專利名稱：一種烏拉貝寧的提取純化方法
技術領域：
本發明屬于天然藥物提取技術領域，涉及一種烏拉貝寧的提取純化方法。
背景技術：
烏拉貝寧(Uralenin)，又名愛斯形刺桐素B，分子式為C2tlH2tlO6，分子量為356. 37，mp. 217-218°C,主要存在于豆科植物愛斯形刺桐sigmoidea Hua的莖皮.、甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的地上部分及葉中，其中甘草葉中含量最高。藥理研究表明，烏拉貝寧具有較強的抗格蘭陽性菌作用，對金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的抑菌濃度為50ppm ;在固體培養基中對環狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等的抑菌作用比Sigmoidin A強，在液體培養基的抑制作用比Sigmoidin A弱。另外，烏拉貝寧還具有抗氧活性，可抑制巨噬細胞超氧化物的產生。 現有技術中，尚沒有適用于高純度烏拉貝寧工業化大生產的制備工藝報道。
發明內容
本發明的目的在于提供一種烏拉貝寧的提取純化方法，這種方法不僅避免了大量有毒試劑的使用，提高了烏拉貝寧的提取率，而且成本低、方法簡便經濟。本發明的技術方案是
1)以甘草葉為原料，粉碎，加入萃取釜，采用超臨界CO2萃取，以丙酮為夾帶劑，萃取2-5小時，解析萃取液回收試劑，得萃取物；
2)將萃取物按比例加入硫酸銨和乙醇雙水相系統，加熱混合均勻，分為上、下兩相，力口下相降溫、結晶回收硫酸銨晶體，取上相加乙酸乙酯、水和氯化鈉，混合均勻，取含有烏拉貝寧的上相，減壓濃縮；
3)將濃縮浸膏加入聚酰胺樹脂柱，乙醇水溶液洗脫，脫色、重結晶得烏拉貝寧。步驟I)中所述夾帶劑為體積百分比65-80%的丙酮水溶液，加入量為藥材量的I5-28%ο步驟I)中所述超臨界CO2萃取過程中，設定萃取釜壓力為24_36MPa，溫度為46-60°C，分離釜壓力為5-9MPa，溫度為30-45°C。步驟2)中所述濃縮液與乙醇體積比為(6 9): I，加入的乙醇質量分數為18-26%，加入的硫酸銨質量分數為10-22% ;分相溫度為30-50°C，靜置時間為4-8小時。步驟2)中所述乙酸乙酯反萃取中，分相溫度為20_30°C，靜置時間為2-4小時。步驟3)中所述聚酰胺樹脂為100-200目，用量是藥材量的l/3-l/2(V/W)，用3-8BV體積百分比為65-85%的乙醇水溶液洗脫。步驟3)中所述重結晶前用活性炭脫色，所述活性炭與烏拉貝寧的質量比為5:1-10:1，所述重結晶溶劑為體積百分比為20-30%的乙醇水溶液，于(TC-4°C條件下析晶。本發明的有益效果在于本發明采用超臨界CO2萃取烏拉貝寧，具有萃取率高、高效無污染等特點；采用雙水相萃取條件溫和、操作安全、乙醇和硫酸銨易回收重復利用，不會造成污染；結晶前采用活性炭脫色，以除去產品中的雜質，提高產品純度，增加產品穩定性，避免產生副作用等。
具體實施例方式 實施例I:
將甘草葉粉碎，取5kg粗粉投入萃取釜中，加熱萃取釜至50 V、解析釜達到32 °C，通入CO2,流量為20L/h，打開加壓泵升高萃取釜壓力至29MPa、解析釜壓力至9MPa，關閉CO2鋼瓶閥門。打開循環，加入80%的丙酮作為夾帶劑(加入量為藥材量的15%)至夾帶劑儲罐中，打開夾帶劑高壓泵閥門，使夾帶劑泵入萃 取釜，保持恒壓、恒溫萃取2. 5h，收集從解析釜放出的萃取物，加入硫酸銨和乙醇雙水相系統，濃縮液與乙醇體積比為9 :1，加入的乙醇質量分數為18%，加入的硫酸銨質量分數為22%，加熱混合均勻，在30°C條件下放置4h，靜置，分為上、下兩相，取下相降溫、結晶回收硫酸銨晶體，取上相加乙酸乙酯、水和氯化鈉，其中乙酸乙酯的質量分數為25%，氯化鈉的質量分數為10%，余量為水，混合均勻，系統在20°C下靜置2h，分相，取含有烏拉貝寧的上相，減壓濃縮得浸膏，將濃縮浸膏加入聚酰胺樹脂柱，用6BV70%乙醇溶液洗脫，收集含有烏拉貝寧的流分，洗脫液加入IOg藥用活性炭煮沸10分鐘，趁熱過濾，濾液冷卻至4°C靜置，析晶，用20%乙醇溶液重結晶，干燥即得得產品，經HPLC檢測，其純度為96. 7%。實施例2
