專利名稱：一種結核分枝桿菌重組蛋白質及其制備方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術和診斷試劑、疫苗研制領域，特別是涉及一種結核分枝桿菌重組蛋白質及其制備方法。
背景技術：
結核病(Tuberculosis, TB)是人類最古老的傳染病之一,至今依然是單一感染因素引起死亡人數最多的疾病，嚴重威脅著人類健康。近年來隨著艾滋病的蔓延及全球人口流動速度和數量的急速增長，結核病的發病率呈上升趨勢，尤其是發展中國家貧困、落后、饑餓、人口擁擠、醫療衛生條件差等現象更使結核病難以得到控制。據WHO統計，全世界現有17. 22億人感染結核病菌，每年有900萬新結核病人，其中約300萬人死于結核病。我國是世界上22個結核病高負擔國家之一，目前全國約有5. 5億人感染過結核菌，感染率達 到44. 5%，高于全球1/3的感染率水平，肺結核病人600多萬，其中有嚴重傳染性的病人150萬，每年死于結核病的達25萬人。據研究，受結核菌感染的人群中，10%的人會發展為結核病。結核病還是一種人畜共患傳染病。因此，結核病的預防、早期診斷和及時治療仍是我國乃至世界高度關注的課題。結核病是由結核桿菌引起的，主要通過呼吸道傳播，通常表現為肺部感染，而當人體抵抗力下降時，結核桿菌就迅速生長繁殖而引發肺結核，若病人的抵抗力繼續下降或得不到及時治療，結核桿菌就會通過淋巴、血液傳播到身體各器官，并在該處引起結核病。常見的有腎結核、結腦、腸結核、淋巴結核等肺外結核。但是，由于結核病是一種慢性傳染病，有些感染者歷程癥狀不明顯，因此常不引起患者注意而延誤病情。故對結核病的早期診斷對有效控制結核病，降低該病的發生率及死亡率有著重大的臨床意義。目前常用的結核病診斷方法有胸部X光透視和主要依靠患者痰液、胸水、支氣管肺泡液的顯微鏡直接涂片檢查(AFP)以及培養法。X光常用作肺結核初步診斷，但特異性差，同時對感染有艾滋病病毒(HIV)的結核病人及肺外結核病人不適用。AFB涂片法靈敏度差(僅為2(T30% )，用固體培養基培養結核菌，雖然可以顯著改善檢測結果，但結核菌生長緩慢，一般得6 - 8周才能出檢驗報告，況且AFB涂片和培養法只能在檢測方法只能在體液中存在細菌時方能檢出，而對于不排菌的結核患者就檢測不出，故認為上述檢測方法已經不能適應臨床診斷治療及傳染病控制的要求。為此，人們就企圖利用血清學方法以快速診斷結核病。近年來，隨著結核分枝桿菌分子生物學與蛋白組學的研究不斷發展，結核病的免疫學診斷亦有較大進展。目前已經發現、純化和重組了多種結核分枝桿菌特異性的菌體和分泌蛋白質抗原。由于結核分支桿菌抗原的復雜性，在宿主體內表達的數量、種類或時機可能隨病人的個體免疫背景和病程而異，表現出不同的抗體譜，檢測時有的抗原不表達，未檢測出相應的抗體，有的抗體含量高，有的則低。因此，單一抗原檢測，往往檢測的靈敏度并不近如人意。目前很多研究者試圖用雞尾酒式混合抗原來提高結核病感染的診斷效果，結果表明用多種特異性抗原可以在不影響特異性的情況下獲得比單一抗原更高的敏感性。
發明內容
本發明的目的是提供一種結核分枝桿菌重組蛋白，本發明的另一目的是提供該結核分枝桿菌重組蛋白在制備檢測試劑盒中的應用。為了實現上述目的，本發明提供了一種編碼結核蛋白的重組核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。同時提供了由該重組DNA序列編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO. 2所示。本發明還提供了一種結核分枝桿菌蛋白的的表達載體pET-28a—ricR-rpoB-GyrB,它是將SEQ ID NO. I所示所述的核苷酸序列插入到質粒pET-28a上得到的重組質粒,其質粒圖譜如附圖2所示。將表達載體pET-28a—ricR-rpoB-GyrB導入大腸桿菌中,得到表達結核 蛋白的工程菌株。本發明利用SEQ ID NO. I所示核苷酸序列通過基因工程方法制備結核蛋白可以通過如下步驟實現I)獲得具有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列；2)將該核苷酸序列導入質粒，優選pET_28a質粒；3)將該質粒導入原核宿主細胞，優選大腸桿菌宿主細胞，更優選BL21 (DE3)菌株中；
4)在有利于所述核苷酸序列表達的條件下培養所述宿主細胞；
