專利名稱：幽門螺桿菌免疫顯性表位肽及其制備方法和應用的制作方法
幽門螺桿菌免疫顯性表位肽及其制備方法和應用技術領域
本發明屬于醫藥生物技術領域，涉及一種幽門螺桿菌免疫顯性表位肽及其制備方法和應用。
背景技術：
幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, Hp) 1982年由澳大利亞學者Warren和 Marshall發現，其定植于人胃粘膜局部，致使全球50%以上人群感染，成為慢性胃炎，胃十二指腸潰瘍及胃粘膜相關淋巴組織淋巴瘤等胃腸疾病發生的主要致病因素。同時世界衛生組織已將Hp列為與胃癌發生密切相關的一類致癌因子。目前臨床上針對Hp感染問題， 主要采用抗生素加質子泵抑制劑的多聯療法，但存在高耐藥性、易復發和再次感染等不足， 嚴重制約了抗生素多聯療法的臨床療效和使用范圍，而疫苗的免疫接種有可能成為徹底消除Hp感染和治療相關胃腸疾病的有效手段。
全球現已廣泛開展Hp疫苗研究，包括全菌疫苗、亞單位疫苗和核酸疫苗等，但絕大多數處于實驗室研發和臨 床試驗階段，且免疫保護效果仍不十分理想。上述已有疫苗可激發以抗體為主的體液免疫應答且作為其主要免疫保護機制，而對于胞外感染菌所誘導的CD4+T淋巴細胞應答未能在疫苗設計和研究策略上給予足夠的重視。大量研究結果表明無論是Hp自然感染還是疫苗接種，抗原特異性CD4+T淋巴細胞發揮重要作用，其中以產 IFN-Y的CD4+T淋巴細胞的免疫保護作用較為明確。為了有效激發機體產生抗原特異性 IFN- Y +CD4+T淋巴細胞應答，需對現有疫苗候選保護性抗原中免疫優勢表位進行系統的篩選并從中確定保護性表位。
目前表位的篩選與鑒定方法主要包括質譜法、軟件預測、步移合成重疊肽等多種方法。質譜法操作簡單、省時、快速，但不能排除自身反應性表位和在自然狀態下不能被抗原遞呈細胞加工遞呈的表位。軟件預測法雖簡便、快速，但預測結果常與真實情況存在一定的出入，需實驗加以驗證。步移合成重疊肽是一種系統篩選表位的方法，可有效克服質譜法和預測法的不足，明確表位的免疫優勢應答特性，避免漏篩和誤篩現象。因此本研究采用步移合成重疊肽法進行優勢表位的篩選。
現已研究發現同一種抗原聯合不同佐劑可誘導機體產生不同的免疫保護作用， 其保護作用的差異可能是由于誘導產生的優勢應答表位不同而導致的，因此，本研究采用幽門螺桿菌疫苗候選抗原結合不同佐劑免疫接種小鼠，分析其免疫保護作用，并通過步移合成重疊肽技術篩選鑒定優勢應答表位肽，進而對優勢應答表位肽進行免疫保護效果評價。發明內容
本發明的目的是從幽門螺桿菌抗原中篩選鑒定出優勢應答的CD4+T細胞免疫顯性表位肽，所述免疫顯性表位肽能有效激發CD4+T細胞產生高水平IFN- Y應答，并具有顯著的抗幽門螺桿菌感染的免疫保護作用。
本發明提供了一種幽門螺桿菌免疫顯性表位肽，其氨基酸序列如SEQ IDNO:97, 100、108 和 115 所示。
本發明所提供的幽門螺桿菌尿素酶B亞單位(UreB)抗原的優勢應答的免疫顯性表位肽可用于幽門螺桿菌預防性或治療性疫苗。所述疫苗優選為蛋白疫苗或核酸疫苗。
所使用制劑包含醫學上可接受的免疫佐劑，優選為弗氏佐劑、CPG 0DN1826或 AddaVax。
本發明進一步提供了所述免疫顯性表位肽的制備方法，包含以下步驟
I)從蛋白數據庫中獲取幽門螺桿菌來源的UreB蛋白質序列；
2)從步驟I)獲取的UreB蛋白質序列的第I號氨基酸開始，每次步移6個氨基酸， 以步移重疊的18個氨基酸為一個多肽段，形成第一多肽庫，和/或在獲得的第一多肽中；
3)利用抗原特異性CD4+T細胞從步驟2)所述的第一多肽庫中篩選18個氨基酸短肽的免疫顯性表位肽；
4)利用步驟3)篩選出的18個氨基酸短肽的免疫顯性表位肽采用步移法，每次步移2個氨基酸，以步移重疊的至少13個氨基酸為一個多肽段，形成第二多肽庫；
5)利用抗原特異性CD4+T細胞從步驟4)所述的第二多肽庫中篩選13個氨基酸短肽的免疫顯性表位肽；
6)利用MHC分子抗體阻斷實驗確定步驟5)篩選的免疫顯性表位肽的限制性。
結果顯示所制備的免疫顯性表位肽具有明顯免疫保護作用，其保護效果不亞于甚至優于全蛋白抗原。本發明中所提供的免疫顯性表位肽均可誘導機體針對相應表位產生強烈的免疫應答反應。因此通過誘導機體針對免疫保護性表位產生應答，或直接用保護性表位免疫機體將對幽門螺桿菌感染起到有效免疫保護作用，可用于進一步的幽門螺桿菌預防性和治療性表位疫苗的研究。
為讓本發明的上述及其它目的、特征和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例， 并配合附圖，作詳細說明如下。
圖I表示UreB抗原聯合不同佐劑免疫攻毒后檢測胃組織幽門螺桿菌定植量，可見不同佐劑組免疫保護作用存在差異。
圖2A和圖2B表示ELISA方法檢測不同佐劑組血清IgG (圖2A)/胃局部slgA (圖 2B)抗體水平，可見IgG抗體應答與免疫保護作用之間并不十分吻合。slgA抗體應答與免疫保護作用之間存在一定相關性。
圖3A表示經流式細胞術方法檢測脾淋巴細胞中抗原特異性CD4+T細胞，可見免疫組存在抗原特異性⑶4+T細胞。
圖3B表示各組脾淋巴細胞中抗原特異性⑶4+T細胞的頻率，可見免疫組較PBS對照組存在明顯區別。
圖4表示利用抗原特異性⑶4+T細胞和步移合成重疊肽對所有18個氨基酸組成的短肽進行篩選，其中P53、P63、P68、P69、P81、P82為免疫顯性肽段。
