專利名稱：多肽PyroGlu-Pro-Arg-pNA·HCl的合成的制作方法
技術領域：
本發明涉及多肽合成領域，特別涉及一種多肽發色底物PyroGlu-Pro-Arg-pNA · HCl 的合成方法。
背景技術：
PyroGlu-Pro-Arg-pNA · HCl (S-2366)的多肽部分的結構為三肽加發色基團，是一種血漿活性蛋白C (簡稱APC)和凝血因子XI的發色底物，該底物可用于血漿活性蛋白C活性的定量檢測，在科研和臨床上有著廣泛的應用。現有文獻未見有關S-2366合成的報道，其他相關發色底物的合成文獻中，肽鍵的縮合通常使用疊氮法、活性酷法、混合酸酐法等方法，反應操作較為復雜，收率不高。
精氨酸的胍基具有強親核性和堿性，在多肽合成中須加以保護，常用的保護方法有硝基、芐氧甲酰基保護以及現在固相合成中使用較多的苯磺酰基類(如Pbf)保護等。這些保護基團在脫保護后都需要對底物肽進行鹽類型的轉換，轉變為科研及臨床上使用的鹽酸鹽或者醋酸鹽的形式。目前轉鹽一般是通過過離子交換柱的方式，需要價格昂貴的離子交換介質以及很長的過柱時間，尤其是當制備量較大時更是如此。對硝基苯胺(pNA)，由于硝基的強吸電子作用，親核性非常差，與精氨酸縮合時，一般的酰胺鍵合成方法效果很差，收率很低。
發明內容
針對現有技術的缺陷,本發明提供了一種高收率的PyroGlu-Pro-Arg-pNA *HC1的合成方法，該方法エ藝簡單、成本低，適合大批量生產。為解決上述技術問題，本發明采用了如下方案PyroGlu-Pro-Arg-pNA · HCl的合成方法,包括以下步驟(I)以三氯氧磷為縮合劑，將氨基與胍基均帶有保護基的精氨酸與對硝基苯胺縮合；所述精氨酸的胍基保護基為雙叔丁氧羰基；(2)脫除步驟(I)所得產物的氨基保護基，獲得中間體I ;(3)將焦谷氨酸與羧基帶保護基的脯氨酸縮合；(4)脫除步驟(3)所得產物的羧基保護基，獲得中間體2 ;(5)將所述中間體I和中間體2進行縮合；(6)以HCl或HCl和こ酸こ酯的混合物為脫保護基試劑，脫除步驟(5)所得產物的胍基保護基，獲得 PyroGlu-Pro-Arg-pNA · HCl。上述合成方法中，所述精氨酸的氨基保護基為9-芴甲氧羰基；當以9-芴甲氧羰基為氨基保護基時，步驟(2)所述氨基保護基的脫除試劑為堿。所述脯氨酸的羧基保護基為酷，優選叔丁酯；當以酯(包括叔丁酷)為脯氨酸的羧基保護基時，步驟(4)所述羧基保護基的脫除試劑為酸。上述合成方法中，步驟(I)的反應溫度為-10°C 0°C，優選_5°C。
步驟(I)的反應溶劑為堿性有機溶劑，優選反應溶劑為吡啶。上述合成方法中，步驟(3)和步驟(5)所述縮合反應采用碳ニ亞胺為縮合劑，所述碳ニ亞胺選自N，N’-ニ環己基碳ニ亞胺、N，N-ニ異丙基碳ニ亞胺、I-こ基-(3-ニ甲基氨基丙基)碳酰ニ亞胺鹽酸鹽，優選I-こ基-(3- ニ甲基氨基丙基)碳酰ニ亞胺鹽酸鹽。當采用I-こ基-(3-ニ甲基氨基丙基)碳酰ニ亞胺鹽酸鹽為縮合劑時，在反應時加入HOBt,有助于減少副反應的發生,有效提聞縮合效率。本發明的優選實施路線如下
PNA哌啶 沈- F mo 9|Bocip HhAfs(Boc)^pNA
POCl 3.,·嗽啶
Pro-OlBuTFA
I · pGlia-Pro*CMBupOlu*PffrOH
E *HCVW f
EDC.HDi/HOBf
HCI/ElOAc
pG lu-Pro-Ang-pNA. HCl 丨丨丨·............................................................................................. pGlti* Rro Ar-g(Boc)2-pNA本發明所述合成方法，具有以下特點( I)精氨酸與發色基團(對硝基苯胺)的縮合效率高對硝基苯胺，由于硝基的強吸電子作用，親核性非常差，一般的酰胺鍵合成方法很難縮合成功。本發明采用三氯氧磷作為縮合劑，在低溫下活化精氨酸羧基，然后與對硝基苯胺發生氨解反應，15-30分鐘內即能反應完全，收率在80%以上。溶劑吡啶能夠催化親核進攻反應，提高反應效率，同時能夠保護酸不穩定基團(如Boc)。(2)肽鍵縮合效率高本發明的肽鍵縮合優選碳ニ亞胺型縮合試劑，具有反應條件溫和、后處理簡單、收率較高的特點。