專利名稱：固相合成胸腺肽α1的11肽階段的缺失肽、非肽雜質及檢測方法
技術領域：
本發明涉及固相合成胸腺肽α I中的缺失肽、非肽雜質及檢測方法，尤其涉及固相合成胸腺肽α I的11肽階段的缺失肽、非肽雜質及檢測方法，屬于固相合成胸腺肽α I領域。
背景技術：
胸腺肽α I是從胸腺素組分5 (TF-5)中分離出的一種活性多肽，由28個氨基酸殘基組成，分子量為3108.37。在TF-5中，胸腺肽α I的含量為0.6%，是人體胸腺激素的重要活性組分。例如胸腺肽α I可調節T淋巴細胞發育、分化和成熟。此外，胸腺肽α I能修復受損的T淋巴細胞。雖然從TF-5中分離的胸腺肽α I無明顯毒副反應，但由人工固相合成的市售胸腺肽αI可因不純而造成不良反應。目前，人工固相合成胸腺肽αI的操作規程千篇一律，幾乎沒有優化空間。市售的保護氨基酸和相關試劑的純度也足以支持人工固相合成高純度胸腺肽α 。在操作規程不出差錯的前提下，人工固相合成的胸腺肽α I是否純，取決于它含的缺失肽的狀況。與小分子藥物不同，多肽的生物活性非常強。在人工固相合成的胸腺肽α I中，SP使存在微量的缺失肽也可造成嚴重的毒副作用。控制人工固相合成的胸腺肽α I的質量的關鍵是控制缺失肽。目前國內外既沒有披露人工固相合成的胸腺肽α I中的缺失肽狀況，也沒有公開測定人工固相合成的胸腺肽α I中的缺失肽的方法。這種狀態不適應胸腺肽α I的臨床地位。為了改善這種狀況，保障胸腺肽α I的臨床用藥安全性，形成了本發明。
發明內容
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本發明的目的之一是提供一種能夠準確、靈敏的檢測固相合成胸腺肽α I的11肽階段是否含有缺失肽或非肽雜質的方法；本發明的另一個目的是提供固相合成胸腺肽α I的11肽階段的缺失肽譜；本發明的目的之三是將固相合成胸腺肽α I的11肽階段的缺失肽譜應用于胸腺肽α I固相合成中的質量控制。本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的:一種檢測固相合成胸腺肽α I的11肽階段是否含有缺失肽或非肽雜質的方法，包括以下步驟:將固相合成胸腺肽α I的11肽階段樣品采用LC/MS聯用儀進行梯度洗脫獲取離子流譜；如果所獲取的離子流譜在4.44min時出現峰面積為9.46%的峰或在14.86min時出現峰面積分別為8.19%的峰、則說明固相合成胸腺肽α I的11肽階段中含有缺失肽；如果所獲取的離子流譜在22.64min min時出現峰面積為0.91 %的峰，則說明固相合成胸腺肽α I的11肽階段中含有非肽雜質。本發明所述的胸腺肽α I的11肽的氨基酸序列為SEQ ID N0.1所示。所述的梯度洗脫優選為用0.1%甲酸/乙腈梯度洗脫，流速為0.4ml/min，梯度為:0-5min, 0.1% 甲酸 / 乙臆=97/3 ；5-30min, 0.1% 甲酸 / 乙臆=75/25。本發明方法中LC/MS聯用儀中的LC采用Agilent 1200自動進樣，Waters XterraRP18分析柱的規格為5 μ m，3.0 X 150mm ；LC/MS聯用儀中的MS采用Bruker SolatixFT-1CR-MS，離子流檢測器。本發明進一步提供了固相合成胸腺肽α I的11肽階段的缺失肽譜，其氨基酸序列為 SEQ ID N0.2 或 SEQ ID N0.3 所示；本發明所提供的缺失肽譜或非肽雜質作為胸腺肽α I固相合成中的質量控制物，應用于提高固相合成胸腺肽α I的質量或純度。本發明方法可以準確、靈敏的鑒別出固相合成胸腺肽α I的11肽階段是否含有缺失肽或非肽雜質，可以有效地保障和控制胸腺肽α I的質量，在制備高純度固相合成胸腺肽α I中有重要應用價值。
圖1 胸腺妝 α I 十一妝片段 Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 的
離子流。圖2 胸腺妝 α I 十一妝片段 Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 的質譜。圖3 胸腺妝 α I 十一妝片段缺失妝 Glu-Lys-Lys-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn的質譜。圖4 胸腺 肽 α I 的^^一肽片段缺失肽 Glu-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn的質譜。圖5與胸腺肽α I的十一肽片段共存的非肽雜質的質譜。