5)回收、純化及復性所表達的重組蛋白。本發明還提供包含本發明結核蛋白的組合物以及試劑盒。所述的組合物可作為檢測結核感染的試劑。所述的組合物可作為檢測結核分枝桿菌感染的試劑盒。本發明提供的結核蛋白抗原具有高特異性、強免疫原性和盡量完整的抗原決定簇，因此，本領域技術人員可以想到，本發明的結核蛋白可以用來制備結核疫苗，如亞單位疫苗等，同樣，本發明所公開的如SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列也可用來制備DNA疫苗。因此本發明還涉及包含本發明結核蛋白或核酸的結核的疫苗。以下將更詳細的描述本發明的技術方案本發明公開了一種如SEQ ID NO: I所示的編碼結核蛋白的重組核酸，利用該核苷酸序列制備結核分枝桿菌蛋白的方法，由該方法制備的包含SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的結核分枝桿菌蛋白，以及包含該蛋白的組合物和試劑盒，同時還公開了它們在檢測結核分枝桿菌感染的應用。SEQ ID N0:1所示核苷酸序列可以通過本領域常規的方法制備，選擇其強 抗原表位 ricR 蛋白(GenBank:⑶726749. I)、rpoB (GenBank:GQ395623. I)和 GyrB(GenBank:AJ564417. I)的DNA序列為模板，設計擴增引物。其中Fl和Rl用于擴增ricR基因的片段，F2和R2用于擴增rpoB基因的片段，F3和R3用于擴增GyrB基因的片段；引物Fl和R3分別帶有NdeI和XhoI的酶切位點，引物F2和Rl順序互補，并共同對應于rpoB基因片段的5’末端序列，引物F3和R2順序互補，并共同對應于GyrB基因片段的5’末端序列；序列如下ricR擴增引物
FlATCGCATATG ATGACAGCAGCACACGGCTACACGCAGCA53. 85% Tm=66. 34RlAATCGCGCGCCTGGTTCGTTCCGGTGGTGGTGGTTGTTCTCGA60. 47% Tm=67. 79rpoB擴增引物F2 GGTGGTGGTGGTTGTTCTCGACCGCGCTT62. 07% Tm=61. 06R2 AGTCACCACCACCACCTCGCGGTTGTTCTGGATCAAA54. 05%, Tm=65. 51
GyrB擴增引物F3 GGTGGTGGTGGTGACTCGGCCGGCGGTTCTGCAAAAA62. 16% Tm=65. 54R3 ATCGCTCGAG GTTCTTTAGCACCCGGTCGAT53. 13% Tm=62. 97本發明對上述核苷酸序列的核酸分子采用適當載體和宿主細胞表達時可以大大提高表達產率。本發明的一個實施方案涉及應用如SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列制備編碼結核蛋白的方法。根據常規方法，可將含如SEQ ID NO: I所示核苷酸序列的核酸分子連接到一個表達載體中，然后通過常規方法轉化細胞。通常，優選原核生物用于DNA序列的起始克隆和用于本發明的載體構建。例如，大腸桿菌等腸科桿菌。編碼本發明蛋白的核酸與pET_28a形成的雜合質粒具有高度的穩定性，有利于本發明的蛋白的表達。在本發明的一個實施方案中，如圖2所示，制備含有SEQ ID N0:1所示核苷酸序列的核酸分子和pET-28a質粒的表達構建體，并將該構建體轉化BL21 (DE3)，經IPTG誘導培養后，收集菌體。可采用常規的純化方法純化所得到的蛋白。本發明的一個實施方案涉及用上述方法制備、純化的編碼結核蛋白，該蛋白具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。本發明的一個實施方案涉及包含本發明編碼結核蛋白的組合物和試劑盒。所述組合物或試劑盒可制備成檢測結核分枝桿菌感染的試劑或試劑盒形式。本文所述“試劑盒”是指利用本發明蛋白完成結核分枝桿菌感染檢測而組配制成的成套試劑。本發明試劑盒可包括其它多個容器，其中可分別含有檢測所用的標準品，抗體或經過標記的抗體、酶，底物或緩沖液等。在該試劑盒中，還包括標簽和包裝插頁用以提供試劑盒的使用說明。還可包括符合用戶需要的其它材料，如微量滴定板等。在用于結核分枝桿菌感染檢測的試劑盒中，本發明的蛋白也可以是經過標記的。具體可使用酶、金屬螯合物等標記。優選的標記性酶例如，辣根過氧化物酶，過氧化物酶，堿性磷酸酶等。優選的金屬物質有膠體金等。(四)有益效果與市場上的同類試劑盒相比，本發明的結核分枝桿菌蛋白制備的檢測試劑盒具有特異性強、靈敏度高等優點，很好的滿足了 TB感染臨床診斷的需要。
