專利名稱：豬圓環(huán)病毒orf2基因原核表達分泌蛋白的純化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒0RF2基因原核表達分泌蛋白的純化方法，屬于疾病免疫技術領域。
背景技術：
豬圓環(huán)病毒病(PCV)是由豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)引起的豬傳染性疾病，是繼豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)之后新發(fā)現(xiàn)的又一重要疫病。感染豬可自鼻液、糞便等廢物中排出病毒，經(jīng)口腔、呼吸道途徑感染不同年齡的豬，可通過水平傳播和垂直傳播。豬圓環(huán)病毒病臨床表現(xiàn)為漸進性消瘦或生長遲緩，并可引起免疫抑制，導致混合感染，死亡率高達 25%-40%。自1997年Clark等首次分離到豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)以來，該病已給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。2008年第20屆國際豬病大會(20th IPVS)上，人們更將其列為當前危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的頭號疫病。我國自2000年報道豬群中存在PCV2感染的血清學證據(jù)以來，各地區(qū)陸續(xù)報道，流行范圍已波及全國，豬群平均陽性率38. 47%，豬場陽性率58. 75% 以上，危害日趨嚴重。
豬圓環(huán)病毒2型基因組編碼11個閱讀框，即0RF1-0RF11，各閱讀框大小相差懸殊， 而ORFl和0RF2是其兩個主要的閱讀框。其中ORFl編碼與病毒復制相關的Rep蛋白，該蛋白氨基酸序列比較保守；0RF2基因編碼病毒的主要結構蛋白Cap蛋白，是臨床分子水平上鑒定PCV2的重要基因。0RF2蛋白不僅可以自我裝配成病毒衣殼樣顆粒，而且可以與PCV2 的多抗反應，成為目前研究的熱點。而0RF2蛋白的獲取多是通過原核、真核及酵母表達系統(tǒng)來實現(xiàn)，但是所得到的0RF2蛋白多是以包涵體形式呈現(xiàn)，不僅增加了蛋白復性的難度， 而且增加了生產(chǎn)成本，因此0RF2蛋白的純化技術均是建立在包涵體基礎之上的，目前尚無針對分泌性表達的0RF2蛋白的純化技術。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種豬圓環(huán)病毒0RF2基因原核表達分泌蛋白的純化方法。
為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術方案提供一種豬圓環(huán)病毒0RF2基因原核表達分泌蛋白的純化方法，具體步驟如下
I)取菌體，超聲波破碎，離心，取上清液；
2)上樣，緩沖液A洗去層析柱中未結合蛋白；
3)依次用緩沖液則、82、83、84、85和86洗去雜質(zhì)蛋白；
4 )依次用緩沖液CI、C2、C3、C4、C5、C6、DI、D2和D3洗脫目的蛋白，即得含目的蛋白的流穿液。
所述的緩沖液A為
O. 2M Na2HPO4
O. 2M NaH2PO4
0.15MNaCl。
所述的緩沖液BI為
O. 2M Na2HPO4
O. 2M NaH2PO4
O.15M NaCl
5mM咪唑。
所述的緩沖液B6為
O. 2M Na2HPO4
O. 2M NaH2PO4
O.15M NaCl
80mM咪唑。
所述的緩沖液C4為
PH7. O
O. 2M Na2HPO4
O. 2M NaH2PO4
O.15M NaCl。
所述的緩沖液D2為
PH7. O
O. 2M Na2HPO4
O. 2M NaH2PO4
O.15M NaCl
200mM咪唑。
咪唑濃度為5mM和80mM的緩沖液BI和B6能有效去除雜質(zhì)蛋白。
緩沖液D2洗脫目的蛋白的純度為85%。
本發(fā)明針對分泌性表達的0RF2蛋白純化處理，克服了包涵體形式的0RF2蛋白復性困難，成本較高的缺點。本發(fā)明操作方便，工藝簡單，提取的分泌性表達0RF2蛋白純度可達85%，且與豬圓環(huán)病毒抗體發(fā)生特異性結合，具有良好的反應活性，為豬圓環(huán)病毒0RF2基因分泌蛋白的開發(fā)奠定了基礎。
圖I顯示為變性條件下PH值梯度洗脫SDS-PAGE圖
泳道I :相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)marker ；
泳道2 :緩沖液Cl (PH4. 5)洗脫的純化產(chǎn)物；
泳道3 :緩沖液C2 (PH5. 9)洗脫的純化產(chǎn)物；
泳道4 :緩沖液C3 (PH6. 3)洗脫的純化產(chǎn)物；
泳道5 :緩沖液C4 (PH7. O)洗脫的純化產(chǎn)物；
