專利名稱：一種從銀杏葉提取物中分離純化銀杏內酯a、b、c及白果內酯的方法
技術領域：
本發明屬于中藥制備技術領域，具體涉及一種從銀杏葉提取物中分離純化銀杏內酯A、B、C及白果內酯的方法。
背景技術：
銀杏是我國特有物種，資源擁有量占世界總量的70%，在我國已有六百多年的藥用歷史，同時它也是西方國家研究最多的天然植物 之一，其中銀杏葉提取物以其在心腦血管等老年性疾病方面的治療與保健作用成為國際市場上最受追捧的植物藥制劑。內酯類化合物是銀杏葉提取物中的主要活性成分，包括銀杏內酯和白果內酯。其中銀杏內酯類成分具有特異性的抗血小板活化因子(PAF)作用，被認為是最有臨床應用前景的天然PAF受體拮抗劑，對心血管系統具有保護作用，是銀杏葉提取物治療冠心病、預防心肌缺血再灌注損傷以及抗心律失常的重要活性成分。白果內酯對神經系統具有較強的保護作用，可劑量依賴地保護神經元損傷、抑制神經細胞凋亡、促進神經細胞生長，同時能夠增加腦血流量，改善腦代謝，對缺血性腦水腫及老年性癡呆癥具有較好的治療作用。但銀杏內酯類化合物結構復雜，目前很難用化學合成的方法制備，且成本高昂。而各內酯類成分的極性差異小，分離純化到純度較高的單體化合物比較困難。目前國內的銀杏內酯類成分的富集純化方法主要有醇提-有機溶劑萃取-柱色譜分離或者采用CO2超臨界流體萃取法、中壓制備柱或液相制備等，大多設備要求較高或工藝步驟復雜、成本高、污染大，很難實現工業化生產。如公開號為1634925 A的專利申請公開了一種銀杏內酯單體的分離純化方法，該法以銀杏總內酯為原料，采用了柱色譜-重結晶-超臨界CO2精制純化的組合工藝。公開號為CN101392000A的專利申請公開了一種銀杏內酯單體的分離純化方法，該法以銀杏葉提取物為原料，通過多步有機溶劑萃取后經高效液相制備所得。公開號為101747338 A的專利申請公開了一種銀杏內酯類化合物制備方法，該法以銀杏葉或銀杏葉提取物為原料，通過水提及有機溶劑萃取后上硅膠柱，分別收集各內酯流份，再進行重結晶。公開號為CN102416027A的專利申請公開了利用高效液相色譜法純化銀杏內酯的方法，該法流動相選自體積比為55:40:5的乙酸乙酯、石油醚和甲醇的混合溶劑，流速為26ml/min，上樣量為120mg，制備出純度大于98%的四種內酯。公開號為102526025A的專利公開了以苯乙烯型非極性大孔吸附樹脂分離銀杏內酯A、B、C的方法。公開號CN101134758公開了一種制備銀杏內酯單體的方法，該方法以銀杏葉為原料，通過醇提、乙酸乙酯萃取，萃取物過選擇性極性無孔吸附樹脂，制得銀杏總內酯，總內酯再過硅膠柱后分別收集各內酯流份并重結晶獲得各內酯單體。公開號為CN102552340A的專利公開了一種制備銀杏內酯單體的方法，該方法以銀杏葉提取物為原料，通過上聚酰胺柱、洗脫液靜置沉淀、有機溶劑提取沉淀后重結晶得到內酯混合物，混合物再通過上中壓制備柱得到各內酯單體。銀杏內酯高純度單體化合物的富集純化，將有利于此類藥物新劑型的研究與開發以及制劑的質量控制，同時針對不同病因給藥，有利于提高療效、降低毒副作用。但到目前為止，還沒有特別適合工業化生產的工藝簡單、操作方便、成本低廉的銀杏內酯類化合物單體的制備工藝。
發明內容
本發明的目的可以通過以下技術方案實現一種從銀杏葉提取物中分離純化銀杏內酯A、B、C及白果內酯的方法，該方法包括以下步驟a)取銀杏葉提取物加入熱水后攪拌或超聲溶解、過濾，殘渣再用熱水溶解3 5次,過濾,合并濾液；b)調整濾液的相對密度；
