專利名稱：利用濾膜和樹脂制備桑葉1-脫氧野尻霉素提取物的方法
技術領域：
本發明涉及一種中藥有效成分分離技術領域，特指一種利用膜分離技術與樹脂法富集純化桑葉中I-脫氧野尻霉素(DNJ)，制備桑葉I-脫氧野尻霉素提取物的方法。
背景技術：
桑葉，中醫又稱鐵扇子，是植物桑(Morus albaL.)的葉。始載于《神農本草經》，味苦、甘，性寒，歸肺、肝經，具有疏風清熱、平肝明目的功效。歷代中醫藥書籍中記載桑葉能夠治療消渴癥，近代醫家也常將桑葉用于治療糖尿病，且取得滿意療效。現代藥理研究證明桑葉多輕基哌唳類生物堿中的I-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin, DNJ)具有高效、廣泛 的藥理作用，它可以競爭性抑制a-酸性葡萄糖苷酶，具有降血糖作用，對糖尿病及其并發癥有著較顯著的療效。此外，其還有抑制腫瘤轉移、抗病毒等作用。經檢索，現有專利中，CN1579445A的發明專利是通過加入絮凝劑再醇沉得到桑葉提取物，DNJ含量I. (T3. 0% ；CN1175818C的發明專利是通過絮凝、柱層析分離精制，得到較高含量的桑葉浸膏，其中DNJ含量大于浸膏總重的50% ；CN101020655A的發明專利不使用絮凝劑，通過在桑葉提取液加無機酸酸化處理，冷卻除雜，再經柱層析，所得桑葉提取物中DNJ的含量大于10%。檢索到采用膜分離技術分離桑葉中DNJ的專利只有兩條專利CN102190615A的發明專利使用了超濾法，通過將桑葉酶解、堿醇提取得到提取液，經酸溶、超濾得到超濾液，再經陽離子、大孔吸附樹脂柱層析后用甲醇-飽和氨水混合溶劑結晶，最終DNJ的含量達95%以上；CN 102101840A的發明專利也使用了超濾法，通過用含水溶劑提取桑葉得到提取液，用超濾膜過濾得到超濾液，經酸化、沉淀后過陽離子、大孔吸附樹脂和堿性吸附柱層析，再經常溫結晶和重結晶，最終DNJ的含量可達98. 3%。而采用微濾與超濾再結合多種樹脂技術富集純化桑葉中的DNJ，制備桑葉I-脫氧野尻霉素提取物研究尚未見報道。
發明內容
本發明目的是提供一種利用膜分離技術與樹脂法富集純化桑葉中I-脫氧野尻霉素(DNJ)，使桑葉提取物中的DNJ質量含量達50%左右的方法。本發明采用的技術方案是利用濾膜和樹脂制備桑葉I-脫氧野尻霉素提取物的方法，所述的方法為(I)將干桑葉粉碎，過100目篩，獲得桑葉粉末，將桑葉粉末用去離子水于100°C下回流提取0. 5h，過濾得提取液和濾餅，將濾餅在同樣條件下重復提取0. 5h，過濾，合并所有提取液，將提取液濃縮成浸膏，獲得桑葉水提物浸膏；所述去離子水a與桑葉粉末的質量比為8 : I ;(2)將步驟(I)獲得的桑葉水提物浸膏用去離子水b溶解，過濾，獲得濾液；將濾液在2bar壓力下，用孔徑為0. 2 y m的無機陶瓷膜進行微濾處理，獲得透過液a ;所述去離子水b與桑葉水提物浸膏的質量比為100 : I ；
(3)將透過液a在30bar壓力下，用孔徑為2. 5^10kDa的有機超濾膜進行超濾處理，獲得透過液b;(4)將透過液b濃縮至 原體積的1/19倍，獲得濃縮后的透過液b，將濃縮后的透過液b以0. 5^2倍樹脂體積/h的速度流經大孔吸附樹脂柱，收集流出液a，再用去離子水c以濃縮后的透過液b流經大孔吸附樹脂柱的相同速度洗脫，收集洗脫液a，合并流出液a和洗脫液a，將流出液a和洗脫液a濃縮至原體積的5/6倍，獲得濃縮液a ;所述去離子水c的體積用量為大孔吸附樹脂體積的廣3倍；(5)將濃縮液a以0. 5^2倍樹脂體積/h的速度流經強酸性陽離子交換樹脂柱，再用去離子水d以濃縮液a流經強酸性陽離子交換樹脂柱的相同速度進行過柱，至流出液無色為止，然后用氨水溶液以以濃縮液a流經強酸性陽離子交換樹脂柱的相同速度過柱，收集洗脫液b，將洗脫液b濃縮至原體積的5/6倍，獲得濃縮液b ;所述氨水溶液的體積用量為強酸性陽離子交換樹脂體積的3飛倍；(6)將濃縮液b以0. 5^2倍樹脂體積/h的速度流經強堿性陰離子交換樹脂柱，收集流出液C，再用去離子水e以濃縮液b流經強堿性陰離子交換樹脂柱相同速度過柱，收集洗脫液C，合并流出液c和洗脫液C，將流出液c和洗脫液c濃縮至原體積的1/34倍，獲得濃縮液C，將濃縮液c真空冷凍干燥，獲得所述桑葉I-脫氧野尻霉素提取物；所述去離子水e的體積用量為強堿性陰離子交換樹脂體積的41倍。進一步，步驟(2)所述無機陶瓷膜為Al2O3陶瓷膜(或者ZrO2陶瓷膜)，孔徑為
