專利名稱：一種具有免疫活性的多肽衍生物及其內參抗體的制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及化學合成技術領域，更具體地，本發明涉及一種具有免疫活性的多肽衍生物及其內參抗體的制備方法和應用。
背景技術：
目前，常用的多肽化合物沒有完整的免疫原性，免疫時需要偶聯載體蛋白，并且特異性不強，靈敏度不高，制備方法復雜。更重要的是由于制備后的抗原含有載體蛋白，所以用此抗原制備的抗體會產生抗載體蛋白的抗體，有時會對后期的實驗產生不良影響即非特異性反應。·
發明內容
本發明旨在至少解決上述技術問題之一。為此，本發明的一個目的在于提出一種具有完整免疫原性，且制備方法簡單的具有免疫活性的多肽衍生物。根據本發明實施例的具有免疫活性的多肽衍生物，具有下列序列結構R8 (Kys) 4- (Lys) 2-LyS_Gly，其中，R 表示多肽片段，其序列為YDESGPSIVHRKCF_GSK。根據本發明實施例的具有免疫活性的多肽衍生物，一個賴氨酸支架上同時合成八個目的多肽，該目的多肽大大的增加了多肽抗原的分子量及抗原性，從而免去偶聯載體蛋白，使抗原的特異性更好。本發明的另一個目的在于提出一種具有免疫活性的多肽衍生物及其內參抗體的制備方法，其具體操作步驟可以包括a)提供9-芴基甲氧羰酰基保護的氨基酸(Fmoc-AA)并使其活化，得到活化氨基酸；b)將所述活化氨基酸與P-羥甲基苯氧甲基多聚乙烯樹脂(HMP樹脂)反應，得到連接有氣基酸的樹脂；C)脫除所述連接有氨基酸的樹脂的Fmoc保護基；d)將脫除Fmoc保護基的連接有氨基酸的樹脂與過量的活化羧基組份偶聯，并脫去偶聯后活化氨基組份的氨基保護基；e)重復步驟d)至脫去偶聯后活化氨基組份的氨基保護基的數目為8，得到八分支活化氨基組份骨架；f)將所述八分支活化氨基組份骨架同時連接8個相同的多肽，得到肽樹脂，將所述肽樹脂分離提純，得到具有免疫活性的多肽衍生物。根據本發明實施例的具有免疫活性的多肽衍生物及其內參抗體的制備方法，其合成過程在自動化的多肽合成儀上完成，制備工藝簡便，結構準確，偶聯率高，周期短，自動化程度高。
為了快速得到八分支活化氨基組份骨架，所述活化氨基組份優選為賴氨酸。當所述活化氨基組份為賴氨酸時，在脫去偶聯后活化氨基組份的氨基保護基過程中便可脫去兩個氨基保護基，再與過量的賴氨酸偶聯時，就可以與兩個賴氨酸同時偶聯，再脫去偶聯后活化氨基組份的氨基保護基時便可脫去四個氨基保護基。依此類推，第三次脫除過程便可脫去八個氨基保護基，得到八分支活化氨基組份骨架。所述八個相同的多肽R優選為YDESGPSIVHRKCF-GSK，由此，便可得到具有免疫活性的多肽衍生物(YDESGPSIVHRKCF-GSK) 8 (Kys) 4- (Lys) 2-Lys_Gly。關于具有免疫活性的多肽衍生物的分離提純，具體可以包括f-Ι)用三氟乙酸(TFA)結合清除劑與所述肽樹脂反應，以將所述具有免疫活性的多肽衍生物從肽樹脂上分離；
f-2)反應后去除清除劑，并用萃取液萃取，得到具有免疫活性的多肽衍生物粗品;f-3)將具有免疫活性的多肽衍生物粗品進行純化，得到具有免疫活性的多肽衍生物。關于清除劑的選擇，沒有特殊限制，只要能將所述具有免疫活性的多肽衍生物從肽樹脂上分離即可，優選地，所述清除劑為1，2-乙二硫醇(EDT)、硫代苯甲醚和水的混合溶液。為了保證反應的充分進行，反應時間優選3h。所述萃取液的選擇也沒有特殊限制，考慮到成本問題，所述萃取液優選為乙醚。關于具有免疫活性的多肽衍生物的純化，采用高效液相色譜分離純化，其具體操作條件為
色譜柱 Ci8 25 X 250mm
色譜儀 Waters 600美國Waters公司
流動相 A-Ο. P/oTFA (三氟乙酸)H2O
B -O. 1% TFA (三氟乙酸)于60 乙腈 檢測波長 214nm 流速 I Oml/分鐘 洗脫梯度 2G-60%B 洗脫時間 30分鐘由此，可制得純度為98%以上的具有免疫活性的多肽衍生物。本發明還提出了一種具有免疫活性的多肽衍生物在制備抗體中的應用。基于所述具有免疫活性的多肽衍生物具有完整的免疫原性，則根據該具有免疫活性的多肽衍生物制備而成的抗體具有特異性強，靈敏度高，穩定性好的特點，為廣大科研人員提供了高質量的抗體，同時為開發其它多肽抗體開辟了一條新思路。本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。
本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中圖1是根據本發明實施例的具有免疫活性的多肽衍生物高效液相色譜分析示意圖。
具體實施例方式以下通過具體實施例來進一步描述本發明，下列實施例用于說明目的，而非用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，可按照常見的分子克隆手冊所述的條件進行操作。下列實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買所得。實施例1具有免疫活性的多肽衍生物的制備
