專利名稱：從藻類中分離制備食用級藻藍蛋白的方法
技術領域：
本發明屬于蛋白質工程領域，具體涉及一種從藻類中分離制備食用級藻藍蛋白的方法。
背景技術：
藻類中的藻藍蛋白作為蛋白存儲單位，具有明顯的抗氧化、抗炎癥、增強機體免疫能力作用，抗輻射等活性。藻藍蛋白分離純化后，成為高度熒光性的蛋白質，可作為熒光探針。現有的藻藍蛋白的分離純化工藝主要包括沉淀、離心、透析、層析等過程，這一系列的方法開展困難且昂貴，并且得到的純度也不高，只適用于實驗室制備藻藍蛋白。Ganapathi Patil報道了一種純化C-藻藍蛋白簡單有效的新方法,其中包括雙水相萃取和離子交換色譜兩個步驟。使用高壓均質法提取粗蛋白，經過高速離心后取上清 液，在雙水相萃取中，使用聚合體-無機鹽體系，聚合度4000的聚乙二醇和磷酸鉀溶液作為兩相，體積比為0.8，在pH6.0的條件下使得純度為I. 18的粗提液，經過一次萃取后純度上升到了 3. 52，而經過3次萃取后純度達到了 4. 05 (Ganapathi Patil，K. S. M. S.Raghavarao. Aqueous two phase extraction for purification of C-phycocyanin [J]
.Biochemical Engineering Journal ,2007,34:156 - 164.)。Ruperto Bermejo等使用陰離子表面活性劑Aerosol 0T(丁二酸_2_乙基己基酯磺酸鈉，簡稱A0T)通過熒光光譜研究C-藻藍蛋白在水/AOT/異辛烷的溶解特性。結果顯示，當WtlM(Fc)時C-藻藍蛋白溶解于反膠團中。制得的溶解于非極性溶劑中的藻藍蛋白可以替代合成燃料用于食品和化妝品中(Ruperto Bermejo, Eva M. Talavera, Carmen delValle,et al. C-phycocyanin incorporated into reverse micelles: a fluorescence study[J] . Colloids and Surfaces B: Biointerfaces，2000，18 :51 - 59.)。劉楊研究了 CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)/正戊醇-正辛烷反膠團溶液萃取分離螺旋藻藻藍蛋白的性能。結果表明0. 04 mol/L CTAB/正戊醇-正辛烷(體積比1:4)的反膠團體系用于萃取PH7.0，包含0. I mol/L KCl的螺旋藻細胞破碎液，藻藍蛋白萃取率可達96. 3%;采用pH5. 0，包含2 mol/L KBr的反萃液反萃取藻藍蛋白，反萃取率可達90. 6%(劉楊，王雪青，龐廣昌.反膠團萃取分離螺旋藻藻藍蛋白[J].天津科技大學學報，2008，6 (2) :30-33.)。Pertti J. Viskari等人利用3% 3_[3_ (膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸(Chaps)和0. 3%氮成穴大豆蛋白提取藻膽蛋白，提取率達到85%以上，并且提取全過程在3小時內完成，其產物經過毛細管電泳激光誘導熒光檢測，得到了很好的效果(Pertti J.Viskari,Christa L. Colyer. Rapid extraction of phycobiliproteins from culturedcyanobacteria samples [J] . Analytical Biochemistry, 2003, 319 :263 - 271.X張厚森通過實驗室自制羥基磷灰石色譜柱對藻藍蛋白進行吸附，并通過梯度洗脫和透析脫鹽，得到了純度為2. 