專利名稱：一種乳清蛋白降膽固醇肽及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種乳清蛋白降膽固醇肽及其制備方法，屬于生物技術領域，涉及的是一種乳清蛋白降膽固醇肽的制備方法以及分離純化技術。
背景技術：
隨著人們生活的日益改善，各種富貴病呈現遞增趨勢，就膽固醇而言，高膽固醇是對人類健康危害極大的一種慢性疾病，醫藥業人工合成的藥物可能會產生某些副作用，而從蛋白酶解液中提取的降膽固醇肽安全性極高，無毒副作用。其優勢在于對于膽固醇值正常的人，沒有降低膽固醇的作用，而對于膽固醇值高的人具有降低膽固醇的作用；對膽固醇值正常的人，在食用高膽固醇含量的蛋、肉、動物內臟等食品時，也有防止血清膽固醇值升高的作用；在總膽固醇中，乳清蛋白源降膽固醇肽所降低的膽固醇是對人體有害的低密度脂蛋白(LDL)和極低密度脂蛋白(VLDL)，它不降低對人體有益的高密度脂蛋白(HDL)的數 值，除降膽固醇功能外，往往同時具有免疫促進、抗凝血、易消化吸收、抗腫瘤的功能，而且這種肽是經食用級酶在溫和條件下獲得的，易作為功能因子添加到各類食品中，有著良好的市場前景。Nagaoka. S通過小鼠動物實驗表明，牛乳清蛋白源生物活性肽比大豆蛋白或酪蛋白具有更強的降低血液膽固醇的活性，并從乳球蛋白的胰蛋白酶酶解液中成功地分離出一種五肽IIAGL F(71-75),據目前已有的相關文獻可知，乳清蛋白降膽固醇肽的分子量主要集中在2000u左右。本發明采用胰蛋白酶水解，利用其專一性切割特點，尤其對精氨酸、賴氨酸的羧基端肽鍵有強切割專一性來定點酶解乳清蛋白，制備乳清蛋白水解液，據模擬人體胃腸道試驗研究表明胰蛋白酶較其他酶類的水解產物在人體中的穩定性更強。并采用了多級色譜對水解液進行分離純化，比以往的單一分離得到的多肽純度和抑制率更高。
發明內容
本發明的目的是提供一種乳清蛋白降膽固醇肽的制備方法。本發明所使用的乳清蛋白粉是脫鹽乳清粉，其蛋白質含量不少于12. 7%，灰分低于
5.6%，乳糖含量為總干物質的80%左右。本發明制備乳清蛋白降膽固醇肽的方法，其步驟如下
(1)用胰蛋白酶水解乳清蛋白粉；
(2)水解液(多肽)離心，取上清液，冷凍干燥，得到粗多肽；
(3)將水解液(多肽)經離子交換樹脂脫鹽處理，進而純化精制；
(4)用凝膠過濾色譜(S^)HadexG-15)對水解的肽進行分離純化；
(5)使用反相高效液相色譜(RP-HPLC)對步驟(4)中得到的HMG-CoA還原酶抑制率高的洗脫組分進行進一步分離純化。所述步驟(I)中，乳清蛋白粉以脫鹽乳清蛋白粉為原料，按照底物質量濃度5%將其水化，65°C水浴加熱20 min，使乳清蛋白變性，冷卻至40°C，調至pH為8. 0，E/S (酶與底物比)為0. 06，水解時間為6h。所述步驟(2)中，酶解結束后加入適量HCl調制pH=4. 6左右，使未水解的蛋白質沉淀，90°C保持10分鐘滅酶活，然后冷卻至室溫在4500r/min離心，取上清液，冷凍干燥得多肽粗制品。所述步驟(3)中，取(2)的冷凍干燥的粗肽配成50mg/mL的多肽溶液，用離子交換樹脂進行脫鹽，在流速為45ml/h條件下，乳清蛋白水解液總的氮回收率為80%以上，脫鹽率為80%以上，并且脫鹽前后HMG-CoA還原酶的抑制率無影響。所述步驟(4)中，將水解的多肽溶液利用SepHadex G-15進行降膽固醇肽的分離，洗脫液0. Olmol/LHCl溶液，流速65ml/h，檢測波長220nm，上樣量450mg，得到吸收組分峰，通過測HMG-CoA還原酶的抑制率，收集抑制率高的組分。 所述步驟(5)中，取(4)中抑制率較高的組分用反相高效液相色譜(RP -HPLC)進一步進行分離純化，色譜柱C18色譜柱，緩沖液0. 15%三氟乙酸溶液，檢測波長220-280nm，洗脫方式梯度洗脫，流速lml/h，收集HMG-CoA還原酶抑制率高組分的洗脫峰，進行冷凍干燥，得粉末狀乳清蛋白降膽固醇肽。本發明所具有的優點
(1)所選原料本身已為脫鹽乳清粉，使后續的離子交換樹脂脫鹽得到的乳清蛋白肽更加精制；
(2)本發明制備的乳清蛋白降膽固醇肽經過離子交換樹脂、凝膠過濾色譜、反相高效液相色譜等多級色譜進行分離純化使降膽固醇肽的純度大大提高，其HMG-CoA還原酶抑制率可高達百分之二十以上；
