專利名稱：蜈蚣類毒素的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種藥品原料的制備方法，尤其是ー種蜈蚣類毒素的制備方法。
背景技術：
一種致病性細菌所產(chǎn)生的特異性毒性物質ー細菌毒素經(jīng)脫毒處理而保留免疫原性，稱之為類毒素。類毒素是ー種自動免疫制劑，用于細菌毒素性疾病的預防及治療?，F(xiàn)常用生產(chǎn)類毒素的方法是選擇培養(yǎng)基和菌種，菌種經(jīng)人工培養(yǎng)后產(chǎn)生毒素，毒素脫毒后形成類毒素。目前非常成熟的類毒素有破傷風類毒素、白喉類毒素、霍亂類毒素等
女ロ )PR οCN101869704A公開了單劑免疫破傷風類毒素陽離子葡聚糖微球及其制備方法，其特征是由破傷風類毒素通過靜電作用后載在陽離子甲基丙烯酸羥こ酯葡聚糖微球上制得；CN87104279公開了類毒素制備新方法，包括用一定量氧化劑處理至少部分分離的毒素以對所說毒素進行化學滅活，但同時保留其免疫性，此后從中獲得滅活的毒素；CN1798548公開了基于含吸附類毒素或含多糖抗原微球體的免疫原性組合物，該發(fā)明是將類毒素抗原或含多糖的抗原吸附在微粒體上形成免疫原性組合物。蜈蚣是蠕蟲形的陸生節(jié)肢動物，屬節(jié)肢動物門多足綱，蜈蚣的身體由多環(huán)組成，每個環(huán)有ー對足，所以又稱多足動物，蜈蚣體內含有大量氨基酸，組胺樣物質及溶血性蛋白質、膽固醇、油脂及蟻酸等多種成分。現(xiàn)在應用蜈蚣的方法
(I)直接作為藥材利用，既有單方也有復方。(2)提取蛋白CN101747423A (201010104825. X)公開了蜈蚣抗腫瘤活性蛋白，該活性蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離測定顯示為一條帶，分子量為20KDa，經(jīng)兩步色譜技術分離而成，CN1720929 (200410054724. O)公開了鮮品蜈蚣分部位提取物及提取方法，以鮮蜈蚣為原料，こ醇漫泡，液態(tài)剪碎，固液分離，減壓蒸餾控溫濃縮至固體，こ酸こ酯溶解，冷沉淀分離沉淀物，減壓蒸餾回收こ酸こ酯至干。(3)從蜈蚣毒素中提取活性物CN101899095A (201010104802. 9)公開了蜈蚣毒素抗腫瘤活性多肽，應用超濾及反相色譜等分離方法，從蜈蚣毒素中分離純化出ー個由12個氨基酸組成的多肽。CN101862349A (200910074134. 7)公開了蜈蚣有效部位及其應用，通過仿生酶解蜈蚣而制得，蜈蚣用人工胃液加入胃蛋白酶酶解，殘渣轉入人工腸液，加入胰蛋白酶酶解，得到蜈蚣復合酶解物。
發(fā)明內容
鑒于蜈蚣作為藥材時具有毒副作用，本發(fā)明提供ー種蜈蚣類毒素的制備方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術案實現(xiàn)的1、以蜈蚣為原料，經(jīng)粉碎處理后加入蛋白酶進行酶解反應；2、分離機固液分離；3、脫毒；4、化學法或物理法滅活；5、微濾過濾除雜及超濾法濃縮；6、超聲駐波液相制備色譜純化；7、穩(wěn)定化處理。具體步驟如下(1)以蜈蚣為原料，經(jīng)粉碎處理后加入蛋白酶進行酶解反應；
(2)用分離機以3000-15000r/min分離上述酶解液；
(3)調節(jié)收集液體pH=5.8-8. O，控制溫度25-45°C，加H2O2溶液或甲醛進行脫毒處理，成為蜈蚣類毒素粗品液相；
(4)蜈蚣類毒素粗品液相采用化學法或物理法進行滅活處理；
(5)用膜孔徑O.2-5 μ m微孔過濾機過濾，并且用膜孔徑IO-IOOnm超濾機超濾處理，收集超濾液；