c)以每Iml樣品溶液加I 3ml聚酰胺材料的比例，將制得的濾液通過聚酰胺柱吸附，上樣完畢后，用2 3倍柱體積純化水洗脫，收集上樣流出液和水洗液；d)將上樣流出液和水洗液合并，減壓濃縮，冷藏靜置，分步結晶，得到銀杏內酯粗品;e)步驟d)分步結晶后的母液，減壓濃縮至原體積的1/60 1/40，用中等極性有機溶劑萃取2 3次，有機相合并后減壓濃縮，濃縮液揮干溶劑，殘渣用含水乙醇結晶，得到白果內酯粗品；優選的，步驟d)分步結晶后的母液，減壓濃縮至原體積的1/60 1/50。f)上述銀杏內酯和白果內酯粗品用含水乙醇重結晶I 3次，可以分別得到銀杏內酯A、B、C及白果內酯單體化合物。上述的方法，其在于步驟a)中所述熱水的溫度優選為55 70°C。上述的方法，其在于步驟b)中所述濾液的相對密度調整為I. 01 I. 03。上述的方法，其在于步驟c)中所述的聚酰胺材料為14 60目，優選30 60目。上述的方法，其在于步驟d)中所述分步結晶的次數為3次，第一次將上樣流出液和水洗液合并后，減壓濃縮至原體積的1/15 1/10 ;第二次將抽濾后的結晶母液濃縮至原體積的1/25 1/20 ;第三次將抽濾后的結晶母液濃縮至原體積的1/40 1/30。上述分步結晶過程中第一次結晶所得的銀杏內酯粗品主要為銀杏內酯A、B混合物；第二次結晶所得的銀杏內酯粗品主要為銀杏內酯A、B混合物，以銀杏內酯A為主；第三次結晶所得的銀杏內酯粗品主要為銀杏內酯A、B、C混合物，以銀杏內酯C為主。上述的方法，其在于步驟d)中每次結晶的時間為8 24h，優選12 18h。上述的方法，其在于步驟e)中所述的中等極性有機溶劑為二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯或乙酸甲酯，優選乙酸乙酯。所述的結晶時間為12 48h。上述的方法，其在于步驟e)和f)中所述的含水乙醇，乙醇體積百分比為40% 85%,優選 50% 70%。上述的方法，其在于所制備的銀杏內酯A、B、C及白果內酯的純度高于90%，可作為藥品、保健品的原料。上述技術方案的具體詳細過程為I、取銀杏葉提取物，加熱水溶解，過濾，濾渣繼續用熱水溶解3 5次，濾過，合并，濾液調整相對密度至I. 01 I. 03 ;2、將制得的濾液，以每Iml濾液加I 3ml聚酰胺材料的比例，通過聚酰胺柱吸附，上樣完畢后，用2 3倍柱體積純化水洗脫，收集上樣流出液和水洗液；3、合并上樣流出液及水洗液，減壓濃縮至原體積的1/15 1/10，濃縮液冷藏靜置8 24h ;抽濾晶體(晶體主要為銀杏內酯A、B混合物)后，結晶母液濃縮至原體積的1/25 1/20，繼續冷 藏靜置8 24h ;抽濾晶體(晶體主要為銀杏內酯A、B混合物，以銀杏內酯A為主)后，結晶母液濃縮至原體積的1/40 1/30，繼續冷藏靜置8 24h，抽濾晶體(晶體主要為銀杏內酯A、B、C混合物，以銀杏內酯C為主)。4、經三次結晶后的母液濃縮至原體積的1/60 1/40，用中等極性有機溶劑萃取2 3次，合并有機相，減壓濃縮，揮干溶劑，殘渣用含水乙醇結晶，得到白果內酯粗品。上述萃取有機溶劑為二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯或乙酸甲酯，優選乙酸乙酯；含水乙醇的乙醇體積百分比為40% 85%，優選50% 70%。5、所得晶體分別用含水乙醇重結晶I 3次，得到純度高于90%的銀杏內酯A、B、C及白果內酯單體。上述含水乙醇的乙醇體積百分比為40% 85%，優選50% 70%。本發明所述冷藏的冷藏溫度為2 8°C。 本發明所述的原體積為上樣流出液和水洗液合并的體積。與現有技術比較本發明的有益效果相對于現有技術路線和工藝，本發明只需一次過柱后再重結晶，該法步驟簡單、生產成本低、污染較少，能實現工業化生產，所得到的內酯類成分純度均高于90%，可作為藥品和保健品的原料。