將甘草葉粉碎，取5kg粗粉投入萃取釜中，加熱萃取釜至54°C、解析釜達到43°C，通入CO2,流量為20L/h，打開加壓泵升高萃取釜壓力至32MPa、解析釜壓力至8MPa，關閉CO2鋼瓶閥門。打開循環，加入80%的丙酮作為夾帶劑(加入量為藥材量的28%)至夾帶劑儲罐中，打開夾帶劑高壓泵閥門，使夾帶劑泵入萃取釜，保持恒壓、恒溫萃取4. 5h，收集從解析釜放出的萃取物，加入硫酸銨和乙醇雙水相系統，濃縮液與乙醇體積比為6 :1，加入的乙醇質量分數為20%，加入的硫酸銨質量分數為18%，加熱混合均勻，在40°C條件下放置6h，靜置，分為上、下兩相，取下相降溫、結晶回收硫酸銨晶體，取上相加乙酸乙酯、水和氯化鈉，其中乙酸乙酯的質量分數為25%，氯化鈉的質量分數為10%，余量為水，混合均勻，系統在22°C下靜置4h，分相，取含有烏拉貝寧的上相，減壓濃縮得浸膏，將濃縮浸膏加入聚酰胺樹脂柱，用5BV75%乙醇溶液洗脫，收集含有烏拉貝寧的流分，洗脫液加入8g藥用活性炭煮沸10分鐘，趁熱過濾，濾液冷卻至2°C靜置，析晶，用30%乙醇溶液重結晶，干燥即得得產品，經HPLC檢測，其純度為98. 4%。實施例3:
將甘草葉粉碎，取5kg粗粉投入萃取釜中，加熱萃取釜至52°C、解析釜達到40°C，通入CO2,流量為20L/h，打開加壓泵升高萃取釜壓力至36MPa、解析釜壓力至6MPa，關閉CO2鋼瓶閥門。打開循環，加入75%的丙酮作為夾帶劑(加入量為藥材量的20%)至夾帶劑儲罐中，打開夾帶劑高壓泵閥門，使夾帶劑泵入萃取釜，保持恒壓、恒溫萃取3h，收集從解析釜放出的萃取物，加入硫酸銨和乙醇雙水相系統，濃縮液與乙醇體積比為7 :1，加入的乙醇質量分數為22%,加入的硫酸銨質量分數為14%,加熱混合均勻,在35°C條件下放置7h,靜置,分為上、下兩相，取下相降溫、結晶回收硫酸銨晶體，取上相加乙酸乙酯、水和氯化鈉，其中乙酸乙酯的質量分數為25%，氯化鈉的質量分數為10%，余量為水，混合均勻，系統在27°C下靜置4h，分相，取含有烏拉貝寧的上相，減壓濃縮得浸膏，將濃縮浸膏加入聚酰胺樹脂柱，用8BV85%乙醇溶液洗脫，收集含有烏拉貝寧的流分，洗脫液加入6g藥用活性炭煮沸10分鐘，趁熱過濾，濾液冷卻至(TC靜置，析晶，用25%乙醇溶液重結晶，干燥即得得產品，經HPLC檢測，其純度為98. 2%ο實施例4:
將甘草葉粉碎，取5kg粗粉投入萃取釜中，加熱萃取釜至55 °C、解析釜達到35 °C，通入CO2,流量為20L/h，打開加壓泵升高萃取釜壓力至34MPa、解析釜壓力至5MPa，關閉CO2鋼瓶閥門。打開循環，加入70%的丙酮作為夾帶劑(加入量為藥材量的25%)至夾帶劑儲罐中，打開夾帶劑高壓泵閥門，使夾帶劑泵入萃取釜，保持恒壓、恒溫萃取5h，收集從解析釜放出的萃取物，加入硫酸銨和乙醇雙水相系統，濃縮液與乙醇體積比為8 :1，加入的乙醇質量分數為25%,加入的硫酸銨質量分數為16%,加熱混合均勻,在45°C條件下放置4h,靜置,分為上、下兩相，取下相降溫、結晶回收硫酸銨晶體，取上相加乙酸乙酯、水和氯化鈉，其中乙酸乙酯的質量分數為25%，氯化鈉的質量分數為10%，余量為水，混合均勻，系統在20°C下靜置4h，分相，取含有烏拉貝寧的上相，減壓濃縮得浸膏，將濃縮浸膏加入聚酰胺樹脂柱，用3BV65%乙醇溶液洗脫，收集含有烏拉貝寧的流分，洗脫液加入12g藥用活性炭煮沸10分鐘，趁熱過·濾，濾液冷卻至4°C靜置，析晶，用30%乙醇溶液重結晶，干燥即得得產品，經HPLC檢測，其純度為96. 4%ο實施例5:
將甘草葉粉碎，取5kg粗粉投入萃取釜中，加熱萃取釜至60 V、解析釜達到30 V，通入CO2,流量為20L/h，打開加壓泵升高萃取釜壓力至24MPa、解析釜壓力至5MPa，關閉CO2鋼瓶閥門。打開循環，加入65%的丙酮作為夾帶劑(加入量為藥材量的15%)至夾帶劑儲罐中，打開夾帶劑高壓泵閥門，使夾帶劑泵入萃取釜，保持恒壓、恒溫萃取4h，收集從解析釜放出的萃取物，加入硫酸銨和乙醇雙水相系統，濃縮液與乙醇體積比為9 :1，加入的乙醇質量分數為26%,加入的硫酸銨質量分數為10%,加熱混合均勻,在50°C條件下放置7h,靜置,分為上、下兩相，取下相降溫、結晶回收硫酸銨晶體，取上相加乙酸乙酯、水和氯化鈉，其中乙酸乙酯的質量分數為25%，氯化鈉的質量分數為10%，余量為水，混合均勻，系統在24°C下靜置3h，分相，取含有烏拉貝寧的上相，減壓濃縮得浸膏，將濃縮浸膏加入聚酰胺樹脂柱，用8BV65%乙醇溶液洗脫，收集含有烏拉貝寧的流分，洗脫液加入9g藥用活性炭煮沸10分鐘，趁熱過濾，濾液冷卻至4°C靜置，析晶，用25%乙醇溶液重結晶，干燥即得得產品，經HPLC檢測，其純度為97. 3%ο實施例6:
將甘草葉粉碎，取5kg粗粉投入萃取釜中，加熱萃取釜至46°C、解析釜達到45°C，通入CO2,流量為20L/h，打開加壓泵升高萃取釜壓力至26MPa、解析釜壓力至9MPa，關閉CO2鋼瓶閥門。打開循環，加入65%的丙酮作為夾帶劑(加入量為藥材量的28%)至夾帶劑儲罐中，打開夾帶劑高壓泵閥門，使夾帶劑泵入萃取釜，保持恒壓、恒溫萃取3. 5h，收集從解析釜放出的萃取物，加入硫酸銨和乙醇雙水相系統，濃縮液與乙醇體積比為7 :1，加入的乙醇質量分數為24%，加入的硫酸銨質量分數為12%，加熱混合均勻，在30°C條件下放置8h，靜置，分為上、下兩相，取下相降溫、結晶回收硫酸銨晶體，取上相加乙酸乙酯、水和氯化鈉，其中乙酸乙酯的質量分數為25%，氯化鈉的質量分數為10%，余量為水，混合均勻，系統在30°C下靜置2h，分相，取含有烏拉貝寧的上相，減壓濃縮得浸膏，將濃縮浸膏加入聚酰胺樹脂柱，用4BV70%乙醇溶液洗脫，收集含有烏拉貝寧的流分，洗脫液加入7g藥用活性炭煮沸10分鐘，趁熱過濾，濾液冷卻至2°C靜置，析晶，用20%乙醇溶液重結晶，干燥即得得產品，經HPLC檢測，其純度為97. 7%。實施例7:
將甘草葉粉碎，取5kg粗粉投入萃取釜中，加熱萃取釜至52 °C、解析釜達到38 V，通入CO2,流量為20L/h，打開加壓泵升高萃取釜壓力至30MPa、解析釜壓力至6MPa，關閉CO2鋼瓶閥門。打開循環，加入80%的丙酮作為夾帶劑(加入量為藥材量的22%)至夾帶劑儲罐中，打開夾帶劑高壓泵閥門，使夾帶劑泵入萃取釜，保持恒壓、恒溫萃取2h，收集從解析釜放出的萃取物，加入硫酸銨和乙醇雙水相系統，濃縮液與乙醇體積比為6 :1，加入的乙醇質量分數為26%,加入的硫酸銨質量分數為22%,加熱混合均勻,在48°C條件下放置6h,靜置,分為上、 下兩相，取下相降溫、結晶回收硫酸銨晶體，取上相加乙酸乙酯、水和氯化鈉，其中乙酸乙酯的質量分數為25%，氯化鈉的質量分數為10%，余量為水，混合均勻，系統在28°C下靜置3h，分相，取含有烏拉貝寧的上相，減壓濃縮得浸膏，將濃縮浸膏加入聚酰胺樹脂柱，用5BV80%乙醇溶液洗脫，收集含有烏拉貝寧的流分，洗脫液加入12g藥用活性炭煮沸10分鐘，趁熱過濾，濾液冷卻至4°C靜置，析晶，用30%乙醇溶液重結晶，干燥即得得產品，經HPLC檢測，其純度為98. 8%ο實施例8
