專利名稱：一種含抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑及制備方法和IgY全效牙膏的制作方法
技術領域：
本發明涉及口腔用品技術領域，特別涉及一種含抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑及其制備方法和含抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑、具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌混合特異性IgY抗體制劑的用于預防齲齒和牙齦炎及其口臭的牙膏。
背景技術：
我國3飛歲兒童患齲率為25. 499Γ92. 72%，成人患齲率為40. 37%。其中變形鏈球菌和遠緣鏈球菌是主要致齲菌。細菌感染性疾病的發生，首先是通過細菌表面結合的粘附素與其存在于上皮細胞、內皮細胞、白細胞或細胞外基質中相應的受體發生特異性結合而定居于機體內的特定器官。變形鏈球菌和遠緣鏈球菌的感染正是利用食物中的蔗糖合成大量的胞外多糖構成牙菌斑的間質，有助于細菌對牙面的附著及細菌間的相互附著，形成菌斑。 人們一直期望通過抑制變形鏈球菌和遠緣鏈球菌的毒性來達到防齲的目的。近幾年抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌IgY作為一種新型的生物防齲物質受到廣泛關注。目前用于預防齲病的牙膏一般為含氟牙膏，在清除口腔致齲菌的同時也破壞了口腔內維持微生態平衡的有益菌，
此外，我國牙齦、牙周疾病發病率占人口的70%以上，牙齦卟啉單胞菌 (Porphyromonas gingival is)是慢性銀緣炎、慢性牙周炎、侵襲性牙周炎等牙周病的主要可疑致病菌，其菌毛能夠與口腔上皮細胞表面的甘油醛-3-磷酸脫氫酶結合，侵入牙齦上皮細胞和牙齦成纖維細胞，逃避免疫清除。牙齦卟啉單胞菌產生二肽酰氨肽酶降解結締組織，促進MMP-2和MMP-I活性增加。牙齦卟啉單胞菌的精氨酸和賴氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(1^^、1^^、1^ )能水解1^-12導致1剛￥產生減少。部分牙齦卟啉單細胞毛能夠誘導巨噬細胞表達L-Ia、L-li3、L_6、TNF°導致牙槽骨破壞。在牙周病患者同時伴隨著口臭的發生，其口臭主要有具核梭桿菌引起。目前沒有有效的治療口臭的方法，使用抗菌素類藥物治療口臭有很多弊端。
對于預防和治療牙周病和口臭從主要的病因菌牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌中著手是關鍵所在。
目前用于預防和治療牙周炎的牙膏一般為含有中草藥成分的牙膏。雖然這類的專利有很多，但均無明確療效。
現有文獻報道表明臨床上使用特異性IgY抗體預防齲齒和治療嬰幼兒輪狀病毒性腹瀉，預防肺纖維化患者綠膿桿菌感染，減輕幽門螺桿菌引起的胃痛效果顯著，且無副作用和成癮性。
在我們研究的許多種類的IgY中發現，有的牙周病因菌免疫母雞產生的IgY抗體經實驗證明沒有或沒有明顯的抑制牙周病和口臭的趨勢和療效。簡單的說，不是所有的IgY 都有明顯的治療作用。
由于牙周病和口臭的可疑病因菌有i^一種之多，但主要的可疑病因菌包括牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、伴放線菌放線桿菌、棲牙密螺旋體、福氏擬桿菌、牙齦二氧化碳噬纖維菌等。在探索制備對應的IgY用于治療牙周病和口臭的同時，我們推測牙齦卟啉單胞菌、 具核梭桿菌、伴放線菌放線桿菌、棲牙密螺旋體、福氏擬桿菌、牙齦二氧化碳噬纖維菌都有可能引起牙周病和口臭；因為我們事先無法預測在這當中的哪些菌是引起牙周病和口臭的主要因素，哪些菌是引起牙周病及其口臭是次要因素。
我們認為必須有合適的抗牙周病和口臭的試驗來確定哪些菌是引起牙周病和口臭的主要因素。從而指導制備抗牙周病和口臭的藥物或衛生產品。
目前的現有技術沒有相關的提示指導技術人員發現抗牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌混合IgY是解決治療牙周病及其口臭的關鍵。
技術人員無法預先在不做抗牙周病和口臭的實驗的前提下，預先得知牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌是引起牙周病及其口臭的主要因素。
技術人員無法預先在不做抗牙周病和口臭的實驗的前提下，預先得知抗牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌混合IgY比單獨的抗牙齦卟啉單胞菌IgY、單獨的抗具核梭桿菌IgY的效果更好。發明內容
本發明所要解決的技術問題之一在于提供一種抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑。
本發明所要解決的技術問題之二在于提供一種含抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑的制備方法。
本發明所要解決的技術問題之三在于提供一種含抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑、抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑的用于預防齲齒和牙齦炎及其口臭的牙膏。