圖IPCR擴增產物的凝膠電泳圖；圖2是表達質粒pET_28a—ricR-rpoB-GyrB的構建流程圖；圖3是誘導后菌體12% SDS — PAGE電泳圖，其中M表示Marker，I表示目的蛋白。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的保護范圍。
實施例I結核重組蛋白的制備I. I結核蛋白抗原表位篩選及目的基因克隆通過計算機分析TB H37RV基因組全序列，選擇其強抗原表位ricR蛋白(GenBank:⑶726749. I)、rpoB (GenBank:GQ395623. I)和 GyrB (GenBank:AJ564417. I)的DNA序列為模板，設計擴增引物為riCR擴增引物FlATCGCATATG ATGACAGCAGCACACGGCTACACGCAGCA53. 85% Tm=66. 34RlAATCGCGCGCCTGGTTCGTTCCGGTGGTGGTGGTTGTTCTCGA60. 47% Tm=67. 79rpoB擴增引物F2 GGTGGTGGTGGTTGTTCTCGACCGCGCTT62. 07% Tm=61. 06R2: AGTCACCACCACCACCTCGCGGTTGTTCTGGATCAAA54. 05%, Tm=65. 51GyrB擴增引物F3 GGTGGTGGTGGTGACTCGGCCGGCGGTTCTGCAAAAA62. 16% Tm=65. 54R3 ATCGCTCGAG GTTCTTTAGCACCCGGTCGAT53. 13% Tm=62. 97結核分支桿菌H37RV的菌體，加IOOmL蛋白酶K (10mg/mL),置56°C水浴消化4小時，用常規酚/氯仿法純化，用上述引物進行PCR擴增；50mL 擴增體系ddH20 31. 5mL, IOXbuffer 5. OmL，4X dNTP4. OmL，上、下游引物混液共 4. OmL, DNA I. 5mL, Taqplus 0. 2mL (IU)；Fl和Rl用于擴增ricR基因的片段，F2和R2用于擴增rpoB基因的片段，F3和R3用于擴增GyrB基因的片段；引物Fl和R3分別帶有NdeI和XhoI的酶切位點，引物F2和Rl順序互補，并共同對應于rpoB基因片段的5’末端序列，引物F3和R2順序互補，并共同對應于GyrB基因片段的5’末端序列。以結核分支桿菌H37RV (購自中國藥品生物制品檢定所)基因組為模板，以引物Fl和Rl擴增ricR基因的片段，以引物F2和R2擴增rpoB基因的片段，以引物F3和R3擴增GyrB基因的片段。
產物經瓊脂糖凝膠電泳純化后切割，將含DNA條帶的膠塊按DNA快速純化試劑盒(購自六合通-北京 TAKARA 公司，產品名稱TAKARA MiniBEST Plasmid purification)說明回收DNA。然后再以ricR和GyrB基因片段為模板用連接PCR擴增ricR、rpoB和GyrB融合基因，中間以4個Gly (ggtggtggtggt)連接；即以第一輪PCR擴增得到的ricR目的DNA片段和rpoB目的DNA片段為模板，加入引物Fl和R2，擴增ricR-rpoB目的DNA片段；以第二輪PCR擴增得到的ricR-rpoB和以第一輪PCR擴增得到的GyrB目的DNA片段為模板，加入引物Fl和R3，擴增ricR-rpoB-GyrB目的DNA片段；得到完整的結核分枝桿菌重組融合蛋白DNA重組片段licR-rpoB-GyrB ;擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如附圖I所示。質粒DNA 和 ricR-rpoB-GyrB 均經內切酶切，5OmL 體系10x buffer5. OmT,, DNA12mL，Xho I和Nde I各15U，ddH20補至50mL ;37°C水浴6h。50mL酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，切割DNA條帶瓊脂塊，并按DNA快速純化試劑盒說明回收DNA。