83的藻藍蛋白。而經過兩次HA柱的藻藍蛋白純度達到4. 21，總回收率為38. 1% (張厚森.鈍頂螺旋藻藻藍蛋白的提取分離及穩定性研究[D].江蘇江蘇大學，2005)。以上分離制備方法存在缺陷ー則可能產生較多的非食用的添加物質；ニ則分離純化過程中樣品的損失也較大，造成產量過低；另外大量的溶劑洗脫和柱分離，使分離成本大幅度提高，難以實現規模化生產。
發明內容
為了克服現有技術提取藻類藻藍蛋白產量低、成本高的不足，本發明提供了ー種從藻類中分離制備食用級藻藍蛋白的方法。本發明采取的技術方案如下
ー種從藻類中分離制備食用級藻藍蛋白的方法，所述方法的步驟包括在低溫下采用 超聲波輔助提取技術處理藻類植物，以蛋白提取緩沖溶液提取藻類蛋白，得到粗提液；然后將粗提液PH調至酸性、靜置、清液離心，取上清液調節pH至中性；或將粗提液pH調至酸性、靜置后膜過濾，得濾液；再噴霧干燥，得到食用級藻藍蛋白。所述在低溫下采用超聲波輔助提取技術處理藻類植物的溫度條件是0°C -40°c。所述超聲波輔助提取技術的條件為超聲功率為50W-200 W，提取時間為5_30min。所述超聲宜工作時間4 S，間隔時間2 S。所述蛋白提取緩沖溶液為O. 05、. 15 mol/L、pH為6. 0-8. O的磷酸鹽、醋酸鹽或乳
酸鹽緩沖溶液。所述將粗提液pH調至酸性，其中酸性pH為3. 5-6. 0，采用的酸度調節劑為食用級酸類。這里的食用級酸類包括食用級鹽酸、檸檬酸、磷酸等。所述清液離心采用低溫離心，溫度為4_6°C，離心カ為8000_12000Xg。所述膜過濾采用的膜的孔徑大小為O. 20 μ m_0. 45 μ m。所述藻類植物為螺旋藻。本發明在傳統的蛋白質分離基礎上，通過添加食品添加劑級的緩沖液和pH調節齊U，采用低溫離心的方式或者超濾膜過濾的方式，首次得到藻藍蛋白純度A62tlA28tl > O. 70,藻藍蛋白回收率為45%以上的藻類色素蛋白復合物。這樣不僅可以提高產品中藻藍蛋白的純度，而且產品具有食用安全性，并且省略了柱層析的復雜、繁瑣步驟，節約了生產成本。本發明方法中的藻藍蛋白提取方式得到的產品純度高，大大簡化了分離步驟，操作簡單，降低成本，藻藍蛋白的性質穩定。
具體實施例方式實施例I
選取磷酸氫ニ鈉-檸檬酸鈉、磷酸氫ニ鈉-磷酸ニ氫鈉、磷酸氫ニ鈉-檸檬酸、磷酸氫ニ鈉-磷酸ニ氫鉀等磷酸鹽緩沖體系，配制成PH7. O以及濃度為O. 15 mo I/L的緩沖液。稱取新鮮螺旋藻10. O g，分別加入100 mL緩沖液，使用200 w功率超聲破碎5 min，工作時間4 S，間隔時間2 S。處理后的料液在5°C低溫條件下高速離心10 min后吸取上清液，使用食用級磷酸溶液調節提取液至PH3. 5—4. 5，靜置I h后，再高速離心10 min吸取上清液。離心后的沉淀中加入1/4上清液體積的緩沖液中充分溶解，離心后收集上清液，和原上清液合并，得到的溶液進行噴霧干燥，干燥粉冷藏儲存。干燥粉的藻藍蛋白純度A62tlA28tl > O. 70，藻藍蛋白回收率達到45%以上。實施例2
選取醋酸鹽緩沖體系，配制成pH6. 0以及濃度為0. 05 mol/L的緩沖液。稱取新鮮螺旋藻10.0 g，分別加入IOmL緩沖液，使用50 w功率超聲破碎30 min，工作時間4 S，間隔時間2 S。處理后的料液在4°C低溫條件下高速離心10 min后吸取上清液，使用食用級檸檬酸溶液調節提取液至PH5. 5-6. 0，靜置I h后，上清液采用膜孔徑大小為0. 45 y m的濾膜過濾，得到的溶液進行噴霧干燥，干燥粉冷藏儲存。干燥粉的藻藍蛋白純度A62tlA28tl > 0.70，藻藍蛋白回收率達到45%以上。實施例3