作為本發明第一方面的抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑，其特征在于，由10 70重量份的變形鏈球菌菌體和菌體碎片與30 90重量份的遠緣鏈球菌菌體和菌體碎片混合成抗原免疫產蛋母雞而制備。
作為本發明第二方面的抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟
A.變形鏈球菌和遠緣鏈球菌培養步驟
A. I細菌種類變形鏈球菌(S. mutans)和遠緣鏈球菌(S. sobrinus)；
A. 2取變形鏈球菌(S. mutans)MT8148菌株和遠緣鏈球菌(S. sobrinus)6715菌株， 分別經BHI-S培養基分離培養和擴增培養的變形鏈球菌、遠緣鏈球菌，并經鑒定確認為變形鏈球菌、遠緣鏈球菌而得到變形鏈球菌菌體和菌體碎片、遠緣鏈球菌菌體和菌體碎片；
B.免疫原制備步驟
B. I取變形鏈球菌菌體和菌體碎片10 70重量份，遠緣鏈球菌菌體和菌體碎片 30 90重量份混合成菌液抗原；
B. 2將等體積的菌液抗原與等體積的福氏完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏完全佐劑變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合免疫原；每毫升福氏完全佐劑混合免疫原含有細菌10億-80億；
B. 3將等體積的混合菌液與等體積的福氏不完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏不完全佐劑變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合免疫原，每毫升福氏不完全佐劑混合免疫原中含有細菌10億-80億；
C.免疫步驟
使用注射器將福氏完全佐劑混合免疫原皮下和肌肉注射給產蛋母雞，每只產蛋母雞注射O. 5ml-3. Oml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐劑混合免疫原O. 5ml_3. Oml 皮下和肌肉注射給產蛋母雞。加強免疫二次后，此后每隔十周再使用福氏不完全佐劑混合免疫原O. 5ml-3. Oml皮下和肌肉注射給產蛋母雞加強免疫五次，前后共免疫八次；
D.變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY提取物的制備
收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母雞雞蛋，使用75%的酒精進行雞蛋表面消毒，打開蛋殼取蛋黃，去除蛋黃膜取蛋黃液，將蛋黃液與蒸餾水按體積比1:10的比例加蒸餾水，充分攪拌，并使用冰醋酸調節酸堿度至PH5. 30-5. 50，然后放置-20°c凍藏3天后取出解凍，取上清液，用凝膠過濾系統將蛋黃液濃縮20倍，用INNaOH調節PH至7. 0-8. 0， 置-20°C保藏。
上述抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑的制備方法，在所述步驟D后增加一 IgY純化步驟，具體是將變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY提取物加硫酸胺至55%的飽和度，充分攪拌，室溫靜置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，將沉淀使用蒸餾水稀釋到原體積量，再加硫酸胺至33%的飽和度，充分攪拌，室溫靜置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，用蒸餾水稀釋溶解后裝入透析袋，用蒸餾水經中空纖維過濾器除鹽，即得抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑純品。
在本發明一個優選實施例中，所述步驟D用以下方法所取代收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母雞雞蛋，用75%酒精消毒雞蛋外殼，打碎蛋殼，留取蛋黃。用去離子水10倍稀釋蛋黃后，用冰醋酸和無水乙酸鈉調節PH至5. 30-5. 50.，4°C沉降后取上清液， 添加2%的殼聚糖和海藻酸鈉，2%氯化鈣和多聚磷酸鈉絮凝沉降，再取上清液用凝膠過濾系統超濾去除多余的去離子水，將蛋黃液濃縮20倍左右，用IN氫氧化鈉調節PH至7. 0-8. 0， 置-20°C保藏。
作為本發明第三方面的含有上述抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑、抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑的用于預防齲齒、牙齦炎和牙周炎及其口臭的牙膏，包含有由抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑、抗牙銀卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑構成的抗致病菌制劑，所述抗致病菌制劑由占牙膏總質量的質量百分比原料組成