泳道6 :緩沖液C5 (PH7. 4)洗脫的純化產(chǎn)物；
泳道7 :緩沖液C6 (PH8. 5)洗脫的純化產(chǎn)物；
圖2顯示為變性條件下咪唑梯度洗雜、洗脫SDS-PAGE圖
泳道I :超聲破碎上清
泳道2
泳道3
泳道4
泳道5
泳道6
泳道7
泳道8
泳道9
泳道10
泳道11
泳道1具體實施方式
材料準備
Ni2+-NTA填料為北京韋氏博慧色譜科技有限公司產(chǎn)品；BCA Protein Assay Kit 為北京康為世紀生物科技有限公司產(chǎn)品；丙烯酰胺、N, N’ -甲叉雙丙烯酰胺、SDS、Tris, Glycine為Sigma公司產(chǎn)品；SDS_聚丙烯酰胺凝膠電泳分子量標準為Fermentas產(chǎn)品；羊抗豬酶標二抗為武漢科前動物生物制品有限責任公司產(chǎn)品；顯色液及終止液為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；其它試劑為分析純。N，N’ -甲叉雙丙烯酰胺(BIS)用于配制30% 丙烯酰胺溶液，其中30%丙烯酰胺溶液中質(zhì)量比BIS:Acrylamide=l:9 ；Glycine用于配制SDS-PAGE電泳緩沖液。
試劑及緩沖液的配制
I、緩沖液A :
O. 2M Na2HPO4
O. 2M NaH2PO4
O.15MNaCl
2、緩沖液BI
O. 2M Na2HPO4
O. 2M NaH2PO4
O.15M NaCl
5mM咪唑
3、緩沖液B2
O. 2M Na2HPO4
O. 2M NaH2PO4
O.15M NaCl
IOmM咪唑
4、緩沖液B3
O. 2M Na2HPO4
O. 2M NaH2PO40079]O.15MNaCl0080]20mM咪唑0081]5、緩沖液B4 0082]O. 2M Na2HPO40083]O. 2M NaH2PO40084]O.15M NaCl0085]40mM咪唑0086]6、緩沖液B5 0087]O. 2M Na2HPO40088]O. 2M NaH2PO40089]O.15MNaCl0090]60mM咪唑0091]7、緩沖液B6 0092]O. 2M Na2HPO40093]O. 2M NaH2PO40094]O.15MNaCl0095]80mM咪唑0096]8、緩沖液Cl 0097]PH 4. 5 (HCl 調(diào) pH)0098]O. 2M Na2HPO40099]O. 2M NaH2PO40100]O.15MNaCl0101]9、緩沖液C2 0102]PH 5. 9 (HCl 調(diào) pH)0103]O. 2M Na2HPO40104]O. 2M NaH2PO40105]O.15M NaCl0106]10、緩沖液C3 0107]PH6. 3 (HCl 調(diào) pH)0108]O. 2MNa2HP040109]O. 2M NaH2PO40110]O.15M NaCl0111]11、緩沖液〇4 0112]PH 7. O (HCl 調(diào) pH)0113]O. 2MNa2HP040114]O. 2M NaH2PO40115]O.15M NaCl0116]12、緩沖液C5 0117]PH 7. 4 (HCl 調(diào) pH)
O. 2M Na2HPO4
O. 2M NaH2PO4
O.15M NaCl
13、緩沖液C6
PH 8. 5 (HCl 調(diào) pH)
O. 2M Na2HPO4
O. 2M NaH2PO4
O.15M NaCl
14、緩沖液Dl
PH 7. 4 (HCl 調(diào) pH)
O. 2M Na2HPO4
O. 2M NaH2PO4
O.15M NaCl
IOOmM咪唑
15、緩沖液D2
PH 7. 4 (HCl 調(diào) pH)
O. 2M Na2HPO4
O. 2M NaH2PO4
O.15MNaCl
200mM咪唑
16、緩沖液D3
PH 7. 4 (HCl 調(diào) pH)
O. 2M Na2HPO4
O. 2M NaH2PO4
O.15M NaCl
500mM咪唑
17、包被緩沖液
3. 03g Na2CO3
6. OgNaHCO3
加水溶解，定容至1L，調(diào)節(jié)pH9. 6。
18、PBS
I. 16g Na2HPO4
O. Ig KCl
O. Ig K3PO4
4. OgNaCl
加水溶解，定容至500ml，調(diào)節(jié)ρΗ7· 4。
19、封閉液
30g鹿糖
IOg牛血清白蛋白或Ig干酪素
9gNaCl
加水溶解，定容至1L。
樣品的準備
I)離心收集500ml分泌表達豬圓環(huán)病毒0RF2蛋白的細菌培養(yǎng)物(OD6tltol=Z. O左右)，稱量菌體重量；
2)4°C放置30min,按lml/g加入緩沖液A,重懸混勻后按lmin/ml冰浴條件下超聲波破碎，超聲波破碎條件為3s-3s-300W ；
3)4。。, 12000rpm離心20min,收集上清液；