(3)本發明采用凝膠色譜進行降膽固醇肽的分離純化時選擇0.01mol/L的HCl溶液作為洗脫液，與傳統的鹽緩沖溶液相比，其優點是不會在洗脫樣品中帶入其它鹽離子，消除了某些帶電離子與SepHadex凝膠引起的相互作用，也不會破壞肽段的生理活性，而且HCl易揮發，因此在洗脫液蒸發濃縮的同時，即可被除去；
(4)水解所用蛋白酶為胰蛋白酶，其具有專一性切割特點，能獲得我所需要的理想肽段，并且在人體模擬胃腸道時其使降膽固醇肽穩定性較其它酶類更具優勢。具體實驗方式 實例I
原料為脫鹽乳清粉，在0-4°C下貯存。將乳清蛋白粉按5%進行水化，在65 °C保持20分鐘使乳清蛋白變性，然后降至40°C，調pH為8. 0，按酶與底物質量濃度比為0. 06加入胰蛋白酶后在磁力攪拌器下進行水解，時間為6h，在90°C下保持IOmin滅酶活，冷卻后在4500r/min離心，將上清液進行冷凍干燥得到乳清蛋白多肽粗制品，取乳清蛋白粗制肽配成10mg/ml的多肽溶液，然后以45ml/h的流速進離子交換樹脂柱，收集流出液，將流出液通過SepHadex G_15進行分離純化,所用洗脫液為0. 0lmol/L的HCl，收集到的流出液應用分光光度法進行HMG-CoA還原酶抑制率的測定，從中選出抑制率最高的洗脫峰進入下一步反相高效液相色譜進行分離純化，所用的緩沖溶液為0. 15%三氟乙酸溶液，得到不同的洗脫峰，同上進行抑制率測定，收集抑制率最高的洗脫峰組分冷凍干燥得降膽固醇肽產品。上述SepHadex G-15分離得到的乳清蛋白降膽固醇肽HMG-CoA還原酶抑制率的測定，如表I所示
權利要求
1.一種乳清蛋白降膽固醇肽的制備方法，按照如下步驟完成 (1)用胰蛋白酶水解乳清蛋白粉； (2)將(I)中得到的水解液進行離心，取上清液，冷凍干燥，得到粗多肽冷凍干燥； (3)將水解液(多肽)經離子交換樹脂脫鹽處理，進而純化精制； (4)用凝膠過濾色譜(S^)HadexG-15)對水解的肽進行分離純化； (5)使用反相高效液相色譜(RP-HPLC)對步驟(4)中得到的HMG-CoA還原酶抑制率高的洗脫組分進行進一步分離純化。
2.根據權利要求I所述一種乳清蛋白降膽固醇肽的制備方法，其特征是步驟(I)中乳清蛋白采用的是脫鹽乳清粉，其蛋白質含量不少于12. 7%，灰分低于5. 6%，乳糖含量為總干物質的80%左右，水解條件E/S為O. 05 O. 06，ΡΗ=8. 0 9· 0，時間為6 8h，溫度37 40°C。
3.根據權利要求I所述一種乳清蛋白降膽固醇肽的制備方法，其特征是步驟(I)中得到的多肽水解液在90°C滅酶IOmin,4500r/min下離心IOmin,保留上清液。
4.根據權利要求I所述一種乳清蛋白降膽固醇肽的制備方法，其特征是將步驟(2)的冷凍干燥的粗肽配成50mg/mL的多肽溶液，用離子交換樹脂進行脫鹽，此過程只是減少水解液中鹽的含量，在流速為45ml/h條件下，乳清蛋白水解液總的氮回收率為80%以上，脫鹽率為80%以上。
5.根據權利要求I所述一種乳清蛋白降膽固醇肽的制備方法，其特征是將水解的多肽溶液利用SepHadex G_15進行降膽固醇肽的初步分離，收集流出液，采用分光光度法對其HMG-CoA還原酶抑制率進行測定，收集第二組分洗脫峰進行下一個反相高效液相色譜進一步進行分離純化，收集第四組分洗脫峰，進行冷凍干燥，得粉末狀乳清蛋白降膽固醇肽。
全文摘要
本發明旨在水解乳清蛋白，研究其水解機制以及分離純化技術，以制備一種乳清蛋白降膽固醇肽。該制備水解用具有專一切割性的胰蛋白酶，獲得所需肽段優勢更強。采用多級色譜進行分離純化，所得組分純度以及HMG-CoA還原酶抑制率更高，在凝膠過濾時所用洗脫液為HCl，與以往的鹽類洗脫液相比，消除了某些帶電離子與SepHadex凝膠引起的相互作用，也不會破壞肽段的生理活性，而且HCl易揮發，因此在洗脫液蒸發濃縮的同時，即可被除去。本發明所得產品具有安全性極高，無毒副作用的優點，易作為功能因子添加到各類食品中，有著良好的市場前景，且其純度、抑制率均達到相當高要求，可用于食品和醫藥行業。
文檔編號C07K1/20GK102816822SQ201210336978
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月13日 優先權日2012年9月13日
發明者李曉東, 張金鳳, 馬麗媛, 王妍 申請人:東北農業大學