抗牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌混合特異性IgY抗體和抗變形鏈球菌、遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體按1:1質量比混合后的制劑O. 1-3. 0%、洗必泰O. 01-2. 0%、甘油I.0-30. 0%、聚乙烯吡咯烷酮O. 1-2. 0%，其中洗必泰、甘油、聚乙烯吡咯烷酮構成抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑、抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性 IgY抗體制劑的保護劑。
在本發明所述牙膏的一個優選實施例中，還包含牙膏膏劑，所述牙膏膏劑由占牙膏總質量的質量百分比原料組成卡波浦爾O. I O. 5%、羧甲基纖維素鈉O. 5 I. 3%、卡拉膠O. 2 O. 5%,黃原膠O. 3 O. 7%,甘油5. O 20. 0%,山梨醇5. O 70. 0%,阿斯巴甜 O. I O. 5% ;糖精鈉 O. I O. 3%, PEG-6000. 5 5. 0%, PEG-12000. 5 5. 0%，椰油酰胺丙基甜菜堿O. 1-2. 0%,香精O. 8 2. 0%, SiO2L O 30%,去離子水余量。
本發明用于預防齲齒、牙齦炎和牙周炎及其口臭的牙膏對預防齲齒、牙齦炎和牙周炎及其口臭病菌具有明顯的效果。
本發明的預防齲齒、牙齦炎和牙周炎及其口臭的IgY牙膏區別于含氟牙膏的優勢即在清除口腔致齲菌的同時還保護了口腔內維持微生態平衡的有益菌，彌補了傳統預防齲病方法的不足之處。
本發明的預防齲齒、牙齦炎和牙周炎及其口臭的IgY牙膏用于預防變形鏈球菌、 遠緣鏈球菌以及與其有共同抗原決定簇的厭氧菌引起的齲齒、牙齦炎和由牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌以及與其有共同抗原決定簇的厭氧菌引起的牙周炎及口臭等。
具體實施方式
下面結合實施例詳細描述本發明的實現方案。下面實施例所涉及的菌種皆由上海交通大學醫學院提供。
實施例I :
抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑的制備
A.變形鏈球菌和遠緣鏈球菌培養步驟
A. I細菌種類細菌種類變形鏈球菌(S. mutans)和遠緣鏈球菌(S. sobrinus)；
A. 2取變形鏈球菌(S.mutans)MT8148菌株和遠緣鏈球菌(S. sobrinus) 6715菌株，分別經BHI-S培養基分離培養和擴增培養的變形鏈球菌、遠緣鏈球菌，并經鑒定確認為變形鏈球菌、遠緣鏈球菌而得到變形鏈球菌菌體和菌體碎片、遠緣鏈球菌菌體和菌體碎片;
B.免疫原制備步驟
B. I取變形鏈球菌菌體和菌體碎片10 70重量份，遠緣鏈球菌菌體和菌體碎片 30 90重量份混合成菌液抗原；
B. 2將等體積的菌液抗原與等體積的福氏完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏完全佐劑變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合免疫原；每毫升福氏完全佐劑混合免疫原含有細菌10億-80億；
B. 3將等體積的混合菌液與等體積的福氏不完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏不完全佐劑變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合免疫原，每毫升福氏不完全佐劑混合免疫原中含有細菌10億-80億；
C.免疫步驟
使用注射器將福氏完全佐劑混合免疫原皮下和肌肉注射給產蛋母雞，每只產蛋母雞注射O. 5ml-3. Oml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐劑混合免疫原O. 5ml_3. Oml 皮下和肌肉注射給產蛋母雞。加強免疫二次后，此后每隔十周再使用福氏不完全佐劑混合免疫原O. 5ml-3. Oml皮下和肌肉注射給產蛋母雞加強免疫五次，前后共免疫八次；
D.抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY提取物的制備
收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母雞雞蛋，使用75%的酒精進行雞蛋表面消毒，打開蛋殼取蛋黃，去除蛋黃膜取蛋黃液，將蛋黃液與蒸餾水按體積比1:10的比例加蒸餾水，充分攪拌，并使用冰醋酸調節酸堿度至PH5. 30-5. 50，然后放置-20°C凍藏3天后取出解凍，取上清液，用凝膠過濾系統將蛋黃液濃縮20倍，用INNaOH調節PH至7. 0-8. 0， 置-20°C保藏。
E. IgY純化步驟
將變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY提取物加硫酸胺至55%的飽和度，充分攪拌，室溫靜置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，將沉淀使用蒸餾水稀釋到原體積量，再加硫酸胺至33%的飽和度，充分攪拌，室溫靜置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，用蒸餾水稀釋溶解后裝入透析袋，用蒸餾水經中空纖維過濾器除鹽，即得抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體直接純品。
