建來實現； 任選地，當得到一個拷貝數的重組表達載體時，在此基礎上經過酶切連接等方法重組得到兩個拷貝數的重組表達載體； 依次類推，得到兩個以上拷貝數的各重組表達載體。
4.權利要求I或2的制備方法，其特征在于，所述的單體切割的識別位點是根據密碼子規則編碼的氨基酸序列，優選地，單體切割的識別位點序列編碼為單個氨基酸或兩個氨基酸或三個氨基酸或六個氨基酸；更優選地，所述單個氨基酸為R或W或M或D或E或K;兩個氨基酸為D-P或N-G ;三個氨基酸為R-K-R或R-R-R ;六個氨基酸為L-V-P-R-G-S。
5.權利要求4的制備方法，其特征在于，所述的單體切割的識別位點可通過定點突變目的基因來實現；優選地將人神經生長因子的第158和第213位的甲硫氨酸突變為蘇氨酸。
6.權利要求3的制備方法,其特征在于,所述的表達載體為原核表達系統,優選為pET系統、pGEX系統、pMAL系統；更優選地，原核表達系統經過了改造，以使載體上的部分酶切位點不被相應的酶識別。
7.權利要求I或2的制備方法，其特征在于，所述的目的蛋白的純化為采用親和層析柱進行純化，優選地，親和層析柱的標簽為His標簽、GST標簽、MBP標簽。
8.權利要求I或2的制備方法，其特征在于，所述純化產物的切割包括化學試劑或酶切害I]，以獲得純化的目的蛋白重組蛋白；優選地，化學試劑為溴化氰、甲酸或羥胺，酶試劑為胰蛋白酶、梭菌蛋白酶、弗林蛋白酶、凝血酶或亮氨酸氨肽酶。
9.權利要求1-8任一方法所得的目的蛋白。
10.權利要求9的目的蛋白用于醫藥的用途。
全文摘要
本發明涉及一種目的蛋白制備方法及其用途。其制備方法為目的蛋白核苷酸序列片段的獲得；目的蛋白重組表達載體的構建；目的蛋白的誘導表達；目的蛋白的純化；純化產物的切割；所述目的蛋白核苷酸序列片段的前面插入單體切割的識別位點；所述目的蛋白通過PCR擴增得到，通過引物引入單體切割的識別位點；其中的目的蛋白可以是人神經生長因子，胸腺肽、虎紋克胰肽、虎紋鎮痛肽等等。采用本發明的制備方法制備得到的目的蛋白表達量高、易于純化、降低了目的蛋白二硫鍵復性與構象折疊的難度，基因表達產物即為目的蛋白單體，不帶額外氨基酸殘基，既保證了目的蛋白產物良好的生物學活性，也省去了多拷貝的切割成本，純化簡單，易于大量生產。
文檔編號C07K14/48GK102978211SQ20121046700
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月19日 優先權日2012年11月19日
發明者任宏偉, 章永磊, 鄒有土, 凡復, 湯黎娜 申請人:廈門北大之路生物工程有限公司