(6)超濾液溶于溶劑體系中，泵入超聲駐波液相制備色譜中連續(xù)分離純化，超聲駐波頻率2450-5000kHz，聲強O. 2-1. 5kw，流量O. 2-1. OL/min，紫外分光光度檢測器波長260nm ； (7)穩(wěn)定化處理分離純化蜈蚣類毒素中加入穩(wěn)定劑，在20-30°C條件下吸附10-24h，成為穩(wěn)定性蜈蚣類毒素。本發(fā)明制備的蜈蚣類毒素是以中藥材蜈蚣或蜈蚣干為原料制備的ー種類毒素，其相對分子量為30X IO4Da,制品振搖后為乳黃色均勻懸浮液，pH=6. 6-7. 4，氫氧化鋁含量少于2. 5mg/mL，游離甲醛含量小于O. 02% (g/mL)。蜈蚣體內含有大量氨基酸、組胺樣物質及溶血性蛋白質，后兩種類似蜂毒的有毒成分，可引起溶血作用，井能引起超過敏反應。服用大量蜈蚣能使心肌麻痹，井能抑制呼吸、中樞。經(jīng)去毒處理后，生成的蜈蚣類毒素對組胺樣物質及溶血性蛋白質進行了改性，消除了過敏源，溶血性蛋白質的重組解決了溶血性問題。本發(fā)明的制備過程不涉及傳統(tǒng)類毒素生產(chǎn)的菌種和培養(yǎng)基篩選，生產(chǎn)エ藝簡單，節(jié)能、無環(huán)境污染，エ藝過程易于控制，制備的蜈蚣類毒素成分明確，成本較低，適合エ業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進ー步的描述。實施例I :
(1)選用新鮮中藥材蜈蚣放入絞肉機絞碎蜈蚣機體，用高壓勻漿破碎法進一步破碎機體，調節(jié)壓力IOOOOOkpa,流速至70cm/ml,重復破碎2_5次，以離心機1250_3000r/min固液分離，收集液相；
(2)收集液相IOOOml加入2000-10000ml純凈水混合均勻后加入O.5-10g胃蛋白酶，保持溫度20-50°C，酶解6h-48h ；
(3)用分離機以3000-15000r/min分離上述酶解液，收集液體用O.2mol/LNa2HPO4-O. 2mo I/LNaH2PO4 組成的緩沖液調節(jié) pH=5. 8-8. O,控制溫度 25-45 V，加IO-IOOgH2O2溶液脫毒處理15-45d,成為蜈蟻類毒素粗品液相；
(4)IL蜈蚣類毒素粗品液相置于微波爐中，在功率O. 5-2kw加熱I-IOmin進行滅活；
(5)將IOOml蜈蚣類毒素粗品液相加入O.2mol/LNa2C03-0. 2moI/LNaHCO3緩沖溶液調pH=8-12，再加入50-100gNa2S04l 20-200g活性白土，在10-30°C條件下生成沉淀并放置10h-24h ；
(6)上述物料用膜孔徑O.2-5 μ m微孔過濾機過濾，并且用膜孔徑IO-IOOnm超濾機超濾處理，收集超濾液；
(7)收集的IL超濾液溶于2-10L由甲基叔丁基醚-正丁醇-こ腈-水按照2:2:1:6的體積比組成的溶劑體系中，其中有機相中加入10-30mmol/L的三氟こ酸，水相中加Λ I-5mmoI/L氨水，泵入超聲駐波液相制備色譜中，超聲駐波頻率2450-5000kHz，聲強O. 2-1. 5kw，流量O. 2-1. OL/min，紫外分光光度檢測器波長260nm，連續(xù)分離純化；
(8)分離純化蜈蚣類毒素1000L加入200-1000L含量為5_20g/LAl (OH)3溶液中，在20-30°C條件下吸附10h-24h，成為穩(wěn)定性蜈蚣類毒素。實施例2
(1)IOOOg蜈蚣干品用粉碎機以275-500r/min連續(xù)粉碎，并用100-200目篩子篩選，收集粉末；
(2)將IOOOg粉末放入微波爐中以功率O.5-2kw，加熱10-20min殺菌處理，然后自然冷卻至 25-30 0C ；
(3)上述殺菌處理后蜈蚣干品粉末加入1-10L純凈水混合均勻后，加入I.5-50g胰蛋白 酶，保持溫度25-50°C，酶解5-48h ；
(4)用分離機以3000-15000r/min分離上述酶解物，收集的液體用O.2mol/LNa2CO3-O. 2 mo I/LNaHCO3組成的緩沖溶液調pH=5. 8-8，控制溫度25_45°C，加IO-IOOg甲醛脫毒處理30-45d，成為蜈蚣類毒素粗品；
