專利名稱：具有美白功能的小球藻類金屬硫蛋白的提取方法
技術領域：
本發明涉及小球藻類金屬硫蛋白的制備及其美白功能的試驗方法，特別是涉及ー種具有美白功能的小球藻類金屬硫蛋白的提取方法。
背景技術：
金屬硫蛋白(metallothioneins, MTs)是ー類低分子量、高巰基含量,且能大量結合金屬離子的蛋白質。由于MTs具有特殊的分子結構和氨基酸組成，該類蛋白質具有抗氧化、抗輻射、排出體內重金屬離子等生理功能。但目前MTs大多從哺乳動物中誘導提取，其產品制備成本高、技術難度大，造成MTs價格昂貴。隨著研究的深入，發現在植物、原核藻類
和真核微生物中都有MTs的存在，雖然它們在正常生物體環境中通常含量很低，但可誘導提高其含量。故本發明采用生長周期短、對鋅脅迫敏感，且易于培養和分離的普通海洋小球藻{Chlorella vulgaris)為原材料,通過脅迫、提取和分離エ藝的優化,可從小球藻中制取大量類金屬硫蛋白。目前國內外主要是通過以下方法來制備金屬硫蛋白(1)以硫酸鋅誘導動物，以其肝組織為原料進行MTs提取。如周攀登在《廣東化工》2011，12 (38) :187-188,報道的以硫酸鋅誘導家兔肝組織產生MTs，采取超濾、凝膠層析和離子交換方法對金屬硫蛋白進行純化，制備其精品。這種方法的優點在于利用人體所需的微量元素Zn，但其生產成本昂貴。(2)通過重金屬誘導微生物獲得MTs，如李明春在《南開大學學報》2003，36 (3) : 123-128，報道通過Cu2+誘導假絲酵母獲得類金屬硫蛋白。利用第二種方法獲得的類金屬硫蛋白成本比動物誘導(即第一種方法)的要低，但由于培養基物質復雜，操作難度高。綜上所述，目前金屬硫蛋白的提取要么以動物為原料，其生產成本高且不符合國際上對動物保護的要求；要么以微生物為原材料，其微生物培養及蛋白分離提取較為困難。
發明內容
本發明的目的在于提供一種生產成本低、適用于エ業化生產的具有美白功能的小球藻類金屬硫蛋白的提取方法，并對該蛋白進行美白功能試驗。為實現上述目的，本發明的技術解決方案是
本發明是ー種具有美白功能的小球藻類金屬硫蛋白的提取方法，它包括以下步驟
(1)利用O.05 mol/L的ZnCl2誘導處于對數生長期的普通海洋小球藻ipdorellavulgaris),培養24-120 h后，考察不同鋅脅迫濃度及培養不同時間對藻細胞內鋅結合類金屬硫蛋白誘導量的影響，確定ZnCl2的最佳誘導濃度和誘導時間；
(2)根據步驟(I)確定的最佳ZnCl2脅迫濃度和脅迫時間，大量培養小球藻，取離心收集的藻細胞，按藻泥重量和提取液體積以1:10 (w/v)的比例加入pH值為7. 8的Tris-HCl緩沖液，進行超聲波細胞破碎，經高速離心棄去沉淀，收集上清液；
(3)上清液過層析柱G-75，每10min收集一管洗脫液，測定254 nm的吸光度值，并測定各收集管的鋅含量，以第二個信號峰即254 nm吸收信號弱而鋅信號強的組分峰為目標峰，確定類金屬硫蛋白在G-75洗脫分離的收集時間段，收集的組分經真空冷凍干燥即為類金屬硫蛋白粗提物；
(4)獲得的類金屬硫蛋白粗提物用超純水復溶后，過層析柱G-25進行脫鹽，再次真空冷凍干燥后即得到類金屬硫蛋白制品；
(5)通過酪氨酸酶進行單酚酶和ニ酚酶的酶活性抑制率試驗，確定類金屬硫蛋白的美白功能。步驟(I)中最佳ZnCl2脅迫濃度和最佳誘導時間的確定方法如下利用凝膠色譜與電感耦合等離子體質譜聯用的檢測手段，以鋅檢測信號及對應的蛋白質分子量大小確定小球藻鋅結合類金屬硫蛋白峰在色譜曲線上的位置，以鋅信號強度代表鋅結合類金屬硫蛋白的誘導量，確定最佳的鋅脅迫濃度和誘導時間。步驟(2)中藻細胞破碎時，以藻泥重量與緩沖液體積按1:10 (w/v)的比例加入，緩沖液由內含1% ニ硫蘇糖醇、pH為7. 8的10 mmol/L Tris-HCl組成；進行藻細胞破碎時， 破碎過程采用間歇式進行，用顯微鏡觀察直至細胞破碎完全。步驟(3)中以固定間隔時間連續收集經G-75分離的洗脫液，檢測每一收集管洗脫液在254 nm的吸光度值和鋅信號值，以收集管序號為橫坐標、以254 nm和鋅信號值為縱坐標作圖，可得到兩個組分峰，第一個峰的254 nm吸光度值高而鋅的信號值低，第二個峰的254 nm吸光度值低而鋅的信號值高，因此第二個峰對應的組分即類金屬硫蛋白的目標物。本發明采用氯化鋅脅迫培養普通海洋小球藻，通過不同鋅脅迫濃度和脅迫時間的考察，可獲得類金屬硫蛋白的最優誘導條件，通過提取、分離和純化過程，得到類金屬硫蛋白制品。通過抑制酪氨酸酶活性試驗證明，小球藻類金屬硫蛋白濃度為1.2 mg/mL時,能使ニ酚酶的活性下降87%，使單酚酶在2300秒內未呈現出活性，說明該蛋白質具有良好的美白功能。下面結合附圖和具體實施例對本發明作進ー步的說明。