將融合基因片段克隆至pET_28a質粒(具有Xho I和Nde I酶切位點，購自華美生物公司)，20mL 連接體系ddH2015.0m，10x buffer 2. OmL, PET_28a 2. OmL, Pab I. OmL,T4DNA連接酶20U ;質粒自身連接對照，20mL連接反應體系ddH20 16. OmL, IOx buffer2. OmL, PET-28a2. OmL, T4DNA連接酶20U ;按上述加樣后，混勻、稍離心，14°C _16°C連接過夜；轉化E. coli涂平板(含有15微克/毫升卡那霉素的LB固體培養基)并挑克隆提質粒測序，確定序列正確的克隆。重組質粒的酶切(Ndel/Xhol)電泳圖如附圖2所示。I. 2產物測序測序引物為F1和R3及T7promoter和ITterminator的通用引物。所有擴增引物和測序引物的合成以及重組質粒序列pET-28a-ricR-rpoB-GyrB的測定都由華大基因公司提供服務。測得目的融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。I. 3結核分枝桿菌重組融合蛋白的表達、純化將驗證正確克隆的質粒(pET-28a_ricR-rpoB-GyrB ),轉化大腸桿菌BL21 (DE3 )(購自華美生物公司)宿主菌，目的蛋白在包含體內進行表達將含有ricR-rpoB-GyrB基因的BL21 (DE3)宿主菌培養到OD 0.6，用終濃度ImM IPTG誘導表達，4小時之后收集菌體、超聲破碎、高速離心、收集沉淀。對收集的沉淀用Ni柱(Pharmcia公司chelating sephrosefast flow)進行純化，用如下溶液洗脫300mM 咪唑，20mM Tris,500Mm NaCl，8M Urea。ricRa、rpoBa和GyrB融合基因表達蛋白共257個氨基酸,氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。I. 4結核分枝桿菌重組融合蛋白鑒定1.4. I純度和分子量的測定經SDS— PAGE電泳檢測(蛋白上樣量IOii g)，為單一區帶，薄層掃描鑒定純度為95. 8%。分子量約為29Kd，檢測結果見附圖3。I. 4. 2濃度測定經Folin-酚法測定，以牛血清白蛋白作為標準參比品，抗原蛋白濃度為 3. 5±0. 12mg/mL。1.4.3活性測定用間接ELISA方法測定。包被量2. 0 y g/孔，使用內部質控血清測定OD值，結果見表I。表I結核分枝桿菌重組融合蛋白活性測定結果權利要求
1.一種編碼結核分枝桿菌蛋白的重組核酸，其序列如SEQ ID NO. I所示。
2.一種結核分枝桿菌蛋白，其特征在于它由權利要求I所述的重組核酸編碼，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一種含有權利要求I所述核酸的結核分枝桿菌蛋白的表達載體，其特征在于它是將權利要求I所述的重組核酸序列插入到質粒pET-28a上得到的重組質粒pET-28a~ricR-rpoB-GyrB。
4.一種表達結核分枝桿菌蛋白的工程菌株，其特征在于它含有權利要求3所述的表達載體pET-28a-ricR-rpoB-GyrB,宿主菌為大腸桿菌。
5.一種檢測結核分枝桿菌感染的試劑盒，其特征在于其組分中的抗原是根據權利要求2所述的重組結核蛋白。
6.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于抗原包被量為2.Oyg/孔，酶標二抗使用濃度為4mg/ml。
7.權利要求2所述的結核分枝桿菌蛋白在制備檢測試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明提供一種結核分枝桿菌重組蛋白質及其制備方法，涉及基因工程技術和診斷試劑、疫苗研制領域。本發明涉及一種可用于結核分枝桿菌感染臨床診斷的結核分枝桿菌融合蛋白，編碼該蛋白的核苷酸序列，包括該核苷酸序列的質粒和原核宿主細胞，本發明還包括制備該蛋白的方法的及其應用。該重組蛋白質具有高特異性、強免疫原性蛋白質序列，可提高檢測試劑的敏感性和特異性，且該重組蛋白質采取了多抗原決定簇串聯的重組蛋白質技術，可以簡化提純過程，提高工作效率。
文檔編號C07K14/35GK102757971SQ20121027871
公開日2012年10月31日 申請日期2012年8月7日 優先權日2012年8月7日
發明者吳純, 孫彬, 孟祥紅, 楊采娥, 王迪, 董梅, 雷紅 申請人:中國人民解放軍第三O九醫院