抗變形鏈球菌、遠緣鏈球菌混合特異性IgY純品經ELISA方法測定，抗變形鏈球菌、遠緣鏈球菌混合特異性IgY純品中每毫克蛋白中的特異性IgY抗體的效價為 1:1280000/mg蛋白，或者稱抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY純品中，每毫克蛋白中的特異性IgY抗體的比活性為1:1280000/mg蛋白。在IgY抗體純品中，IgY抗體的純度經非還原性SDS-PAGE測定為89. 3%。
實施例2
抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑的制備
A.變形鏈球菌和遠緣鏈球菌培養步驟
A. I細菌種類細菌種類變形鏈球菌(S. mutans)和遠緣鏈球菌(S. sobrinus)；
A. 2取變形鏈球菌(S. mutans)MT8148菌株和遠緣鏈球菌(S. sobrinus)6715菌株， 分別經BHI-S培養基分離培養和擴增培養的變形鏈球菌、遠緣鏈球菌，并經鑒定確認為變形鏈球菌、遠緣鏈球菌而得到變形鏈球菌菌體和菌體碎片、遠緣鏈球菌菌體和菌體碎片；
B.免疫原制備步驟
B. I取變形鏈球菌菌體和菌體碎片10 70重量份，遠緣鏈球菌菌體和菌體碎片 30 90重量份混合成菌液抗原；
B. 2將等體積的菌液抗原與等體積的福氏完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏完全佐劑變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合免疫原；每毫升福氏完全佐劑混合免疫原含有細菌10億-80億；
B. 3將等體積的混合菌液與等體積的福氏不完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏不完全佐劑變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合免疫原，每毫升福氏不完全佐劑混合免疫原中含有細菌10億-80億；
C.免疫步驟
使用注射器將福氏完全佐劑混合免疫原皮下和肌肉注射給產蛋母雞，每只產蛋母雞注射O. 5ml-3. Oml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐劑混合免疫原O. 5ml_3. Oml 皮下和肌肉注射給產蛋母雞。加強免疫二次后，此后每隔十周再使用福氏不完全佐劑混合免疫原O. 5ml-3. Oml皮下和肌肉注射給產蛋母雞加強免疫五次，前后共免疫八次；
D.抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY提取物的制備
收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母雞雞蛋，用75%酒精消毒雞蛋外殼， 打碎蛋殼，留取蛋黃。用去離子水10倍稀釋蛋黃后，用冰醋酸和無水乙酸鈉調節PH至5. 30-5. 50.，4°C沉降后取上清液，添加2%的殼聚糖和海藻酸鈉，2%氯化鈣和多聚磷酸鈉絮凝沉降，再取上清液用凝膠過濾系統超濾去除多余的去離子水，將蛋黃液濃縮20倍左右， 用IN氫氧化鈉調節PH至7. 0-8. O,置-20°C保藏。
E. IgY純化步驟
將變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY提取物加硫酸胺至55%的飽和度，充分攪拌，室溫靜置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，將沉淀使用蒸餾水稀釋到原體積量，再加硫酸胺至33%的飽和度，充分攪拌，室溫靜置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，用蒸餾水稀釋溶解后裝入透析袋，用蒸餾水經中空纖維過濾器除鹽，即得抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體直接純品。
抗變形鏈球菌、遠緣鏈球菌混合特異性IgY純品經ELISA方法測定，抗變形鏈球菌、遠緣鏈球菌混合特異性IgY純品中每毫克蛋白中的特異性IgY抗體的效價為 1:1280000/mg蛋白，或者稱抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY純品中，每毫克蛋白中的特異性IgY抗體的比活性為1:1280000/mg蛋白。在IgY抗體純品中，IgY抗體的純度經非還原性SDS-PAGE測定為89. 3%。
實施例3
抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑的制備
A.牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌培養步驟
A. I細菌種類牙銀P卜啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)和具核梭桿菌 (Fusobacterium nucleatum)；
A. 2取牙齦卟啉單胞菌(P. g)ATCC33277菌株和具核梭桿菌(Fn)ATCC10953菌株， 分別經BHI-S培養基分離培養和擴增培養的牙齦卟啉單細胞菌、具核梭桿菌，并經鑒定確認為牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌而得到牙齦卟啉單胞菌菌體和菌體碎片、具核梭桿菌菌體和菌體碎片；
B.免疫原制備步驟
B. I取牙齦卟啉單胞菌菌體和菌體碎片10 70重量份，具核梭桿菌菌體和菌體碎片30 90重量份混合成菌液抗原；