具體實施例方式下面以具體實施例對本發明作詳細說明，所涉及到的方法是本領域的技術人員能夠掌握和應用的技術手段，但本發明不限于所述實施例。銀杏葉提取物采購于江蘇邳州，按照高效液相色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VI D)及中國藥典2010年版一部“銀杏葉提取物”項中“含量測定”法測定。其中銀杏內酯A含量2. 32%，銀杏內酯B含量O. 95%，銀杏內酯C含量I. 40%,白果內酯含量3. 32%，符合規定。實施例I :取干燥銀杏葉提取物1kg，以65°C熱水攪拌溶解，濾過，濾渣再以熱水溶解3次，濾過，合并濾液。濾液加純化水稀釋至15L，相對密度I. 01，備用。取預先處理好的30 60目聚酰胺材料，濕法裝柱，柱體積為30L。上樣液過聚酰胺柱，上樣結束后，以60L純化水洗脫，收集上樣流出液和水洗液，共75L，合并，減壓濃縮至6L。濃縮液冷藏靜置18h，抽濾得到粗晶I，重量為16. 9g，其中銀杏內酯A含量為33. 3%，銀杏內酯B含量為36. 2% ;過濾后母液濃縮至3. 5L，繼續冷藏靜置14h，抽濾得到粗晶II，重量為20. 3g，其中銀杏內酯A含量為48. 2%，銀杏內酯B含量為7. 2% ;過濾后母液再濃縮至2. 4L，繼續冷藏靜置10h，抽濾得到粗晶III，重量為19. 6g，其中銀杏內酯A含量為12. 1%，銀杏內酯B含量為3. 6%，銀杏內酯C含量為42. 3% ;過濾后母液濃縮至I. 4L，以等體積乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，減壓濃縮后揮干溶劑，所得萃取物以60%乙醇溶解后靜置24h，抽濾得到粗晶IV，重量為40. 3g，其中白果內酯含量為69. 8%，。粗晶I以70%乙醇重結晶2次，得到銀杏內酯B 4. 9g，含量為92. 4% ;粗晶II以60%乙醇重結晶2次，得到銀杏內酯A 8. 3g，含量為97. 1% ;粗晶III以55%乙醇重結晶3次，得到銀杏內酯C 6. 8g，含量為93. 8% ;粗晶IV以60%乙醇重結晶I次，得到白果內酯25. lg，含量為98. 3%。上述的含量測定方法按照高效液相色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VI D)及中國藥典2010年版一部“銀杏葉提取物”項中“含量測定”法測定。實施例2 取干燥銀杏葉提取物2kg，以70°C熱水超聲溶解，濾過，濾渣再以熱水溶解5次，濾過，合并濾液。濾液加純化水稀釋至25L，相對密度I. 02，備用。取預先處理好 的30 60目聚酰胺材料，濕法裝柱，柱體積為60L。上樣液過聚酰胺柱，上樣結束后，以150L純化水洗脫，收集上樣流出液和水洗液，共175L，合并，減壓濃縮至約12. 5L。濃縮液冷藏靜置24h，抽濾得到粗晶I，重量為35. lg，其中銀杏內酯A含量為31. 4%，銀杏內酯B含量為35. 9% ;過濾后母液濃縮至約7L，繼續冷藏靜置12h，抽濾得到粗晶II，重量為39. 2g，其中銀杏內酯A含量為50. 3%，銀杏內酯B含量為6. 9% ;過濾后母液濃縮至約4. 5L，繼續冷藏靜置18h，抽濾得到粗晶III，重量為41. 0g，其中銀杏內酯A含量為11.9%，銀杏內酯B含量為1.9%，銀杏內酯C含量為46. 2% ;過濾后母液濃縮至約3L，以同等體積乙酸甲酯萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮后揮干溶劑，所得萃取物以55%乙醇溶解后靜置20h，抽濾得到粗晶IV，重量為78. 3g，其中白果內酯含量為65. 3%。粗晶I以70%乙醇重結晶3次，得到銀杏內酯B 9. 9g，含量為93. 2% ;粗晶II以60%乙醇重結晶2次，得到銀杏內酯A 18. lg，含量為96. 0% ;粗晶III以55%乙醇重結晶3次，得到銀杏內酯C 17. 3g，含量為94. 1% ;粗晶IV以70%乙醇重結晶I次，得到白果內酯46. 5g，含量為98. 8%。上述的含量測定方法按照高效液相色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VI D)及中國藥典2010年版一部“銀杏葉提取物”項中“含量測定”法測定。
