專利名稱：一種源于禽流感病毒自然弱毒株的血凝素和免疫抗原的制作方法
技術領域：
本發明涉及動物疫病預防控制，尤其涉及一種用禽流感病毒自然弱毒株制備的血凝素和免疫抗原。
背景技術：
禽流感(Avian influenza, Al)是由A型流感病毒引起的禽類(包括家禽和野禽)的感染和/或感染綜合征。雞、火雞、鴨、鵝和鵪鶉等家禽、野鳥、水禽和海鳥等均可感染。其疾病形式多樣，可表現為無致病性感染，低致病性感染和高致病性禽流感(Highlypathogenic avian inf luenza, HPAI )。爆發HPAI不僅使當地的養禽業遭受毀滅性打擊,而且顯著地影響禽類產品的國際貿易，世界動物衛生組織(OIE)將其列為必須報告疫病，我國將其列為一類動物疫病。Al的病原為禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)，AIV的亞型眾多，其中按 血凝素(Haemagglutinin，HA)劃分為16種(Hl H16)亞型，歷史上所有的高致病性禽流感均是由H5和H7亞型AIV引起的。H5和H7亞型AIV除了對養禽業有重要意義之外，它們還有重要的公共衛生意義，H5和H7亞型AIV均有感染并致死人類的報道。到目前為止，我國已分離鑒定的高致病性禽流感病毒均為H5亞型病毒，所以此前的研究集中于H5亞型禽流感病毒及其免疫抗原，用于制造H5亞型禽流感疫苗或診斷試劑。發明人在國內首次分離到H7亞型禽流感病毒(CNl株)，并進行了一系列研究。發明人在研究中發現，該病毒具有致病力很低的特征，后來又經過多次傳代培養，使該病毒更加適應雞胚培養條件，獲得病毒的滴度很高，而病毒致病力仍然很低。將此培養物經過一定工藝滅活，仍能保留血凝素活性；研制成免疫抗原，接種雞可以產生很好的抗體滴度，抗體能維持6個月以上。因此，這種用H7亞型禽流感病毒自然弱毒株來制造的血凝素和免疫抗原，對于防控H7亞型禽流感具有重要意義，并且這項技術在國內未見報道。國內現有H7亞型禽流感病毒血凝素及免疫抗原,是用1979年獲得的國際標準毒株A/Afri. Star/Eng-Q/983/79/(H7Nl)研制的，存在以下技術缺陷1、禽流感眾所周知的特性是病毒變異性高，即使同一種亞型的不同來源毒株，其抗原性也存在一定差異。用1979年的標準毒株制備的血凝素，用來作血凝抑制實驗、檢測臨床血清時，會出現滴度偏低、敏感度下降的問題；2、用標準毒株制成免疫抗原或疫苗來免疫動物，由于標準毒株抗原性與國內流行株抗原性存在差異，會導致保護效果下降。
發明內容
本發明所解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種用國內分離的禽流感病毒自然弱毒株(A/CK/CN/1/2002 (H7N2)，簡稱CNl株)制備的血凝素和免疫抗原。CNl株保藏信息如下分類命名禽流感病毒拉丁文學名Avianinfluenza virus, AIV
保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)地址北京市朝陽區北辰西路I號院，中國科學院微生物研究所保藏日期2012年9月19日保藏編號CGMCCNo. 6602。本發明是通過以下技術途徑實現的本發明人從我國雞群中分離到的H7N2亞型禽流感病毒株(保藏編號=CGMCCNo. 6602)，在雞胚中連續傳代培養，再通過有限稀釋法純化病毒，然后測定病毒血凝素效價；進行本動物接種試驗，評價病毒的致病性；用病毒培養物制成滅活的血凝素；用病毒培養物制成礦物油佐劑免疫抗原，接種雞以后定期測定抗體水平。通過測定CNl株HA、NA和M基因，確定這種血凝素與免疫抗原的分子識別標志。 具體方法為1、病毒分離培養將雞群禽流感監測過程中采集的樣品，過濾除菌后，接種10日齡SPF雞胚尿囊腔，在37°C繼續孵育。