B. 2將等體積的菌液抗原與等體積的福氏完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏完全佐劑牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合免疫原；每毫升福氏完全佐劑混合免疫原含有細菌10億-80億；
B. 3將等體積的混合菌液與等體積的福氏不完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏不完全佐劑牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合免疫原，每毫升福氏不完全佐劑混合免疫原中含有細菌10億-80億；
C.免疫步驟
使用注射器將福氏完全佐劑混合免疫原皮下和肌肉注射給產蛋母雞，每只產蛋母雞注射O. 5ml-3. Oml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐劑混合免疫原O. 5ml_3. Oml 皮下和肌肉注射給產蛋母雞。加強免疫二次后，此后每隔十周再使用福氏不完全佐劑混合免疫原O. 5ml-3. Oml皮下和肌肉注射給產蛋母雞加強免疫五次，前后共免疫八次；
D.抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY提取物的制備
收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母雞雞蛋，使用75%的酒精進行雞蛋表面消毒，打開蛋殼取蛋黃，去除蛋黃膜取蛋黃液，將蛋黃液與蒸餾水按體積比1:10的比例加蒸餾水，充分攪拌，并使用冰醋酸調節酸堿度至PH5. 30-5. 50，然后放置-20°C凍藏3天后取出解凍，取上清液，用凝膠過濾系統將蛋黃液濃縮20倍，用IN NaOH調節PH至7. 0-8. 0， 置-20°C保藏。
E. IgY純化步驟
將抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY提取物加硫酸胺至55%的飽和度，充分攪拌，室溫靜置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，將沉淀使用蒸餾水稀釋到原體積量，再加硫酸胺至33%的飽和度，充分攪拌，室溫靜置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，用蒸餾水稀釋溶解后裝入透析袋，用蒸餾水經中空纖維過濾器除鹽，即得抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體直接純品。
抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑純品經ELISA方法測定，抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY純品中每毫克蛋白中的特異性IgY抗體的效價為1:32000/mg蛋白，或者稱抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY純品中，每毫克蛋白中的特異性IgY抗體的比活性為1:32000。在IgY抗體純品中，IgY抗體的純度經非還原性SDS-PAGE測定為89. 3%。
實施例4
抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑的制備
A.牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌培養步驟
A. I細菌種類牙銀P卜啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)和具核梭桿菌 (Fusobacterium nucleatum)；
A. 2取牙齦卟啉單胞菌(P. g)ATCC33277菌株和具核梭桿菌(Fn)ATCC10953菌株， 分別經BHI-S培養基分離培養和擴增培養的牙齦卟啉單細胞菌、具核梭桿菌，并經鑒定確認為牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌而得到牙齦卟啉單胞菌菌體和菌體碎片、具核梭桿菌菌體和菌體碎片；
B.免疫原制備步驟
B. I取牙齦卟啉單胞菌菌體和菌體碎片10 70重量份，具核梭桿菌菌體和菌體碎片30 90重量份混合成菌液抗原；
B. 2將等體積的菌液抗原與等體積的福氏完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏完全佐劑牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合免疫原；每毫升福氏完全佐劑混合免疫原含有細菌10億-80億；
B. 3將等體積的混合菌液與等體積的福氏不完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏不完全佐劑牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合免疫原，每毫升福氏不完全佐劑混合免疫原中含有細菌10億-80億；
C.免疫步驟
使用注射器將福氏完全佐劑混合免疫原皮下和肌肉注射給產蛋母雞，每只產蛋母雞注射O. 5ml-3. Oml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐劑混合免疫原O. 5ml_3. Oml 皮下和肌肉注射給產蛋母雞。加強免疫二次后，此后每隔十周再使用福氏不完全佐劑混合免疫原O. 5ml-3. Oml皮下和肌肉注射給產蛋母雞加強免疫五次，前后共免疫八次；