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例1固相合成胸腺肽α I1.制備 Fmoc-Asn (Trt)-Wang Resin稱取IOg (3.lmmol) Wang Resin置于固相反應合成柱中。加入60ml DCM溶脹樹脂lOmin，抽走DCM。用DMF洗樹脂三次，每次50ml，吹氣兩分鐘，抽走溶劑。于磨口三角瓶中稱取 5.5g(9.3mmol)Fmoc-Asn(Trt)和 1.38g(10.23mmol)HOBt，加入 50ml DMF 溶解。在冰水浴中冷卻下加2.15ml (13.95mmol)DIC活化5min。將活化后的氨基酸加入用DMF洗好的樹脂中，然后加入0.23g(1.86mm0l)DMAP，用氮氣吹氣進行攪拌，室溫反應2-4h。反應結束后用DMF洗樹脂三次，每次50ml，吹氣兩分鐘，抽干溶劑。取少量樹脂，用甲醇收縮三次,真空干燥至恒重，測替代值，如替代值達到預期，將樹脂用乙酸酐封閉未反應的羥基，封閉反應2-4h后，用DMF洗樹脂三次，每次50ml，吹氣兩分鐘，抽走溶劑。用甲醇收縮樹脂三次，每次50ml,吹氣5min,抽走溶劑,真空干燥至恒重,測替代值。如替代值達到預期。
2.Fmoc-Asn (Trt) -Wang Resin 的溶脹和脫 Fmoc上面得到的Fmoc-Asn(Trt)-Wang Resin并置于固相反應合成柱中，加60mlDCM溶脹lOmin，然后抽走DCM。用DMF洗滌樹脂，每次用50ml DMF，每次洗2min，共洗三次。用濃度為20 %的piperidine的DMF溶液脫Fmoc，共脫兩次，每次50ml，一次脫3min，另一次脫8min。然后用DMF洗滌樹脂，每次用50mlDMF洗2min，共洗四次。最后用DCM洗滌Asn (Trt)-Wang Resin，每次洗2min，共洗兩次。抽走溶劑。樹脂對節三酮顯黃色。3.制備 Glu (OtBu)-Asn (Trt)-Wang Resin稱取2.12g(4.98mmol) Fmoc-Glu (OtBu)和 0.74g(5.5mmol)H0Bt 于干燥磨 口三角瓶中，用50ml DMF溶解，溶液置冰浴冷卻。加1.15ml (7.47mmol)DIC活化5min。然后將活化后的氨基酸加到上面得到的Asn(Trt)-Wang Resin中反應2h。抽走反應液。用DMF洗搽樹脂，每次用50ml DMF，每次洗2min，共洗三次。樹脂對茚三酮不顯色。用濃度為20%的piperidine的DMF溶液脫Fmoc，共脫兩次，每次50ml，第一次脫3min，第二次脫8min。然后用DMF洗滌樹脂，每次用50ml DMF洗2min，共洗四次。最后用DCM洗滌樹脂，每次洗2min，共洗兩次。抽走溶劑。樹脂對茚三酮顯黃色。4.制備Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Ala-Ala-Val-Asp (OtBu) -Thr (tBu) -SertBu) -Ser (tBu) -GIu- (OtBu) -1le-Thr (tBu) -Thr (tBu) -Lys (Boc) -Asp (OtBu) -Leu-Lys (Boc) -Glu (OtBu) -Lys (Boc)-Lys (Boc)-Glu (OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-WangResin按照制備Glu (OtBu) -Asn (Trt) -Wang Resin 的方法依次將 1.55g (4.98mmol)Fmoc-Ala，2.12g(4.98mmol)Fmoc-GIu (OtBu)，2.12g (4.98mmol)Fmoc-GIu (OtBu)，
2.53g (7.47mmoI)Fmoc-Val,2.53g (7.47mmoI)Fmoc-Val,3.17g (7.47mmoI)Fmoc-Glu (OtBu)，3.50g (7.47mmoI)Fmoc-Lys (Boc)，4.67g (9.96mmol)Fmoc-Lys (Boc)，
4.23g (9.96mmol) Fmoc-Glu (OtBu)，4.67g (9.96mmol) Fmoc-Lys (Boc)，3.52g (9.96mmol)Fmoc-Leu, 4.09g(9.96mmoI) Fmoc-Asp (OtBu)，4.67g(9.96mmol)Fmoc-Lys (Boc)，