0.2 u m (或者 0. 5 u m 或 0. 8 u m)。進一步，步驟(3)所述有機超濾膜為聚醚砜膜(也可以是醋酸纖維素膜或聚酰胺膜)，孔徑為 2. 5kDa、3. 5kDa、5kDa 或 IOkDa0進一步，步驟(4)所述大孔吸附樹脂為大孔吸附樹脂DlOl或大孔吸附樹脂AB-8(也可以是大孔吸附樹脂NKA-9)。進一步，步驟(5)強酸性陽離子交換樹脂為強酸性陽離子交換樹脂001X4、強酸性陽離子交換樹脂001 X 7或強酸性陽離子交換樹脂001 X 8 (優選001 X 7強酸性陽離子交換樹脂)。進一步，步驟(5)所述氨水溶液的濃度為0. 3^0. 8mol/L (優選0. 5mol/L的氨水溶液)。進一步，步驟(6)所述強堿性陰離子交換樹脂為強堿性陰離子交換樹脂201X4、強堿性陰離子交換樹脂201X7或強堿性陰離子交換樹脂D201(優選201X7強堿性陰離子交換樹脂)。本發明所述方法制備的DNJ的含量采用高效液相色譜-示差折光檢測法進行測定，色譜分析條件Lumtech (綠綿安特)分析型高效液相色譜儀；Lumtech (綠綿安特)Smartline RI 2300示差折光檢測器；色譜柱:Aglient ZORBAX NH2分析柱(5iim，
4.6mmX250mm);流動相:乙腈-水(70 : 30);流速1. OmL/min ;柱溫25°C ;檢測器溫度25°C。分析結果表明，最終所得產品中DNJ的質量含量為51. 19%，提取率為12. 28%。本發明所述桑葉I-脫氧野尻霉素提取物的應用為降血糖保健品或作為高純度DNJ的制備原料。與現有技術相比，本發明的有益效果主要體現在
(I)本發明所述的方法采用超濾與微濾結合的膜分離技術及樹脂法富集純化桑葉中的DNJ，一次富集純化過程就可使桑葉DNJ提取物中的DNJ含量達到50% (質量分數)左右，工藝簡單，高效；(2)本發明整個工藝過程中，除使用氨水外，未帶入其他外源物質，并且在減壓濃縮過程中可除去；未使用任何有機溶劑，安全、環保；(3)本發明首次采用微濾與超濾膜結合的膜分離技術分離富集桑葉中的DNJ，所得桑葉DNJ提取物中DNJ的質量濃度與桑葉水提物浸膏中DNJ的質量濃度相比，從I. 32%提高到7. 84%，提取率為88. 06%，這表明僅采用膜分離技術就可以除去桑葉水提物浸膏中所有懸浮雜質與部分大分子蛋白質和多糖，使DNJ質量濃度得到較大的提高，并且DNJ的提取率也較高，可作為高純度DNJ生產過程中的一步簡便、有效分離富集方法，適合工業生產； (4)本發明最后采用樹脂柱層析得到了桑葉I-脫氧野尻霉素提取物，所用樹脂均可再生并重復使用，有利于降低工藝的成本。
圖I為DNJ對照品的HPLC圖譜，I為溶劑峰，2為DNJ峰；圖2為實施例I制備的桑葉DNJ提取物的HPLC圖譜，I為溶劑峰，2為DNJ峰；圖3是實施例I中溶劑的HPLC圖譜，I為溶劑峰。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此實施例I(I)將干桑葉粉碎，過100目篩，取桑葉粉末與去離子水按質量比I : 8混合，于100°C下回流提取0. 5h，過濾得提取液和濾餅，將濾餅在同樣條件下再提取0. 5h，合并所有提取液，將提取液濃縮成浸膏，獲得濃縮物50. Og,即桑葉水提物浸膏，桑葉水提物浸膏中DNJ的質量含量為I. 32%。(2)稱取步驟(I)獲得的濃縮物50. 0g，用5L去離子水溶解后配制成濃度為10. Og/L混合液，用脫脂棉作介質抽濾，得濾液5L ;將濾液5L用孔徑為0. 