72小時左右雞胚死亡，收集尿囊液，用同樣方法作傳代培養。按GB/T18936-2003規定方法，用1%雞紅細胞測定分離物的血球凝集活性。2、病毒鑒定對于具有血球凝集活性的培養物，按照《禽流感》(第一版，北京農業大學出版社，1995)介紹的方法，鑒定病毒血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)亞型；3、病毒純化將收獲的病毒液進行10倍比的系列稀釋，接種10日齡雞胚培養，72小時左右，選擇最高稀釋度的死亡雞胚，測定血凝活性，再次進行10倍比的系列稀釋后按同樣方法傳代培養，共傳5代，獲得純化的病毒；4、致病性試驗按照《禽流感》(第一版)介紹的方法，將純化的病毒接種SPF雞，測定“靜脈接種致病指數(IVPI)”;5、制備血凝素將純化的CNl株加入終濃度I :5000的β-丙內酯，4°C滅活10小時，測定血凝素效價，按常規方法凍結或凍干保存，用作血凝素；6、將純化的CNl株按前述方法用β -丙內酯滅活，測定血凝素效價，加礦物油佐劑按常規方法乳化，制成免疫抗原；7、將制成的免疫抗原接種6周齡SPF雞，定期采集血清，用血凝抑制實驗測定抗體水平，實驗中采用的是上述CNl株血凝素。8、測定病毒的基因序列參照國內外已發表的禽流感病毒ΗΑ、ΝΑ和M基因節段的序列，設計針對ΗΑ、ΝΑ和M基因節段的擴增引物和反轉錄引物，按常規方法進行克隆測序，得到CNl病毒株ΗΑ、ΝΑ和M基因片段的核苷酸序列。血凝素效價測定表明，CNl株制備的血凝素效價達到1024，具有較高的效價，因此可以用于制備血凝素試劑和免疫抗原。致病性試驗表明，CNl病毒接種SPF雞后10天，未觀察到明顯癥狀。靜脈接種指數(IVPI)為0，無致病性，說明病毒傳5代后毒力沒有增強，是難得的Η7亞型自然弱毒株，滅活后用于制造血凝素和免疫抗原是很安全的，具有實際應用價值。免疫原性試驗表明，CNl株制備的免疫抗原接種SPF雞以后I周(1WPI)，即可檢出針對Η7亞型AIV的HI抗體，接種后第5-8周為抗體水平高峰期，其后緩慢下降，直至第28周仍可檢出抗體(HI效價高于16)。病毒的HA基因序列見SEQ ID NO :1 ;ΝΑ基因序列見SEQ ID Ν0:2;Μ基因序列見SEQ ID NO 3ο
具體實施例方式實施實例I
病毒分離鑒定從雞場采集樣品，經過濾除菌后，接種10日齡SPF雞胚尿囊腔，在37°C繼續孵育。72小時左右雞胚死亡，收集尿囊液，用同樣方法作傳代培養。按《禽流感》(第一版)的方法，用1%雞紅細胞測定分離物的血球凝集活性。按《禽流感》(第一版)介紹的方法，用紅細胞凝集抑制(HI)試驗確定病毒的血凝素亞型。按《禽流感》(第一版)介紹的神經氨酸酶(NA)活性抑制(NI)實驗方法，測定病毒NA亞型。結果雞胚在接種CNl株后72小時左右死亡，胚體充血。初代尿囊液血凝價為256，經多次傳代后，尿囊液的血凝價為1024。病毒被鑒定為H7N2亞型禽流感病毒。實施實例2
病毒的致病性測定按《禽流感》(第一版)介紹的方法進行。將14只SPF雞隨機分二組，在兩個負壓隔離器中飼養，各組分別為10只和4只。經檢驗無菌的CNl株雞胚尿囊液，對1%雞紅血球凝集效價為1024，用生理鹽水作I :10稀釋，接種一組雞10只，每只雞經翅靜脈注射O. Iml,另外四只雞注射生理鹽水作為對照。每天觀察并記錄雞群情況，至接種后10天，計算靜脈接種致病指數(IVPI)。結果IVPI值為O。病毒對實驗雞無致病性，是自然弱毒株。可用于研制血凝素和免疫抗原，生產和使用過程可以保證安全，因此具有實際應用價值。將CNl病毒保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 6602。實施實例3血凝素制備及效價測定將純化的CNl株加入終濃度I :5000的β _丙內酯，4 °C滅活10小時，按GB/T18936-2003規定方法，用1%雞紅細胞測定分離物的血球凝集活性，分裝后凍結保存，用作