一、試驗材料HMP resin (P-輕甲基苯氧甲基多聚乙烯樹脂，Wang樹脂)購于Merck公司Fmoc-AA(9-芴基甲氧羰酰基保護的氨基酸)購于Merck公司NMP氮甲基吡咯烷酮購于Merck公司DCM 二氯甲烷購于Merck公司MeOH甲醇購于Merck公司Piperidine 哌唳購于 Merck 公司DMAP 二甲基氨基吡啶購于Sigma公司HOBT羥基苯并三唑購于Sigma公司DCC 二環已基碳二亞胺購于Sigma公司TFA三氟乙酸購于Sigma公司EDT 1,2-乙二硫醇購于Sigma公司硫代苯甲醚購于Sigma公司結晶苯酚購于北京化學試劑公司公司乙腈購于Merck公司二、試驗儀器多肽自動合成儀美國CSBio 336型多通道多肽自動合成儀旋轉蒸發儀日本YAMATO CE50型旋轉蒸發儀高效液相色譜儀Waters 600E型冷凍干燥機美國Virtis真空循環水泵鄭州長城科貿公司SH-B型離心機美國SIGMA公司三、試驗步驟1、活化 Fmoc-AA。所述Fmoc-AA的結構式如下所示
權利要求
1.一種具有免疫活性的多肽衍生物，所述多肽衍生物具有下列序列結構R8 (Kys) 4- (Lys) 2-LyS_Gly，其中，R 表示多肽片段，其序列為YDESGPSIVHRKCF_GSK。
2.一種具有免疫活性的多肽衍生物及其內參抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟a)提供9-芴基甲氧羰酰基保護的氨基酸(Fmoc-AA)并使其活化，得到活化氨基酸；b)將所述活化氨基酸與P-羥甲基苯氧甲基多聚乙烯樹脂(HMP樹脂)反應，得到連接有氣基酸的樹脂；c)脫除所述連接有氨基酸的樹脂的Fmoc保護基；d)將脫除Fmoc保護基的連接有氨基酸的樹脂與過量的活化羧基組份偶聯，并脫去偶聯后活化氨基組份的氨基保護基；e)重復步驟d)至脫去偶聯后活化氨基組份的氨基保護基的數目為8，得到八分支活化氨基組份骨架；f)將所述八分支活化氨基組份骨架同時連接8個相同的多肽，得到肽樹脂，將所述肽樹脂分離提純，得到具有免疫活性的多肽衍生物。
3.根據權利要求2所述的具有免疫活性的多肽衍生物及其內參抗體的制備方法，其特征在于，在步驟a)中，所述Fmoc-AA通過與人多巴胺脫羧酶(DDC)和羥基苯并三唑(HOBT)反應活化。
4.根據權利要求2所述的具有免疫活性的多肽衍生物及其內參抗體的制備方法，其特征在于，所述活化氨基組份為賴氨酸。
5.根據權利要求2所述的具有免疫活性的多肽衍生物及其內參抗體的制備方法，其特征在于,所述多肽為YDESGPSIVHRKCF-GSK。
6.根據權利要求2所述的具有免疫活性的多肽衍生物及其內參抗體的制備方法，其特征在于，步驟f)包括f-1)用三氟乙酸(TFA)結合清除劑與所述肽樹脂反應，以將所述具有免疫活性的多肽衍生物從肽樹脂上分離；f-2)反應后去除清除劑，并用萃取液萃取，得到具有免疫活性的多肽衍生物粗品；f_3)將具有免疫活性的多肽衍生物粗品進行純化，得到具有免疫活性的多肽衍生物。
7.根據權利要求6所述的具有免疫活性的多肽衍生物及其內參抗體的制備方法，其特征在于，所述清除劑為I，2-乙二硫醇(EDT)、硫代苯甲醚和水的混合溶液，步驟f-Ι)的反應時間為3h。
8.根據權利要求6所述的具有免疫活性的多肽衍生物及其內參抗體的制備方法，其特征在于，所述萃取液為乙醚。
9.根據權利要求6所述的具有免疫活性的多肽衍生物及其內參抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟f_3)的純化采用高效液相色譜分離純化。
10.一種具有免疫活性的多肽衍生物在制備抗體中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種具有免疫活性的多肽衍生物及其內參抗體的制備方法和應用，所述多肽衍生物具有下列序列結構R8(Kys)4-(Lys)2-Lys-Gly，其中，R表示多肽片段，其序列為YDESGPSIVHRKCF-GSK。根據本發明實施例的具有免疫活性的多肽衍生物，一個賴氨酸支架上同時合成八個目的多肽，該目的多肽大大的增加了多肽抗原的分子量及抗原性，從而免去偶聯載體蛋白，使抗原的特異性更好。
文檔編號C07K16/00GK102993276SQ20121043880
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月6日 優先權日2012年11月6日
發明者姬志娟, 鄔曉樂, 鄔江, 張波, 張軍龍, 張春玲, 張婉婷, 薛金蓮, 沈向陽, 喬國明 申請人:北京博奧森生物技術有限公司