(5)IOOOml蜈蚣類毒素粗品用10000-15000高斯磁感強度處理2_5min，處理3_5次滅
活；
(6)將IKg蜈蚣類霉素粗品加入氨水調整pH=7-9，加入100-300g(NH4)2SO4及150-500g沸石，常溫條件下生成沉淀并吸10_24h ；
(7)上述脫毒液用膜孔徑O.2-10 μ m微濾機過濾再用膜孔徑IO-IOOnm超濾機超濾濃縮，收集濃縮液。(S)IL濃縮液溶于2-10L由甲基叔丁基醚-正丁醇-こ腈-水按照2:2:1:6的體積比組成的溶劑體系中，其中有機相中加入10-30mmol/L三氟こ酸，水相中加入l_5mmol/L氨水，泵入超聲駐波液相制備色譜中，超聲駐波頻率2450-5000kHz，聲強O. 2-1. 5kw，流量O. 5-1. OL/min,紫外分光光度檢測器波長260nm，連續(xù)分離純化；
(9)分離純化的IL蜈蚣類毒素加入20.0-50. OL含量為10_20g/LCa3(PO4)2溶液中，在20-30°C條件下吸附10-24h，成為穩(wěn)定性蜈蚣類毒素。
權利要求
1.蜈蚣類毒素的制備方法，其特征在于所述制備方法如下 (1)以蜈蚣為原料，經(jīng)粉碎處理后加入蛋白酶進行酶解反應； (2)用分離機以3000-15000r/min分離上述酶解液； (3)收集液體進行脫毒處理，成為蜈蚣類毒素粗品液相，控制pH=5.8-8. O，溫度25-45 0C ； (4)蜈蚣類毒素粗品液相采用化學法或物理法進行滅活處理； (5)用膜孔徑O.2-5 μ m微孔過濾機過濾，并且用膜孔徑IO-IOOnm超濾機超濾處理，收集超濾液； (6)超濾液溶于溶劑體系中，泵入超聲駐波液相制備色譜中連續(xù)分離純化，超聲駐波頻率2450-5000kHz，聲強O. 2-1. 5kw，流量O. 2-1. OL/min，紫外分光光度檢測器波長260nm ； (7)穩(wěn)定化處理分離純化蜈蚣類毒素中加入穩(wěn)定劑，在20-30°C條件下吸附10-24h，成為穩(wěn)定性蜈蚣類毒素。
2.根據(jù)權利要求I所述的蜈蚣類毒素的制備方法，其特征在于所述蛋白酶為胃蛋白酶或膜蛋白酶。
3.根據(jù)權利要求I所述的蜈蚣類毒素的制備方法，其特征在于所述溶劑體系由甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水按照2:2:1:6的體積比組成。
4.根據(jù)權利要求3所述的蜈蚣類毒素的制備方法，其特征在于所述溶劑體系的有機相中加入10_30mmol/L三氟乙酸,水相中加入l_5mmol/L氨水。
5.根據(jù)權利要求I所述的蜈蚣類毒素的制備方法，其特征在于所述穩(wěn)定劑為Al(OH)3溶液或Ca3 (PO4)2溶液。
全文摘要
蜈蚣類毒素的制備方法，涉及一種藥品原料的制備方法。鑒于蜈蚣作為藥材時具有毒副作用，本發(fā)明的蜈蚣類毒素的制備方法是通過以下技術案實現(xiàn)的1、以蜈蚣為原料，經(jīng)粉碎處理后酶解；2、分離機固液分離；3、脫毒；4、化學法或物理法滅活；5、微濾過濾除雜及超濾法濃縮；6、超聲駐波液相制備色譜純化；7、穩(wěn)定化處理。本發(fā)明制備的蜈蚣類毒素是以中藥材蜈蚣或蜈蚣干為原料制備的一種類毒素，制備過程不涉及傳統(tǒng)類毒素生產(chǎn)的菌種和培養(yǎng)基篩選，生產(chǎn)工藝簡單，節(jié)能、無環(huán)境污染，工藝過程易于控制，制備的蜈蚣類毒素成分明確，成本較低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C07K1/16GK102816820SQ201210315549
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月31日 優(yōu)先權日2012年8月31日
發(fā)明者徐華民, 趙榮華, 趙艷琨, 徐萌 申請人:哈爾濱工業(yè)大學