選取乳酸鹽緩沖體系，配制成PH8.0以及濃度為0. I mol/L的緩沖液。稱取新鮮螺旋藻10. 0 g，分別加入100 mL緩沖液，使用100 w功率超聲破碎20 min，工作時間4 S，間隔 時間2 S。處理后的料液在6°C低溫條件下高速離心10 min后吸取上清液，使用食用級HCl溶液調節提取液至PH4. 5—5. 5，靜置I. 5 h后，再高速離心10 min吸取上清液。離心后的沉淀中加入緩沖液充分溶解,再次離心后收集上清液,和原上清液合并,使上清液調節至中性，得到的溶液進行噴霧干燥，干燥粉冷藏儲存。干燥粉的藻藍蛋白純度A62tlA28tl > 0.70，藻藍蛋白回收率達到45%以上。以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
權利要求
1.一種從藻類中分離制備食用級藻藍蛋白的方法，其特征在于所述方法的步驟包括在低溫下采用超聲波輔助提取技術處理藻類植物，以蛋白提取緩沖溶液提取藻類蛋白，得到粗提液；然后將粗提液PH調至酸性、靜置、清液離心，取上清液調節pH至中性；或將粗提液PH調至酸性、靜置后膜過濾，得濾液；再噴霧干燥，得到食用級藻藍蛋白。
2.根據權利要求I所述的從藻類中分離制備食用級藻藍蛋白的方法，其特征在于所述在低溫下采用超聲波輔助提取技術處理藻類植物的溫度條件是0°C _40°C。
3.根據權利要求I所述的從藻類中分離制備食用級藻藍蛋白的方法，其特征在于所述超聲波輔助提取技術的條件為超聲功率為50W-200 W，提取時間為5-30 min。
4.根據權利要求I所述的從藻類中分離制備食用級藻藍蛋白的方法，其特征在于所述蛋白提取緩沖溶液為0. 05、. 15 mol/L、pH為6. 0-8. 0的磷酸鹽、醋酸鹽或乳酸鹽緩沖溶液。
5.根據權利要求I所述的從藻類中分離制備食用級藻藍蛋白的方法，其特征在于所述將粗提液PH調至酸性，其中酸性pH為3. 5-6. 0，采用的酸度調節劑為食用級酸類。
6.根據權利要求I所述的從藻類中分離制備食用級藻藍蛋白的方法，其特征在于所述清液離心采用低溫離心，溫度為4-6°C，離心力為8000-12000 X g。
7.根據權利要求I所述的從藻類中分離制備食用級藻藍蛋白的方法，其特征在于所述膜過濾采用的膜的孔徑大小為0. 20 V- m-0. 45 u m。
8.根據權利要求I所述的從藻類中分離制備食用級藻藍蛋白的方法，其特征在于所述藻類植物為螺旋藻。
全文摘要
本發明屬于蛋白質工程領域，具體涉及一種從藻類中分離制備食用級藻藍蛋白的方法。所述方法的步驟包括在低溫下采用超聲波輔助提取技術處理藻類植物，以蛋白提取緩沖溶液提取藻類蛋白，得到粗提液；然后將粗提液pH調至酸性、靜置、清液離心，取上清液調節pH至中性；或將粗提液pH調至酸性、靜置后膜過濾，得濾液；再噴霧干燥，得到食用級藻藍蛋白。本發明克服現有技術提取藻類藻藍蛋白產量低、成本高的不足，首次得到藻藍蛋白純度A620/A280>0.70，藻藍蛋白回收率為45%以上的藻類色素蛋白復合物。這樣不僅可以提高產品中藻藍蛋白的純度，而且產品具有食用安全性，并且省略了柱層析的復雜、繁瑣步驟，節約了生產成本。
文檔編號C07K1/14GK102731645SQ20121024691
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月17日 優先權日2012年7月17日
發明者傅紅, 閆巖 申請人:福州大學