圖5A-圖5F表示利用抗原特異性⑶4+T細胞和步移重疊合成肽對13個氨基酸組成的短肽進行篩選，其中P53-4，P63-2，P68-5，P81-4為更短的免疫顯性肽段。
圖6表示利用MHC分子抗體阻斷實驗確定免疫顯性表位MHC限制性，發現均為 MHC- II (I-A)亞型限制性。
圖7表示用免疫顯性表位肽免疫小鼠后攻毒，檢測胃局部幽門螺桿菌定植量，可見不同表位免疫組保護作用存在差異，P53、P63表位具有更顯著的免疫保護作用。
圖8A和圖8B表示ELISA法檢測不同表位免疫組血清抗UreB和相應表位IgG抗體水平,可見表位免疫不能有效誘導血清抗體產生。
圖9A和圖9B表示ELISA法檢測不同表位免疫組胃局部抗UreB和相應表位slgA 抗體水平，可見表位免疫不能有效誘導粘膜抗體產生。
圖10表示ICS法檢測各表位免疫組脾淋巴細胞中表位特異性⑶4+T細胞的比例， 可見各免疫組均可誘導表位特異性CD4+T細胞產生。
具體實施方式
為了使本發明目的、技術方案及優點更加清楚明白，下面結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
材料與方法
(一)蛋白和肽段
重組幽門螺桿菌尿素酶B亞單位(rUreB)蛋白由本單位重組構建(吳超“幽門螺桿菌尿素酶B亞單位基因克隆表達及臨床應用”《中華檢驗醫學雜志》2001年5期)；
多肽肽段通過化學方法合成(由上海吉爾生化公司合成)，二甲亞砜(DMSO)溶解至 IOmM的濃度，-70°C保存，臨用時經RPMI-1640完全培養基稀釋到ImM濃度。
(二)主要溶液及試劑配制
I. RPMI-1640不完全培養基
分別稱取10. 4g RPMI-1640粉末，2. 4g !fepes和2g NaHCO3，加入去離子水至 IOOOmL,攪勻過濾除菌，分裝凍存。
2. RPMI-1640 完全培養基
分別量取900ml RPMI-1640不完全培養基和IOOml胎牛血清，加入20萬單位/mL 青霉素和鏈霉素雙抗各O. 5mL (終濃度為100U/mL)，混勻分裝。
3.凍存液
胎牛血清與DMSO按照9 I的比例混合，分裝凍存。
(三)所使用的主要試劑及其來源
權利要求
1.一種幽門螺桿菌免疫顯性表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0:97、100、108和115所/Jn ο
2.根據權利要求I所述的幽門螺桿菌免疫顯性表位肽，其特征在于，所述表位肽具有MHC- II (I-A)限制性。
3.權利要求I或2所述的幽門螺桿菌免疫顯性表位肽在制備用于預防或治療幽門螺桿菌感染的制劑中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述制劑為疫苗。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述疫苗為蛋白疫苗或核酸疫苗。
6.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述制劑包含醫學上可接受的免疫佐劑。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述免疫佐劑為弗氏佐劑、CPGODN1826或 AddaVax。
8.制備權利要求I所述的幽門螺桿菌免疫顯性表位肽的方法，其特征在于，有以下步驟 O從蛋白數據庫中獲取幽門螺桿菌來源的UreB蛋白質序列； 2)從步驟I)獲取的UreB蛋白質序列的第I號氨基酸開始，每次步移6個氨基酸，以步移重疊的18個氨基酸為一個多肽段，形成第一多肽庫，和/或在獲得的第一多肽中 3)利用抗原特異性CD4+T細胞從步驟2)所述的第一多肽庫中篩選18個氨基酸短肽的免疫顯性表位肽； 4)利用步驟3)篩選出的18個氨基酸短肽的免疫顯性表位肽采用步移法，每次步移2個氨基酸，以步移重疊的至少13個氨基酸為一個多肽段，形成第二多肽庫； 5)利用抗原特異性CD4+T細胞從步驟4)所述的第二多肽庫中篩選13個氨基酸短肽的免疫顯性表位肽； 6)利用MHC分子抗體阻斷實驗確定步驟5)篩選的免疫顯性表位肽的限制性。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，步驟2)所述的第一多肽庫的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1-93所示；第二多肽庫的多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0:94_119所/Jn ο
全文摘要
本發明涉及一種幽門螺桿菌免疫顯性表位肽及其制備方法和應用，所述顯性表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:97、100、108和115所示。本發明還提供了所述顯性表位肽的制備方法，并進一步提供了所述顯性表位肽用于預防或治療幽門螺桿菌感染的制劑中的應用。
文檔編號C07K7/08GK102924576SQ20121043587
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月5日 優先權日2012年11月5日
發明者吳超, 鄒全明, 李濱, 陳立, 楊武晨, 李海波, 章金勇, 趙 卓 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學藥學院