更優選卜こ基-(3-ニ甲基氨基丙基)碳酰ニ亞胺鹽酸鹽為縮合試劑，其為水溶性，在反應時加入HOBt，能夠將副反應控制在很低的范圍，有效提高縮合效率。(3)精氨酸胍基保護基的脫保護エ藝簡單，成本低本發明采用雙叔丁氧羰基(bis-Boc)為精氨酸的胍基保護基團，在反應的最后一步，使用HCl或HCl和こ酸こ酯的混合物進行脫保護，脫保護反應溫度較低，發色基團不受影響，產物直接形成底物肽的鹽酸鹽，省去轉鹽步驟，節省了制備時間和成本。與現有技術相比，本發明反應條件溫和，后處理簡單，收率高，終產品收率大于50%,制備成本低,適合大批量制備。
具體實施例方式本發明公開了ー種發色底物PyroGlu-Pro-Arg-pNA *HC1的合成方法,本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進エ藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技木。為了使本領域的技術人員更好地理解本發明的技術方案，下面結合具體實施例對本發明作進ー步的詳細說明。實施例PyroGlu-Pro-Arg-pNA · HCl 的合成(I) Fmoc-Arg (Boc) 2-pNA 的合成往250mL 三ロ燒瓶中加入 25g (41. 9mmoI) Fmoc-Arg(Boc)2-0H>5. 8g (41. Qmmol )對硝基苯胺和125mL吡啶，溶解后降溫至-50C ο控制溫度T彡(TC，滴加7. Ig (46. 3mmol)POCl3,加完后繼續反應15 30min。將反應液轉移入500mL冰水中，加入ニ氯甲烷萃取，有機層依次用水、10%檸檬酸、飽和碳酸氫鈉、飽和食鹽水洗滌，無水Na2SO4干燥，旋干，硅膠柱純化，得微黃色固體25. 5g，收率85%。
收率計算公式收率=產物Fmoc-Arg(Boc)2_pNA摩爾數/原料Fmoc-Arg(Boc)2-OH摩爾數X 100%。(2) H-Arg(Boc)2-pNA往250mL 燒瓶中加入 25. 5g Fmoc-Arg (Boc) 2_pNA 和 300mL DMF,溶解后加入 25mL哌啶，室溫下反應20 30min。往反應液加500mL水，然后用ニ氯甲烷萃取。有機層水洗，至哌唳被洗凈，無水Na2SO4干燥,旋干,加入150mL石油醚攪拌2 3h,過濾，固體用石油醚再打漿一次，過濾，得類白色固體15. 4g，收率88%。收率計算公式收率=產物H-Arg (Boc) 2_pNA 摩爾數 / 原料 Fmoc-Arg (Boc) 2_pNA 摩爾數 X 100%。(3) PyroGlu-Pro-OtBu往250mL 三 ロ 燒瓶中加入 IOg (58. 4mmol) Pro-OtBu, 16. Og (123. 9mmol)PyroGlu-0H、8. 7g(64. 3mmol)H0Bt、IOOmL ニ氯甲烷和 11. 3g(87. 4mmol)DIEA,降溫至 _5°C。加入15. 6g(81. 4mmol)EDC. HC1，加完后在-5 (TC反應lh，然后自然升至室溫，反應過夜。往反應液加飽和食鹽水，然后用ニ氯甲烷萃取。有機層依次用10%檸檬酸、飽和碳酸氫鈉、飽和食鹽水洗滌。無水Na2SO4干燥，旋干，得類白色蠟狀固體16g，收率97%。收率計算公式收率=產物PyroGlu-Pro-OtBu 摩爾數 / 原料 Pro-OtBu 摩爾數 X 100%。(4) PyroGlu-Pro-OH往250mL燒瓶中加入16g PyroGlu-Pro-OtBu和40mL ニ氯甲燒,溶解后加入40mL三氟こ酸，室溫下反應lh。反應液旋干，得油狀物，加入IOOmL甲基叔丁基醚使油狀物固化，搗碎后攪拌2 3h，過濾，固體用甲基叔丁基醚再打漿一次，過濾，得白色固體11. 2g，收率87%。收率計算公式收率=產物PyroGlu-Pro-OH 摩爾數 / 原料 PyroGlu-Pro-OtBu 摩爾數 X 100%。(5) PyroGlu-Pro-Arg(Boc)2-pNA往250mL 三ロ燒瓶中加入 15. 4g (31. Immol)H_Arg(Boc)2_pNA、10. 5g (46. 4mmol)PyroGlu-Pro-0H>6. 