2 y m氧化鋁陶瓷膜在2bar條件下進行微濾澄清處理，收集透過液，并將去離子水加入截留液中再洗脫兩次(即當截留液為3L時(此時得到的透過液為2L)，加入2L去離子水進行洗脫，洗脫完成時，得到透過液2L，而截留液還剩3L，再加入2L去離子水進行洗脫，洗脫完成時，又會得到透過液2L)，收集微濾透過液6L ；(3)將步驟(2)獲得的透過液6L用孔徑為2. 5kDa聚醚砜膜在30bar條件下進行超濾處理，當截留液為SOOmL時，加入SOOmL去離子水進行洗脫，洗脫兩次，收集超濾透過液
7.6L，其中DNJ的質量含量為7. 84% ；(4)將超濾透過液7. 6L減壓濃縮至400mL左右，將濃縮后的超濾透過液以I倍樹脂體積/h的速度通過裝有AB-8大孔吸附樹脂(滄州寶恩吸附材料有限公司)的玻璃層析柱(大孔吸附樹脂的裝柱高度為30cm，玻璃層析柱的直徑為2. 5cm),收集流出液，再用3倍樹脂體積去離子水以I倍樹脂體積/h的速度洗脫，收集洗脫液，合并流出液與洗脫液，減壓濃縮至700mL左右(原體積的5/6倍)，獲得濃縮液700mL ；(5)將步驟(4)獲得的濃縮液700mL以I倍樹脂體積/h流速通過裝有001 X 7強酸性陽離子交換樹脂(杭州雙林化工試劑廠分裝)的玻璃層析柱(強酸性陽離子交換樹脂的裝柱高度為33cm，玻璃層析柱的直徑為I. 7cm)，用去離子水以相同速度(I倍樹脂體積/h流速)過柱，至流出液無色為止，再用4倍樹脂體積、0. 5mol/L氨水溶液以I倍樹脂體積/h洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至250mL左右(原體積的5/6倍)，除去氨水，獲得濃縮液250mL ；(6 )將步驟(5 )濃縮液250mL以I倍樹脂體積/h流速通過裝有201X7強堿性陰離子交換樹脂(杭州雙林化工試劑廠分裝)的玻璃層析柱(強堿性陰離子交換樹脂的裝柱高度為31cm，玻璃層析柱的直徑為I. 7cm)，收集流出液，再用6倍樹脂體積去離子水以I倍樹脂體積/h洗脫，收集洗脫液，合并流出液與洗脫液，減壓濃縮至原體積的1/34倍后真空冷凍干燥，得到的桑葉DNJ提取物，并對桑葉DNJ提取物進行高效液相色譜分析，其中DNJ質量含量為51. 19%，提取率為12. 28%。
將上述桑葉DNJ提取物用體積濃度50%乙腈水溶液溶解，并以DNJ純品(純度^ 99%，陜西方晟生物開發有限公司)作為對照，進行高效液相色譜分析。色譜分析條件Lumtech (綠綿安特)分析型高效液相色譜儀；Lumtech (綠綿安特)Smartline RI 2300示差折光檢測器；色譜柱Aglient ZORBAX NH2分析柱(5 y m,4. 6mmX250mm);流動相乙腈-水(70 30);流速:1. OmL/min ;柱溫25°C ;檢測器溫度25°C。高效液相色譜圖如圖I 圖3所示圖I為DNJ對照品HPLC圖譜(I為溶劑峰，2為DNJ峰)，圖2為上述指標桑葉DNJ提取物的HPLC圖譜(I為溶劑峰，2為DNJ峰)，圖3為溶劑的HPLC圖譜(I為溶劑峰)。實施例2步驟(3)中，使用孔徑為5kDa聚醚砜膜，步驟(5)所述氨水溶液的濃度為0. 3mol/L，其它操作同實施例I。最終得到的桑葉DNJ提取物中DNJ質量含量為46. 52%，提取率為13. 43%o實施例3步驟(3)中，使用孔徑為IOkDa聚醚砜膜,步驟(5)所述氨水溶液的濃度為0. 8mol/L其它操作同實施例I。最終得到的桑葉DNJ提取物中DNJ質量含量為46. 14%，提取率為
13.21%。實施例4步驟(4)中，使用DlOl大孔吸附樹脂(滄州寶恩吸附材料有限公司)，其它操作同實施例I。最終得到的桑葉DNJ提取物中DNJ質量含量為49. 88%，提取率為12. 08%。
權利要求
