專利名稱：人血白蛋白的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種血液制品的制備方法，特別是涉及一種從人血漿分離的廢棄物組分IV沉淀中提取人血白蛋白的方法。
背景技術：
人血白蛋白是一種一級結構簡單的單鏈蛋白，其分子量為66250道爾頓(Da)，由585個殘基構成，富含門冬氨酸及谷氨酸而缺乏色氨酸。白蛋白分子小，表面面積相對較大，能穿過毛細血管壁和細胞間隙，負電性強，能與多種分子可逆結合，故能在血液循環與各種體液之間傳遞運送各種生理活動中所需的物質。人血白蛋白主要用于因失血、創傷及燒傷等引起的休克，腦水腫及大腦損傷所致的腦壓增高，對防治低蛋白血癥及肝硬化或腎病引起的水腫或腹水有較好的療效。 現階段臨床上用于治療的白蛋白(除基因工程產品外)全是來源商業化的人血漿，以人血漿為起始原料，由于受生產工藝所限，有大量人血白蛋白殘留在組分IV沉淀中，被作為廢物焚燒處理，造成大量資源浪費。人血漿作為國家戰略資源，十分珍貴且資源有限，人血白蛋白作為生命的急救藥品，具有不可替代性作用。為了更好的滿足臨床病人需求，同時降低該藥品的生產成本，充分利用寶貴的血漿資源，特開發出新的提取工藝。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種人血白蛋白的制備方法，該方法是從人血漿分離的廢棄物組分IV沉淀中提取、純化出安全有效的人血白蛋白，從而可以提高血漿的綜合利用，降低了人血白蛋白的生產成本。本發明所提供的技術方案是一種人血白蛋白的制備方法，包括以下步驟I)組分IV沉淀溶解以人血漿分離的廢棄物組分IV沉淀為起始原料，將組分IV沉淀投入O. 0Γ0. 03mol/L、pH值6. 8^7. 4的Tris-HCl緩沖液中得到反應液A，調整反應液A的pH為6. 8^7. 4，控制反應液A溫度為1°C，攪拌溶解后壓濾分離，得到濾液A ;2)邊攪拌濾液A邊加入分子量為300(Γ4000的聚乙二醇，使聚乙二醇濃度為8 14%(質量/體積)，得到反應液B，調整反應液B的pH至6. (Γ6. 5，控制反應液B溫度為1°C，攪拌混合后靜置沉淀，壓濾分離，得到濾液B ;3)調整濾液B的pH至5. 5^5. 8，控制濾液B的溫度為1°C，攪拌混合后靜置沉淀，壓濾分離，得到濾液C ;4)邊攪拌濾液C邊加入分子量為300(Γ4000的聚乙二醇，使聚乙二醇濃度為2(Γ25% (質量/體積)，得到反應液C，調整反應液C的pH至4. 8^5. 2，控制反應液C的溫度為-frc，攪拌混合后靜置沉淀，壓濾分離，得到沉淀；5)沉淀用O. Olmol/L.pH值6. 8^7. 4櫞酸鈉-NaCl緩沖液溶解，得到沉淀溶解液，調節沉淀溶解液的pH為6. 8 7. 4后進行DEAE Sepharose fast flow弱陰離子交換層析，收集洗脫液進行超濾，得到超濾液；
6)收集超濾液，將超濾液中的蛋白濃度稀釋至20% (質量/體積)后加入辛酸鈉，使辛酸鈉的濃度為O. 16"O. 18mmol/g蛋白質，調整pH至6. 8 7. O,用除菌濾器過濾后60±0. 5°C連續10小時恒溫巴氏滅活，再次除菌濾器過濾，得到人血白蛋白成品。本發明人血白蛋白的制備方法，其中所述超濾所用超濾膜的截留分子量為IOKD。本發明人血白蛋白的制備方法，其中所述聚乙二醇的分子量為3350。本發明人血白蛋白的制備方法，其中步驟I中所述Tris-HCl緩沖液體積是組分IV沉淀體積的2 4倍。本發明人血白蛋白的制備方法，其中步驟I中所述攪拌溶解的時間為5 8小時。本發明人血白蛋白的制備方法，其中所述進行DEAE Sepharose fast flow弱陰 離子交換層析時先用O. Olmol/L O. lmol/L、pH6. 8 7. 4的枸櫞酸鈉-NaCl緩沖液平衡，再用