權利要求
1.一種從銀杏葉提取物中分離純化銀杏內酯A、B、C及白果內酯的方法，其特征在于該方法包括以下步驟 a)取銀杏葉提取物加入熱水后攪拌或超聲溶解、過濾，殘渣再用熱水溶解3 5次，過濾，合并濾液； b)調整濾液的相對密度； c)以每Iml樣品溶液加I 3ml聚酰胺材料的比例，將制得的濾液通過聚酰胺柱吸附，上樣完畢后，用2 3倍柱體積純化水洗脫，收集上樣流出液和水洗液； d)將上樣流出液和水洗液合并，減壓濃縮，冷藏靜置，分步結晶，得到銀杏內酯粗品； e)步驟d)分步結晶后的母液，減壓濃縮至原體積的1/60 1/40，用中等極性有機溶劑萃取2 3次，有機相合并后減壓濃縮，濃縮液揮干溶劑，殘渣用含水乙醇結晶，得到白果內酷粗品； f)上述銀杏內酯和白果內酯粗品用含水乙醇重結晶I 3次，可以分別得到銀杏內酯A、B、C及白果內酯單體化合物。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟a)中所述的熱水溫度為55 70°C。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟b)中所述濾液的相對密度調整為I. 01 I. 03。
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟c)中所述的聚酰胺材料為14 60目，優選30 60目。
5.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟d)中所述的分步結晶次數為3次，第一次將上樣流出液和水洗液合并后，減壓濃縮至原體積的1/15 1/10 ;第二次將抽濾后的結晶母液濃縮至原體積的1/25 1/20 ;第三次將抽濾后的結晶母液濃縮至原體積的1/40 1/30。
6.根據權利要求I或5所述的方法，其特征在于步驟d)中每次的結晶時間為8 24h，優選12 18h。
7.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟e)中所述的中等極性有機溶劑為二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯或乙酸甲酯，優選乙酸乙酯。
8.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟e)中所述的結晶時間為12 48h。
9.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟e)和f)中所述的含水乙醇，乙醇體積百分比為40% 85%，優選50% 70%。
10.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所制備的銀杏內酯A、B、C及白果內酯的純度高于90%，可作為藥品、保健品的原料。
全文摘要
本發明公開了一種從銀杏葉提取物中分離純化銀杏內酯A、B、C及白果內酯的方法，該方法包括提取、柱層析、萃取、重結晶等步驟，其中，所述的柱層析步驟是用經提取步驟制得的提取液，以每1ml提取液加1～3ml聚酰胺材料的比例過聚酰胺吸附柱，再以純化水洗滌，收集上樣流出液和水洗液；減壓濃縮后進行分步結晶，得到粗晶后再進行重結晶，分別得到純度高于90%的銀杏內酯A、B、C及白果內酯單體化合物。本方法步驟簡單、操作方便、成本低廉、污染較少，可用于工業化生產。
文檔編號C07D493/20GK102911185SQ201210423959
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月30日 優先權日2012年10月30日
發明者秦勇, 金春, 段緒紅, 沈舒, 李梅, 胡傳良 申請人:江蘇神龍藥業有限公司, 江蘇誠創新藥研發有限公司