血凝素。結果滅活病毒制備的血凝素效價為1024。實施實例4免疫抗原制備及接種動物產生抗體的測定將CNl株病毒液，加入終濃度為I :5000的β -丙內酯，4°C滅活10小時，測定血凝素效價，加礦物油佐劑按常規方法乳化，制成免疫抗原，接種6周齡SPF雞8只，每周采集少量血清一次，按GB/T18936-2003規定方法，用上述CNl株血凝素來做血凝抑制實驗，測定血清抗體水平。結果以血清抗體HI效價高于16為檢測陽性的判界，CNl株制備的免疫抗原接種SPF雞以后I周，即可檢出針對H7亞型AIV的血清抗體，接種后第5-8周為抗體水平高峰期，其后緩慢下降，直至第28周仍可檢出抗體，之后出現了部分雞的抗體水平低于16的情況。這說明，用CNl株制備免疫抗原，接種雞產生的抗體可以維持半年以上，具有較好的免疫原性。實施實例5病毒基因序列測定參照國內外已發表的禽流感病毒HA、NA、M基因節段的核苷酸序列，設計針對HA、NA、M基因節段的擴增引物(見表I)和反轉錄通用引物5^ AGCAAAAGCAGG-3 ;(SEQ ID NO 4)(參考文獻E. Hoffmann, J. Stech, Y. Guan, et al. Universal primerset for the full-length amplifiction of all influenza A viruses.Archives ofVirology, 2001, 146:2275-2289.)。提取病毒總 RNA，反轉錄(RT)合成 CDNA，經 PCR 擴增后，凝膠電泳回收各基因節段的PCR產物，分別與pGEM-T Easy載體連接成pGEM_TE_X (“x”代表HA、NA、M基因)，構建重組質粒轉化感受態細胞，挑選PCR陽性的克隆，測定核苷酸序列。表I針對各基因節段的PCR引物
權利要求
1.一種源于禽流感病毒自然弱毒株的血凝素和免疫抗原，其特征在于所述的禽流感病毒自然弱毒株為CNl株。其中所述的CNl病毒株為保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)Jia :北京市朝陽區北辰西路I號院，中國科學院微生物研究所，保藏編號CGMCC No. 6602。
2.權利要求I中所述CNl株的識別特征是同時包含有核苷酸序列為SEQID NO =USEQID NO 2和SEQ ID NO 3的3個基因節段。
3.根據權利要求I所述的免疫抗原，其中還包括藥劑學上可以接受的稀釋劑、賦形劑或免疫佐劑。
4.根據權利要求I所述的血凝素和免疫抗原的制備方法，包括將CNl株接種雞胚培養，收獲病毒液加入終濃度I :5000的P -丙內酯，4°C滅活10小時，用作血凝素；加礦物油等佐劑按常規方法乳化，制成免疫抗原。
5.根據權利要求I所述的血凝素在檢測血清抗體中的用途。
6.根據權利要求I一 3任一項所述的免疫抗原在接種動物用于產生免疫抗體中的用途。
全文摘要
本申請涉及一種來源于禽流感病毒自然弱毒株(CN1株)的血凝素和免疫抗原及其制備方法，以及血凝素在檢測血清抗體中的用途、免疫抗原在接種動物用于產生免疫抗體中的用途。
文檔編號C07K16/10GK102830225SQ20121035823
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月24日 優先權日2012年9月24日
發明者王傳彬, 孫明, 曹振, 田克恭, 王宏偉, 金萍, 陳西釗, 劉偉, 才學鵬 申請人:中國動物疫病預防控制中心