3g (46. Bmmol ) H0Bt、150mL ニ 氯甲燒和 6g (46. 4mmo1 ) DIEA,降溫至-5°C。加入8. 9g (46. 4mmol)EDC.HCl，加完后在-5 (TC反應lh，然后自然升至室溫，反應過夜。往反應液加水，然后用ニ氯甲烷萃取。有機層依次用10%檸檬酸、飽和碳酸氫鈉、飽和食鹽水洗漆。無水Na2SO4干燥,旋干,娃膠柱純化,得類白色固體18. 4g,收率84%。收率計算公式收率=產物PyroGlu-Pro-Arg (Boc) 2-pNA 摩爾數 / 原料 H-Arg (Boc) 2-pNA 摩爾數 X 100%O(6) PyroGlu-Pro-Arg-pNA. HCl
往SOOmT,單ロ燒瓶中加入 18. 4g PyroGlu-Pro-Arg (Boc) 2_pNA 和 200mL5 6MHCl/こ酸こ酷，室溫下反應2 3h。將溶劑旋干，加入200mLこ酸こ酯后過濾，得粗肽Hg。粗肽通過Sephadex G_15純化,用1%醋酸溶液洗脫,收集組分凍干,得白色固體11. 7g,收率83%,純度 96%。收率計算公式收率=產物PyroGlu-Pro-Arg-pNA.HCl 摩爾數/原料PyroGlu-Pro-Arg(Boc)2_pNA摩爾數X 100%。總收率的計算公式總收率=終產物PyroGlu-Pro-Arg-pNA.HCl 摩爾數/起始原料Fmoc-Arg(Boc)2_0H摩爾數=51. 8%。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.PyroGlu-Pro-Arg-pNA · HCl的合成方法,包括以下步驟 (1)以三氯氧磷為縮合劑，將氨基與胍基均帶有保護基的精氨酸與對硝基苯胺縮合；所述精氨酸的胍基保護基為雙叔丁氧羰基； (2)脫除步驟(I)所得產物的氨基保護基，獲得中間體I; (3)將焦谷氨酸與羧基帶保護基的脯氨酸縮合； (4)脫除步驟(3)所得產物的羧基保護基，獲得中間體2； (5)將所述中間體I和中間體2進行縮合； (6)以HCl或HCl和こ酸こ酯的混合物為脫保護基試劑，脫除步驟(5)所得產物的胍基保護基，獲得 PyroGlu-Pro-Arg-pNA · HCl。
2.如權利要求I所述的合成方法，其特征在于，所述精氨酸的氨基保護基為9-芴甲氧擬基。
3.如權利要求2所述的合成方法，其特征在于，步驟(2)所述氨基保護基的脫除試劑為堿。
4.如權利要求I所述的合成方法，其特征在于，所述脯氨酸的羧基保護基為酷。
5.如權利要求I所述的合成方法，其特征在于，所述脯氨酸的羧基保護基為叔丁酷。
6.如權利要求4或5所述的合成方法，其特征在干，步驟(4)所述羧基保護基的脫除試劑為酸。
7.如權利要求I所述的合成方法，其特征在于，步驟(I)的反應溫度為-10°C 0°C。
8.如權利要求I所述的合成方法，其特征在于，步驟(I)的反應溫度為_5°C。
9.如權利要求I所述的合成方法，其特征在于，步驟(I)的反應溶劑為堿性有機溶剤。
10.如權利要求I所述的合成方法，其特征在于，步驟(I)的反應溶劑為吡啶。
11.如權利要求I所述的合成方法，其特征在于，步驟(3)和步驟(5)所述縮合反應采用碳ニ亞胺為縮合剤。
12.如權利要求11所述的合成方法，其特征在于，所述碳ニ亞胺選自N，N’-ニ環己基碳ニ亞胺、N，N- ニ異丙基碳ニ亞胺、I-こ基-(3- ニ甲基氨基丙基)碳酰ニ亞胺鹽酸鹽。
全文摘要
本發明公開了一種發色底物PyroGlu-Pro-Arg-pNA·HCl的合成方法，屬于多肽合成領域。本發明合成方法先以三氯氧磷為縮合劑，將對硝基苯胺與胍基受bis-Boc保護的精氨酸縮合；再將另外兩個氨基酸縮合成二肽；最后將上述兩個合成肽段縮合，并采用HCl或HCl和乙酸乙酯的混合物脫除胍基保護基bis-Boc，形成本發明所述化合物。本發明合成方法，收率高、工藝簡單、制備成本低，適于大批量制備。
文檔編號C07K5/093GK102690325SQ20121018948
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月8日 優先權日2012年6月8日
發明者謝永華 申請人:上海太陽生物技術有限公司