O.lmol/L O. 3mol/L、pH6. 8 7. 4的枸櫞酸鈉-NaCl緩沖液梯度洗脫。上述方法制備的人血白蛋白，僅與抗人血漿產生沉淀線，與抗馬、牛、豬或羊血漿不產生沉淀線。上述方法制備的人血白蛋白，與正常人血漿比較，主要沉淀線為人血白蛋白。上述方法制備的人血白蛋白，聚乙二醇含量不高于O. 5%,即5g/L,純度應不低于蛋白質總量的96. 0% (質量百分比)。本發明人血白蛋白的制備方法步驟1-6中，對pH的調整均采用常規的酸堿中和法，采用NaOH水溶液、KOH水溶液或HCl水溶液。本發明人血白蛋白的制備方法以人血漿中的組分IV沉淀為原料，所用組分IV沉淀應符合《中國藥典》2010年版中關于“組分IV沉淀原料質量標準”。本發明人血白蛋白的制備方法與現有技術的區別在于采用血漿分離的廢棄物
組分IV沉淀為原料，提取人血白蛋白，大大提高了寶貴的人血漿的綜合利用能力，高純度
97. 5%的人血白蛋白的回收率可達到85%以上，提高了經濟效益；采用聚乙二醇法和離子交
換層析法相結合簡化了生產工藝，降低了對大型設備低溫高速離心機的需求，提高經濟效.、
Mo
具體實施例方式組分IV的制備是本領域技術人員的常規技術手段，以下實施例中所用組分IV沉淀的制備方法包括以下步驟a、原料血漿融化人原料血漿，水浴融化原料血漿，水浴中的水溫控制在37°C以下；b、組分I+II+III的乙醇沉淀及壓濾分離將原料血漿溫度降至0°C以下并加入_15°C以下的乙醇，得到反應液，使反應液中的乙醇終濃度為20體積％，用pH4. O的醋酸緩沖液調節反應液pH至6. 5±0. 3、控制反應液溫度在-4. 5^5. 5°C，靜置30分鐘，進行壓濾分離，所得沉淀為組分I+II+III沉淀，其是提取免疫球蛋白的起始原料；所得濾液為組分I+II+III濾液；C、組分IV的乙醇沉淀及壓濾分離
將組分I+II+III濾液的pH調至6. 20±0. 3，加入_15°C以下乙醇至最終乙醇濃度為40體積％，得到反應液I，控制反應液I的溫度在-4. 5^-5. 5°C，靜置30分鐘，進行壓濾分離，收集沉淀即為組分IV沉淀。實施例Ia、組分IV沉淀溶解以人血漿分離的廢棄物組分IV沉淀為起始原料，組分IV沉淀溶解于O. 01mol/L、pH值6. 8的Tris-HCl緩沖液中得到反應液A，其中Tris_HCl緩沖液體積是組分IV沉淀體積的2倍，調節反應液A的pH至6. 8，控制反應液A的溫度為1°C，攪拌溶解5小時后壓濾分離，得到濾液A ;b、邊攪拌濾液A邊加入分子量為3000的聚乙二醇至其濃度為8質量/體積％，得到反應液B，調整反應液B的pH至6. 0，控制反應液B的溫度為1°C，繼續攪拌2小時，靜置I小時，壓濾分離，得到濾液B ; C、調整濾液B的pH至5. 5，控制濾液B的溫度為1°C，繼續攪拌I小時，靜置I小時，壓濾分離，得到濾液C ;d、邊攪拌濾液C邊加入分子量為3000的聚乙二醇至其濃度為20質量/體積％，得到反應液C，調整反應液C的pH至4. 8，控制反應液C的溫度為1°C，繼續攪拌2小時，靜置I小時，壓濾分離，得到沉淀；e、將沉淀用O. Olmol/L、pH值6. 8枸櫞酸鈉-NaCl緩沖液溶解，得到沉淀溶解液，調節沉淀溶解液的pH至6. 8后將其進行DEAE Sepharose fast flow弱陰離子交換層析，用 O. 01mol/L O. lmol/L、pH6. 8 的枸櫞酸鈉-NaCl 緩沖液平衡，0. lmol/L 0. 3mol/L、pH6. 8的枸櫞酸鈉-NaCl緩沖液洗脫，收集洗脫液進行超濾，得到超濾液，超濾膜的截留分子量為IOKD0f、收集超濾液，用注射用水將超濾液中的蛋白濃度稀釋至20質量/體積％后加入辛酸鈉，使辛酸鈉的濃度為0. 16mmol/g蛋白質,調整pH至6. 8 7. O,用除菌濾器過濾，60±0.5°C連續10小時恒溫巴氏滅活，再次除菌濾器過濾，得到人血白蛋白成品。按上述方法制取三批次的人血白蛋白成品，檢測蛋白濃度和純度，并計算蛋白回
收率，結果如下表
權利要求