D.抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY提取物的制備
收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母雞雞蛋，用75%酒精消毒雞蛋外殼， 打碎蛋殼，留取蛋黃。用去離子水10倍稀釋蛋黃后，用冰醋酸和無水乙酸鈉調節PH至 5. 30-5. 50.，4°C沉降后取上清液，添加2%的殼聚糖和海藻酸鈉，2%氯化鈣和多聚磷酸鈉絮凝沉降，再取上清液用凝膠過濾系統超濾去除多余的去離子水，將蛋黃液濃縮20倍左右， 用IN氫氧化鈉調節PH至7. 0-8. O,置-20°C保藏。
E. IgY純化步驟
將抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY提取物加硫酸胺至55%的飽和度，充分攪拌，室溫靜置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，將沉淀使用蒸餾水稀釋到原體積量，再加硫酸胺至33%的飽和度，充分攪拌，室溫靜置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，用蒸餾水稀釋溶解后裝入透析袋，用蒸餾水經中空纖維過濾器除鹽，即得抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體直接純品。
抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑純品經ELISA方法測定，抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY純品中每毫克蛋白中的特異性IgY抗體的效價為1:32000/mg蛋白，或者稱抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY純品中，每毫克蛋白中的特異性IgY抗體的比活性為1:32000。在IgY抗體純品中，IgY抗體的純度經非還原性SDS-PAGE測定為89. 3%。
實驗例I :
變形鏈球菌、遠緣鏈球菌混合免疫原；牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌混合免疫原按本發明的方法免疫產蛋母雞，取第一次免疫后30天免疫雞蛋，并按本發明的方法制備出抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體的提取物和抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體的提取物，應用ELISA方法測定抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體、抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體結合不同抗原的生物學效價(見表I):
表I抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體的提取物、抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體的提取物的效價
權利要求
1.抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑，其特征在于，由10 70重量份的變形鏈球菌菌體和菌體碎片與30 90重量份的遠緣鏈球菌菌體和菌體碎片混合成抗原免疫廣蛋母雞而制備。
2.權利要求I所述的抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 A.變形鏈球菌和遠緣鏈球菌培養步驟 A. I細菌種類變形鏈球菌(S. mutans)和遠緣鏈球菌(S. sobrinus)； A.2取變形鏈球菌(S. mutans)MT 8148菌株和遠緣鏈球菌(S. sobrinus)6715菌株，分別經BHI-S培養基分離培養和擴增培養的變形鏈球菌、遠緣鏈球菌，并經鑒定確認為變形鏈球菌、遠緣鏈球菌而得到變形鏈球菌菌體和菌體碎片、遠緣鏈球菌菌體和菌體碎片； B.免疫原制備步驟 B. I取變形鏈球菌菌體和菌體碎片10 70重量份，遠緣鏈球菌菌體和菌體碎片30 90重量份混合成菌液抗原； B. 2將等體積的菌液抗原與等體積的福氏完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏完全佐劑變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合免疫原；每毫升福氏完全佐劑混合免疫原含有細菌10億-80億； B.3將等體積的混合菌液與等體積的福氏不完全佐劑混合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏不完全佐劑變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合免疫原，每毫升福氏不完全佐劑混合免疫原中含有細菌10億-80億； C.免疫步驟 使用注射器將福氏完全佐劑混合免疫原皮下和肌肉注射給產蛋母雞，每只產蛋母雞注射O. 5ml-3. Oml免疫原,然后姆隔一周使用福氏不完全佐劑混合免疫原O. 5ml_3. Oml皮下和肌肉注射給產蛋母雞。加強免疫二次后，此后每隔十周再使用福氏不完全佐劑混合免疫原O. 5ml-3. Oml皮下和肌肉注射給產蛋母雞加強免疫五次，前后共免疫八次； D.變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY提取物的制備 收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母雞雞蛋，使用75%的酒精進行雞蛋表面消毒，打開蛋殼取蛋黃，去除蛋黃膜取蛋黃液，將蛋黃液與蒸餾水按體積比1:10的比例加蒸餾水，充分攪拌，并使用冰醋酸調節酸堿度至PH5. 30-5. 50，然后放置_20°C凍藏3天后取出解凍，取上清液，用凝膠過濾系統將蛋黃液濃縮20倍，用IN NaOH調節PH至7. 0-8. 0，置-20°C保藏。