將甘草葉粉碎，取5kg粗粉投入萃取釜中，加熱萃取釜至48°C、解析釜達到41°C，通入CO2,流量為20L/h，打開加壓泵升高萃取釜壓力至35MPa、解析釜壓力至7MPa，關閉CO2鋼瓶閥門。打開循環，加入70%的丙酮作為夾帶劑(加入量為藥材量的18%)至夾帶劑儲罐中，打開夾帶劑高壓泵閥門，使夾帶劑泵入萃取釜，保持恒壓、恒溫萃取5h，收集從解析釜放出的萃取物，加入硫酸銨和乙醇雙水相系統，濃縮液與乙醇體積比為8 :1，加入的乙醇質量分數為18%,加入的硫酸銨質量分數為10%,加熱混合均勻,在42°C條件下放置5h,靜置,分為上、下兩相，取下相降溫、結晶回收硫酸銨晶體，取上相加乙酸乙酯、水和氯化鈉，其中乙酸乙酯的質量分數為25%，氯化鈉的質量分數為10%，余量為水，混合均勻，系統在30°C下靜置4h，分相，取含有烏拉貝寧的上相，減壓濃縮得浸膏，將濃縮浸膏加入聚酰胺樹脂柱，用3BV85%乙醇溶液洗脫，收集含有烏拉貝寧的流分，洗脫液加入6. 5g藥用活性炭煮沸10分鐘，趁熱過濾，濾液冷卻至(TC靜置，析晶，用25%乙醇溶液重結晶，干燥即得得產品，經HPLC檢測，其純度為98. 5%。
權利要求
1.一種烏拉貝寧的提取純化方法，其特征在于包括以下步驟 1)以甘草葉為原料，粉碎，加入萃取釜，采用超臨界CO2萃取，以丙酮為夾帶劑，萃取2-5小時，解析萃取液回收試劑，得萃取物； 2)將萃取物按比例加入硫酸銨和乙醇雙水相系統，加熱混合均勻，分為上、下兩相，力口下相降溫、結晶回收硫酸銨晶體，取上相加乙酸乙酯、水和氯化鈉，混合均勻，取含有烏拉貝寧的上相，減壓濃縮； 3)將濃縮浸膏加入聚酰胺樹脂柱，乙醇水溶液洗脫，脫色、重結晶得烏拉貝寧。
2.根據權利要求I所述的提取純化方法，其特征在于步驟I)中所述夾帶劑為體積百分比65-80%的丙酮水溶液，加入量為藥材量的15-28%。
3.根據權利要求I所述的提取純化方法，其特征在于步驟I)中所述超臨界CO2萃取過程中，設定萃取釜壓力為24-36MPa，溫度為46_60°C，分離釜壓力為5_9MPa，溫度為30-45。。。
4.根據權利要求I所述的提取純化方法，其特征在于步驟2)中所述濃縮液與乙醇體積比為(6 9) :1，加入的乙醇質量分數為18-26%，加入的硫酸銨質量分數為10-22% ;分相溫度為30-50°C，靜置時間為4-8小時。
5.根據權利要求I所述的提取純化方法，其特征在于步驟2)中所述乙酸乙酯反萃取中，分相溫度為20-30°C，靜置時間為2-4小時。
6.根據權利要求I所述的提取純化方法，其特征在于步驟3)中所述聚酰胺樹脂為100-200目，用量是藥材量的1/3-1/2 (V/W)，用3-8BV體積百分比為65-85%的乙醇水溶液洗脫。
7.根據權利要求I所述的提取純化方法，其特征在于步驟3)中所述重結晶前用活性炭脫色，所述活性炭與烏拉貝寧的質量比為5:1-10:1，所述重結晶溶劑為體積百分比為20-30%的乙醇水溶液，于(TC _4°C條件下析晶。
全文摘要
本發明涉及一種烏拉貝寧的提取純化方法，方法步驟為1)以甘草葉為原料，粉碎，加入萃取釜，采用超臨界CO2萃取，以丙酮為夾帶劑，萃取2-5小時，解析萃取液回收試劑，得萃取物；2)將萃取物加入硫酸銨和乙醇雙水相系統萃取，取上相加乙酸乙酯、水和氯化鈉反萃取，將含有烏拉貝寧的上相減壓濃縮得濃縮浸膏；3)將濃縮浸膏加入聚酰胺樹脂柱，乙醇水溶液洗脫，脫色、重結晶得烏拉貝寧。本發明方法具有提取率高、成本低、環境污染小等優點。
文檔編號C07D311/32GK102850315SQ20121036313
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月26日 優先權日2012年9月26日
發明者蘇劉花 申請人:南京澤朗農業發展有限公司