3.96g (9.96mmol) Fmoc-Thr (tBu)，3.96g (9.96mmol) Fmoc-Thr (tBu)，3.52g (9.96mmol)Fmoc_Ile，3.17g(7.47mmol)Fmoc-Glu(OtBu)，2.86g (7.47mmol)Fmoc-SertBu)，
2.86g(7.47mmol)Fmoc-SertBu)，2.97g(7.47mmol)Fmoc-Thr(tBu)，3.07g (7.47mmol)Fmoc-Asp (OtBu)，2.53g (7.47mmoI)Fmoc-Val,2.32g (7.47mmoI)Fmoc-Ala,
3.1Og (9.96mmol)Fmoc-Ala，4.09g(9.96mmol)Fmoc-Asp (OtBu)和 3.81 g (9.96mmol)Fmoc-Ser (tBu)偶聯到 Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Wang Resin 上并脫 Fmoc。5.制備Ac-Ser (tBu)-Asp (OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp (OtBu)-Thr (tBu)-Ser (tBu)-Ser (tBu) -Glu-(OtBu) -1le-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys (Boc)-Glu (OtBu)-Lys (Boc)-Lys (Boc)-Glu (OtBu)-Val-Val-Glu (OtBu)-Glu (OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-WangResin0°C下將1.18ml(12.45mmol)乙酸酐于干燥磨口三角瓶中與50ml DMF混合，然后加 0.44ml (2.49mmol) DIPEA 活化 5min。將活化后的乙酸酐與 Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-1le-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys-(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-GIu- (OtBu) -Glu (OtBu) -Ala-Glu (OtBu) -Asn (Trt) -ffang Resin 反應 2h。抽走反應液。樹脂用DMF洗滌4次，每次50ml DMF,每次洗2min。樹脂用DCM洗滌2次，每次用50ml DCM,每次洗3min。抽走溶劑。樹脂對茚三酮不顯色。樹脂用MeOH收縮3次，每次用50ml MeOH,每次收縮5min，抽干。得18.5g干燥肽樹脂。低溫保存。6.從Ac-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu) -Glu-(OtBu) -1le-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys (Boc)-Glu (OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu (OtBu)-Asn(Trt)-WangResin 切割胸腺肽 α I0°C下將18.5g干燥的肽樹脂與180ml裂解液(TFA/TIS/H20)反應0.5h，室溫反應2.5h。反應結束后，用砂芯漏斗過濾分離樹脂。樹脂用少量TFA洗滌三次。合并的濾液用(TC的1800ml的乙醚沉淀出胸腺肽α I粗品。離心分離出胸腺肽α I粗品。胸腺肽α I粗品用0°C的乙醚洗滌粗肽三次，用N2吹走殘余乙醚，置于真空干燥器干燥至恒重，得6.27g胸腺肽α I粗品，收率為81%，含量為68%。試驗例Fmoc-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu (OtBu) -Asn (Tr t) -ffang Resin 的缺失肽譜的鑒定取少量Fmoc-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu-(OtBu)-Asn (Trt)-Wang Resin不經純化,按照標準方法切割并脫保護。得到的胸腺妝 α I 的十一妝片段Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn在 LC (Agilent1200 自動進樣，Waters Xterra RP18 分析柱，5 μ m, 3.0 X 150mm)/MS (Bruker SolatixFT-1CR-MS，離子流檢測器)聯用儀上進行分析。