圖I為ZnCl2脅迫濃度和脅迫時間與鋅結合類金屬硫蛋白的關系 圖2為提取鋅結合類金屬硫蛋白經凝膠層析柱G-75分離的鋅檢測信號與紫外檢測信號的洗脫曲線 圖3為單酚酶的美白功能試驗結果 圖4為ニ酚酶的美白功能試驗結果圖。具體實驗方式
本發明是ー種具有美白功能的小球藻類金屬硫蛋白的提取方法，以下是本發明的幾個具體實例，它包括以下エ藝步驟
實施例I
I)在處于對數生長期的小球藻藻液中加入O. 05 mol/L氯化鋅，控制鋅在藻液中的最終濃度為5-100 MmoI/L范圍內，繼續培養小球藻24-120 h，培養過程中每天定時手工搖瓶5次，姆次約3 min。取培養組小球藻藻液各100 mL,經10000 r/min離心,收集藻細胞,分別用5 mmol/L EDTA_2Na和超純水清洗藻細胞2次，加入10 mmol/L Tris-HCl緩沖液5 mL,冰浴下超聲波破碎藻細胞5 min,經12000 r/min離心10 min,收集上清液。
2)利用 TSK-gel 凝膠色譜柱(G3000PWxl, 7. 8 mm i. d. X 300 mm, 6 μ m)進行色譜分離，以10 mmol/L Tris-HCl緩沖液為流動相，洗脫液經電感耦合等離子體質譜在線檢測鋅信號強度，以鋅信號為縱坐標、保留時間為橫坐標作色譜流出曲線圖，通過鋅信號峰與對應蛋白質分子量確定小球藻鋅結合類金屬硫蛋白峰在色譜曲線上的位置。如圖I所示，獲得不同鋅脅迫濃度和不同誘導時間小球藻鋅結合類金屬硫蛋白的誘導量，以確定鋅脅迫的濃度和脅迫時間。3)在確定的培養條件下大量培養小球藻，離心收集藻細胞后，分別用5 mmol/LEDTA-2Na和超純水清洗藻細胞2次，以除去細胞壁吸附的鋅。按藻泥重量和提取液體積1:10 (w/v)的比例加入內含1% ニ硫蘇糖醇、pH為7. 8的10 mmol/L Tris-HCl,冰浴下采用間歇式超聲波破碎藻細胞，破碎過程用顯微鏡檢查直至細胞破碎完全。然后經12000 r/min離心10 min,收集上清液。4)將上清液注入凝膠層析柱G-75 ( Φ3.0Χ80 cm),以pH為7. 8的10 mmol/LTris-HCl為洗脫液，以固定每10 min連續收集經G-75分離的洗脫液，檢測每一收集管洗脫液在254 nm的吸光度值和鋅信號值，以收集管序號為橫坐標、以254 nm和鋅信號值為縱坐標作圖。如圖2所示，可得到兩個組分峰，第一個峰的254 nm吸光度值高而鋅的信號值低，·第二個峰的254 nm吸光度值低而鋅的信號值高，因此第二個峰對應的組分即類金屬硫蛋白的目標物，收集過程中通入惰性氣體，如氮氣或氬氣，以防止樣品被氧化。5)將G-75收集組分經真空冷凍干燥后，復溶于超純水中，過G-25脫鹽柱(Φ I. 5X30 cm)，用純水脫鹽純化，收集鋅結合蛋白質組分并經真空冷凍干燥即得到具有美白功能的小球藻類金屬硫蛋白制品。6)通過抑制酪氨酸酶活性試驗，證明該提取蛋白具有美白功能。實施例2
O向處于對數生長期的小球藻中加入ZnCl2，使藻液中鋅的最終濃度達到50 Mmol/L,并通氣培養72小吋。2)通過離心法收集藻細胞，經反復凍融5次后，再經超聲波細胞破碎，經12000 r/min離心10 min收集上清液。3)同實施例I中步驟(4)和(5)
4)通過抑制酪氨酸酶活性試驗，證明當小球藻類金屬硫蛋白濃度為I. 2 mg/mL時，可使單酚酶在2300 s內未表現出活性、使ニ酚酶的活性下降87%，說明該蛋白質具有較強的美白功效。實施例3