4)將上清液經(jīng)O. 45 μ m濾紙過濾待用。
使用后柱子的處理與保存
I)用含500mM咪唑的緩沖液A (pH8. O)以沖洗層析柱，共沖洗30ml ；
2)用濃度為I. 5M的NaCl溶液沖洗層析柱，共沖洗30ml ；
3)用過濾去離子水沖洗50ml ；
4)用20%乙醇沖洗30ml后于4°C 20%乙醇中保存。
實施例I
本實施例提供變性條件下PH梯度洗脫法純化目的蛋白，具體步驟如下
I)柱平衡在柱子下端加入少量滅菌蒸餾水，關閉柱子出口，連續(xù)導入Ni2+-NTA填料，自然沉降后按lml/min的速度加入5倍柱體積的緩沖液A平衡柱子；
2)上樣以O. 5ml/min的流速上樣于平衡好的柱子，室溫靜置lh。用5倍柱體積的緩沖液A洗柱，去除層析柱中未結合蛋白；
3)洗雜依次用5倍柱體積的緩沖液B1、B2、B3、B4、B5、B6洗雜，洗雜過程中保持流速在l-2ml/min,收集流穿液；
4)洗脫依次用5倍柱體積的緩沖液C1、C2、C3、C4、C5、C6洗脫，洗脫過程中保持流速在l-2ml/min,即得含目的蛋白的流穿液。
蛋白濃度及蛋白純度的檢測
I)檢測蛋白濃度按照BCA蛋白定量試劑盒說明方法檢測蛋白質(zhì)濃度。經(jīng)BCA法檢測，緩沖液C1、C2、C3、C4、C5、C6洗脫后所得總蛋白濃度分別為21. 2 μ g/ml、33. 6 μ g/ml、48. 3 μ /ml>79. 5 μ g/ml、58. 4 μ g/ml、51. 7 μ g/ml ；
2)檢測蛋白純度=SDS-PAGE法測定蛋白質(zhì)純度，步驟如下
A、配膠安裝玻璃板，按照表I中的數(shù)值配制一定體積的分離膠溶液和積層膠溶液，并分別灌注；
表I分離膠溶液和積層膠溶液的成分
權利要求
1.一種豬圓環(huán)病毒0RF2基因原核表達分泌蛋白的純化方法，其特征在于，具體步驟如下 1)取菌體，超聲波破碎，離心，取上清液； 2)上樣，緩沖液A洗去層析柱中未結合蛋白； 3)依次用緩沖液81、82、83、84、85和B6洗去雜質(zhì)蛋白； 4 )依次用緩沖液CI、C2、C3、C4、C5、C6、DI、D2和D3洗脫目的蛋白，即得含目的蛋白的流穿液。
2.根據(jù)權利要求I所述的一種豬圓環(huán)病毒0RF2基因原核表達分泌蛋白的純化方法，其特征在于，所述的緩沖液A為O. 2M Na2HPO4O. 2M NaH2PO4O.15M NaCl。
3.根據(jù)權利要求I所述的一種豬圓環(huán)病毒0RF2基因原核表達分泌蛋白的純化方法，其特征在于，所述的緩沖液BI為O. 2M Na2HPO4O. 2M NaH2PO4O.15M NaCl5mM咪唑。
4.根據(jù)權利要求I所述的一種豬圓環(huán)病毒0RF2基因原核表達分泌蛋白的純化方法，其特征在于，所述的緩沖液B6為O. 2M Na2HPO4O. 2M NaH2PO4O.15M NaCl80mM咪唑。
5.根據(jù)權利要求I所述的一種豬圓環(huán)病毒0RF2基因原核表達分泌蛋白的純化方法，其特征在于，所述的緩沖液C4為 PH7. OO.2M Na2HPO4O.2M NaH2PO4O.15M NaCl。
6.根據(jù)權利要求I所述的一種豬圓環(huán)病毒0RF2基因原核表達分泌蛋白的純化方法，其特征在于，所述的緩沖液D2為 PH7. OO.2M Na2HPO4O.2M NaH2PO4O.15M NaCl200mM咪唑。
7.根據(jù)權利要求I所述的一種豬圓環(huán)病毒0RF2基因原核表達分泌蛋白的純化方法，其特征在于，咪唑濃度為5mM和80mM的緩沖液BI和B6能有效去除雜質(zhì)蛋白。
8.根據(jù)權利要求I所述的ー種豬圓環(huán)病毒0RF2基因原核表達分泌蛋白的純化方法，其特征在于，緩沖液D2洗脫目的蛋白的純度為85%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒ORF2基因原核表達分泌蛋白的純化方法，步驟為超聲波破碎菌體，離心沉淀細胞碎片，保留上清液。上樣，用配制的緩沖液洗去雜質(zhì)蛋白，再用配制的緩沖液洗脫目的蛋白，即得含目的蛋白的流穿液。其中，咪唑濃度5mM和80mM的緩沖液能有效去除雜質(zhì)蛋白；緩沖液D2洗脫目的蛋白的純度為85%。本發(fā)明針對分泌性表達的ORF2蛋白純化處理，克服了包涵體形式的ORF2蛋白復性困難，成本較高的缺點。本發(fā)明操作方便，工藝簡單，且純化的分泌蛋白可與豬圓環(huán)病毒抗體發(fā)生特異性結合，具有良好的反應活性，為豬圓環(huán)病毒ORF2基因分泌蛋白的開發(fā)奠定了基礎。
文檔編號C07K14/01GK102977193SQ20121030413
公開日2013年3月20日 申請日期2012年8月23日 優(yōu)先權日2012年8月23日
發(fā)明者吳紅云, 李建正, 徐進, 李厚偉 申請人:鄭州后羿制藥有限公司