1.利用濾膜和樹脂制備桑葉I-脫氧野尻霉素提取物的方法，其特征在于所述方法為 (1)將干桑葉粉碎，過100目篩，獲得桑葉粉末，將桑葉粉末用去離子水a于100°C下回流提取0. 5h，過濾得提取液和濾餅，將濾餅在10(TC下回流重復提取0. 5h，過濾，合并所有提取液，將提取液濃縮成浸膏，獲得桑葉水提物浸膏；所述去離子水a與桑葉粉末的質量比為 8 : I ; (2)將步驟(I)獲得的桑葉水提物浸膏用去離子水b溶解，過濾，獲得濾液；將濾液在2bar壓力下，用孔徑為0. 2 y m的無機陶瓷膜進行微濾處理，獲得透過液a ;所述去離子水b與桑葉水提物浸膏的質量比為100 : I ； (3)將透過液a在30bar壓力下，用孔徑為2.5^10kDa的有機超濾膜進行超濾處理，獲得透過液b ； (4)將透過液b濃縮至原體積的1/19倍，獲得濃縮后的透過液b，將濃縮后的透過液b以0. 5 2倍樹脂體積/h的速度流經大孔吸附樹脂柱，收集流出液a，再用去離子水c以濃縮后的透過液b流經大孔吸附樹脂柱的相同速度洗脫，收集洗脫液a，合并流出液a和洗脫液a,將流出液a和洗脫液a濃縮至原體積的5/6倍，獲得濃縮液a ;所述去離子水c的體積用量為大孔吸附樹脂體積的廣3倍； (5)將濃縮液a以0.5^2倍樹脂體積/h的速度流經強酸性陽離子交換樹脂柱，再用去離子水d以濃縮液a流經強酸性陽離子交換樹脂柱的相同速度進行過柱，至流出液無色為止，然后用氨水溶液以濃縮液a流經強酸性陽離子交換樹脂柱的相同速度過柱，收集洗脫液b，將洗脫液b濃縮至原體積的5/6倍，獲得濃縮液b ;所述氨水溶液的體積用量為強酸性陽離子交換樹脂體積的3飛倍； (6)將濃縮液b以0.5^2倍樹脂體積/h的速度流經強堿性陰離子交換樹脂柱，收集流出液C，再用去離子水e以濃縮液b流經強堿性陰離子交換樹脂柱相同速度過柱，收集洗脫液c，合并流出液c和洗脫液C，將流出液c和洗脫液c濃縮至原體積的1/34倍，獲得濃縮液C，將濃縮液c真空冷凍干燥，獲得所述桑葉I-脫氧野尻霉素提取物；所述去離子水e的體積用量為強堿性陰離子交換樹脂體積的41倍。
2.如權利要求I所述利用濾膜和樹脂制備桑葉I-脫氧野尻霉素提取物的方法，其特征在于步驟(2)所述無機陶瓷膜為Al2O3陶瓷膜，孔徑為0. 2 y m。
3.如權利要求I所述的利用濾膜和樹脂制備桑葉I-脫氧野尻霉素提取物的方法，其特征在于步驟(3)所述有機超濾膜為聚醚砜膜，孔徑為2. 5kDa、3. 5kDa、5kDa或lOkDa。
4.如權利要求I所述的利用濾膜和樹脂制備桑葉I-脫氧野尻霉素提取物的方法，其特征在于步驟(4)所述大孔吸附樹脂為大孔吸附樹脂DlOl或大孔吸附樹脂AB-8。
5.如權利要求I所述的利用濾膜和樹脂制備桑葉I-脫氧野尻霉素提取物的方法，其特征在于步驟(5)強酸性陽離子交換樹脂為強酸性陽離子交換樹脂001X7。
6.如權利要求I所述的利用濾膜和樹脂制備桑葉I-脫氧野尻霉素提取物的方法，其特征在于步驟(5)所述氨水溶液的濃度為0. 3^0. 8mol/L。
7.如權利要求I所述的利用濾膜和樹脂制備桑葉I-脫氧野尻霉素提取物的方法，其特征在于步驟(6)所述強堿性陰離子交換樹脂為強堿性陰離子交換樹脂201X7。
全文摘要
本發明公開了一種利用濾膜和樹脂制備桑葉1-脫氧野尻霉素提取物的方法，所述方法是將桑葉水提物浸膏用水溶解后，依次進行微濾、超濾處理，透過液進行大孔吸附樹脂、強酸性陽離子交換樹脂柱和強堿性陰離子交換樹脂柱處理，獲得所述桑葉1-脫氧野尻霉素提取物；本發明采用超濾與微濾結合的膜分離技術及樹脂法富集純化桑葉中的DNJ，工藝簡單，高效，未使用任何有機溶劑，安全、環保；所得桑葉DNJ提取物中DNJ的質量濃度與桑葉水提物浸膏中DNJ的質量濃度相比，從1.32%提高到7.84%，提取率為88.06%。
文檔編號C07D211/46GK102718697SQ201210190238
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月6日 優先權日2012年6月6日
發明者李行諾, 雷偉, 顏繼忠 申請人:浙江工業大學