3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，在所述步驟D后増加一IgY純化步驟，具體是將變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY提取物加硫酸胺至55%的飽和度，充分攪拌，室溫靜置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，將沉淀使用蒸餾水稀釋到原體積量，再加硫酸胺至33%的飽和度，充分攪拌，室溫靜置2小時，然后高速離心10分鐘，取沉淀，用蒸餾水稀釋溶解后裝入透析袋，用蒸餾水經中空纖維過濾器除鹽，即得抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑純品。
4.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟D用以下方法所取代收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母雞雞蛋，用75%酒精消毒雞蛋外殼，打碎蛋殼，留取蛋黃。用去離子水10倍稀釋蛋黃后，用冰醋酸和無水こ酸鈉調節PH至5. 30-5. 50.，4°C沉降后取上清液，添加2%的殼聚糖和海藻酸鈉，2%氯化鈣和多聚磷酸鈉絮凝沉降，再取上清液用凝膠過濾系統超濾去除多余的去離子水，將蛋黃液濃縮20倍左右，用IN氫氧化鈉調節PH至.7. 0-8. 0，置-20°C保藏。
5.含有抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑、抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑的用于預防齲齒和牙齦炎及其口臭的牙膏，包含有由抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑、抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑構成的抗致病菌制劑，所述抗致病菌制劑由占牙膏總質量的質量百分比原料組成 抗牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌混合特異性IgY抗體和抗變形鏈球菌、遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體按1:1質量比混合后的制劑O. 1-3. 0%、洗必泰O. 01-2. 0%、甘油.I.0-30. 0%、聚こ烯吡咯烷酮O. 1-2. 0%，其中洗必泰、甘油、聚こ烯吡咯烷酮構成抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑、抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑的保護劑。
6.如權利要求5所述的牙膏，其特征在于，還包含牙膏膏劑，所述牙膏膏劑由占牙膏總質量的質量百分比原料組成卡波浦爾O. I O. 5%、羧甲基纖維素鈉O. 5 I. 3%、卡拉膠.O. 2 O. 5%,黃原膠O. 3 O. 7%,甘油5. O 20. 0%,山梨醇5. O 70. 0%,阿斯巴甜O. I .O. 5% ;糖精鈉O. I O. 3%, PEG-6000. 5 5. 0%, PEG-12000. 5 5. 0%，椰油酰胺丙基甜菜堿.O. 1-2. 0%,香精O. 8 2. 0%, SiO2L O 30%,去離子水余量。
全文摘要
本發明公開的抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑，其特征在于，由10～70重量份的變形鏈球菌菌體和菌體碎片與30～90重量份的遠緣鏈球菌菌體和菌體碎片混合成抗原免疫產蛋母雞而制備。本發明還公開了該抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑的制備方法以及含有抗變形鏈球菌和遠緣鏈球菌混合特異性IgY抗體制劑、抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌混合特異性IgY抗體制劑的用于預防齲齒和牙齦炎及其口臭的牙膏。本發明用于預防齲齒、牙齦炎和牙周炎及其口臭的牙膏對預防齲齒、牙齦炎和牙周炎及其口臭病菌具有明顯的效果。
文檔編號C07K16/12GK102973939SQ201210398690
公開日2013年3月20日 申請日期2012年10月18日 優先權日2012年10月18日
發明者陳健芬, 羅鑫龍, 孫曉青, 張萍 申請人:上海美加凈日化有限公司