1.一種人血白蛋白的制備方法，其特征在于包括以下步驟 1)組分IV沉淀溶解以人血漿分離的廢棄物組分IV沉淀為起始原料，將組分IV沉淀投入O. ΟΓΟ. 03mol/L、pH值6. 8^7. 4的Tris-HCl緩沖液中得到反應液A，調整反應液A的pH為6. 8^7. 4，控制反應液A溫度為-廣I °C，攪拌溶解后壓濾分離，得到濾液A ; 2)邊攪拌濾液A邊加入分子量為300(Γ4000的聚乙二醇，使聚乙二醇濃度為8 14%(質量/體積)，得到反應液B，調整反應液B的pH至6. (Γ6. 5，控制反應液B溫度為1°C，攪拌混合后靜置沉淀，壓濾分離，得到濾液B ; 3)調整濾液B的pH至5.5^5. 8，控制濾液B的溫度為1°C，攪拌混合后靜置沉淀，壓濾分離，得到濾液C ; 4)邊攪拌濾液C邊加入分子量為300(Γ4000的聚乙二醇，使聚乙二醇濃度為2(Γ25%(質量/體積)，得到反應液C，調整反應液C的pH至4. 8^5. 2，控制反應液C的溫度為1°C，攪拌混合后靜置沉淀，壓濾分離，得到沉淀； 5)沉淀用O.Olmol/L.pH值6. 8^7. 4櫞酸鈉-NaCl緩沖液溶解，得到沉淀溶解液，調節沉淀溶解液的pH為6. 8^7. 4后進行DEAE Sepharose fast flow弱陰離子交換層析,收集洗脫液進行超濾，得到超濾液； 6)收集超濾液，將超濾液中的蛋白濃度稀釋至20%(質量/體積)后加入辛酸鈉，使辛酸鈉的濃度為O. 16^0. 18mmol/g蛋白質，調整pH至6. 8 7. 0，用除菌濾器過濾后60±0. 5°C連續10小時恒溫巴氏滅活，再次除菌濾器過濾，得到人血白蛋白成品。
2.根據權利要求I所述的人血白蛋白的制備方法，其特征在于所述超濾所用超濾膜的截留分子量為10KD。
3.根據權利要求2所述的人血白蛋白的制備方法，其特征在于所述聚乙二醇的分子量為3350。
4.根據權利要求3所述的人血白蛋白的制備方法，其特征在于步驟I中所述Tris-HCl緩沖液體積是組分IV沉淀體積的2 4倍。
5.根據權利要求4所述的人血白蛋白的制備方法，其特征在于步驟I中所述攪拌溶解的時間為5 8小時。
6.根據權利要求I所述的人血白蛋白的制備方法，其特征在于所述進行DEAESepharose fast flow弱陰離子交換層析時先用O. Olmol/L O. lmol/L、pH6. 8 7· 4的枸橡酸鈉-NaCl緩沖液平衡，再用O. lmol/L O. 3mol/L、pH6. 8 7· 4的枸櫞酸鈉-NaCl緩沖液梯度洗脫。
7.根據權利要求1-6之一所述的方法制備的人血白蛋白，其特征在于僅與抗人血漿產生沉淀線，與抗馬、牛、豬或羊血漿不產生沉淀線。
8.根據權利要求1-6之一所述的方法制備的人血白蛋白，其特征在于與正常人血漿比較，主要沉淀線為人血白蛋白。
9.根據權利要求1-6之一所述的方法制備的人血白蛋白，其特征在于聚乙二醇含量不高于O. 5%，純度應不低于蛋白質總量的96. 0%。
全文摘要
本發明涉及一種人血白蛋白的制備方法，該方法是從人血漿分離的廢棄物組分IV沉淀中提取、純化出人血白蛋白，從而可以提高血漿的綜合利用。本發明包括以下步驟1、將組分IV沉淀溶解后壓濾分離得到濾液A；2、邊攪拌濾液A邊加入聚乙二醇，壓濾分離，得到濾液B；3、調整濾液B的pH，控制濾液B的溫度，壓濾分離，得到濾液C；4、邊攪拌濾液C邊加入聚乙二醇，得到反應液C，壓濾分離，得到沉淀；5、沉淀溶解，進行DEAE Sepharose fast flow弱陰離子交換層析，超濾；6、將超濾液中的蛋白濃度稀釋后加入辛酸鈉，調整pH至6.8～7.0，除菌過濾、巴氏滅活，得到人血白蛋白成品。
文檔編號C07K14/765GK102816230SQ20121030816
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月27日 優先權日2012年8月27日
發明者邵恒波, 胡輝恒, 鄧坤 申請人:同路生物制藥股份有限公司