用0.1 %甲酸/乙腈梯度洗脫，洗脫梯度見表I。離子流譜見圖1。圖1由4個峰構成,它們分別出現在4.44min, 5.85min, 14.86min和22.64min，它們的峰面積分別為9.46%,81.43%,8.19%和0.91%。出現在5.85min的峰的對應的質譜圖見圖2，該離子的質量為1303.69768，是胸腺肽 α I 的^^一肽片段 Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 的理論質量數1302.63033 加 H。出現在4.44min的峰的對應的質譜圖見圖3，該離子的質量為587.81044X2，是胸腺肽 α I i^一肽片段 Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 缺失 Glu 理論質量數 1173.58774 加 2H。出現在14.86min的峰的對應的質譜圖見圖4，該離子的質量為1175.58020，是胸腺妝 α I 的十一妝片段 Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 缺失 Lys 的理論質量數1174.53537加H。出現在22.64min的峰的對應的質譜圖見圖5，該離子的質量為1088.54119，沒有與胸腺肽 α I 的十一肽片段 Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 對應的缺失肽，為非肽雜質。
權利要求
1.一種檢測固相合成胸腺肽α I的11肽階段是否含有缺失肽或非肽雜質的方法，包括以下步驟:將固相合成胸腺肽α I的11肽階段樣品采用LC/MS聯用儀進行梯度洗脫獲取離子流譜；如果所獲取的離子流譜在4.44min時出現峰面積為9.46%的離子流峰或在14.86min時出現峰面積分別為8.19%的離子流峰、則說明固相合成胸腺肽α I的11肽階段中含有缺失肽；如果所獲取的離子流譜在22.64min時出現峰面積為0.91%的離子流峰，則說明固相合成胸腺肽α I的11肽階段中含有非肽雜質。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的胸腺肽αI的11肽的氨基酸序列為 SEQ ID N0.1 所示。
3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的梯度洗脫為用0.1 %甲酸/乙腈梯度洗脫，流速為0.4ml/min,梯度為:0-5min,0.1%甲酸/乙腈=97/3 ；5-30min,0.1%甲酸/ 乙腈=75/25。
4.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:所述LC/MS聯用儀中的LC采用Agilent1200自動進樣，Waters Xterra RP18分析柱的規格為5 μ m，3.0X 150mm ;LC/MS聯用儀中的MS 米用 Bruker Solatix FT-1CR-MS,離子流檢測器。
5.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:所述缺失肽的氨基酸序列為SEQID N0.2或 SEQ ID N0.3 所示。
6.固相合成胸腺肽αI的11肽階段中的缺失肽譜，其特征在于:其氨基酸序列為SEQID N0.2 或 SEQ ID N0.3 所示。
7.權利要求6所述的缺失肽譜作為質量控制物提高固相合成胸腺肽αI的質量或純度中的應用。
全文摘要
本發明公開了固相合成胸腺肽α1的11肽階段的缺失肽、非肽雜質及檢測方法。所述檢測方法包括將固相合成胸腺肽α1的11肽階段樣品采用LC/MS聯用儀進行梯度洗脫獲取離子流譜；如果所獲取的離子流譜在4.44min時出現峰面積為9.46％的峰或在14.86min時出現峰面積分別為8.19％的峰、則說明固相合成胸腺肽α1的11肽階段中含有缺失肽；如果所獲取的離子流譜在22.64minmin時出現峰面積為0.91％的峰，則說明固相合成胸腺肽α1的11肽階段中含有非肽雜質。本發明可準確、靈敏的鑒別出固相合成胸腺肽α1的11肽階段是否含有缺失肽或非肽雜質，可有效保障和控制胸腺肽α1的質量或純度。
文檔編號C07K7/06GK103163234SQ20121023951
公開日2013年6月19日 申請日期2012年7月12日 優先權日2012年7月12日
發明者朱正兵, 彭濤, 王玲, 張金花 申請人:海南合瑞制藥股份有限公司