I)向處于對數生長期的小球藻中加入ZnCl2，使藻液中鋅的最終濃度達到5 Mmol/L，并通氣培養120小時。2)通過離心法收集藻細胞，在冰浴下經超聲波細胞破碎(540 W，每次開I. 2 S、關3 S)，用顯微鏡觀察直至細胞破碎完全。經12000 r/min離心10 min收集上清液。3)同實施例I中步驟(4)和(5)
4)通過抑制酪氨酸酶活性試驗，類金屬硫蛋白對單酚酶活性的半抑制率濃度為0. 5mg/mL、對ニ酚酶活性的半抑制率濃度為0. 7 mg/mL，說明該蛋白質具有美白功能。實施例4I)向處于對數生長期的小球藻中加入ZnCl2，使藻液中鋅的最終濃度達到100 Mmol/L,并通氣培養24小時。2)通過離心法收集藻細胞，在冰浴下經超聲波細胞破碎(540 W，每次開I. 2 S、關3 S)，用顯微鏡觀察直至細胞破碎完全。經12000 r/min離心10 min收集上清液。3)同實施例I中步驟(4)和(5)；
4)通過抑制酪氨酸酶活性試驗，類金屬硫蛋白對單酚酶活性的半抑制率濃度為O. 5mg/mL、對ニ酚酶活性的半抑制率濃度為O. 7 mg/mL，說明該蛋白質具有美白功能。抑制酪氨酸酶活性試驗即美白功能檢測方法
I、在試管中加入 I mL 0.5 mmol/L 酪氨酸、2 mL PBS 緩沖液(100 mmol/L pH,6. 8),30°C下水浴10 min,加入O. 2 mL不同濃度的類金屬硫蛋白制品和O. I mL酪氨酸酶,控制酶的終濃度為124 Pg/mL。通過測定OD475的動力學曲線，如圖3所示，計算單酚酶的抑制率。在試管中加入I mL 0.5 mmol/L左旋多巴(L-DOPA)溶液、3 mL PBS緩沖液(pH6. 8), 30°C下水浴10 min,加入 O. 2 mL不同濃度的類金屬硫蛋白和O. I mL酪氨酸酶,控制酶的終濃度為740 Pg/mL。通過測定OD475的動力學曲線，如圖4所示，計算ニ酚酶的抑制率。
權利要求
1.ー種具有美白功能的小球藻類金屬硫蛋白的提取方法，其特征在于它包括以下步驟 (1)利用O.05 mol/L的ZnCl2誘導處于對數生長期的普通海洋小球藻ipdorellavulgaris),培養24-120 h后，考察不同鋅脅迫濃度及培養不同時間對藻細胞內鋅結合類金屬硫蛋白誘導量的影響，確定ZnCl2的最佳誘導濃度和誘導時間； (2)根據步驟(I)確定的最佳ZnCl2脅迫濃度和脅迫時間，大量培養小球藻，取離心收集的藻細胞，按藻泥重量和提取液體積以1:10 (w/v)的比例加入pH值為7. 8的Tris-HCl緩沖液，進行超聲波細胞破碎，經高速離心棄去沉淀，收集上清液； (3)上清液過層析柱G-75，每10min收集一管洗脫液，測定254 nm的吸光度值，并測定各收集管的鋅含量，以第二個信號峰即254 nm吸收信號弱而鋅信號強的組分峰為目標峰，確定類金屬硫蛋白在G-75洗脫分離的收集時間段，收集的組分經真空冷凍干燥即為類金屬硫蛋白粗提物； (4)獲得的類金屬硫蛋白粗提物用超純水復溶后，過層析柱G-25進行脫鹽，再次真空冷凍干燥后即得到類金屬硫蛋白制品； (5)通過酪氨酸酶進行單酚酶和ニ酚酶的酶活性抑制率試驗，確定類金屬硫蛋白的美白功能。
2.如權利要求I所述的具有美白功能的小球藻類金屬硫蛋白的提取方法，其特征在于步驟(I)中最佳ZnCl2脅迫濃度和最佳誘導時間的確定方法如下利用凝膠色譜與電感耦合等離子體質譜聯用的檢測手段，以鋅檢測信號及對應的蛋白質分子量大小確定小球藻鋅結合類金屬硫蛋白峰在色譜曲線上的位置，以鋅信號強度代表鋅結合類金屬硫蛋白的誘導量，確定最佳的鋅脅迫濃度和誘導時間。
3.如權利要求I所述的具有美白功能的小球藻類金屬硫蛋白的提取方法，其特征在于步驟(2)中藻細胞破碎時，以藻泥重量與緩沖液體積按1:10 (w/v)的比例加入，緩沖液由內含1%ニ硫蘇糖醇、PH為7. 8的10 mmol/L Tris-HCl組成；進行藻細胞破碎時，破碎過程采用間歇式進行，用顯微鏡觀察直至細胞破碎完全。
4.如權利要求I所述的具有美白功能的小球藻類金屬硫蛋白的提取方法，其特征在于步驟(3)中以固定間隔時間連續收集經G-75分離的洗脫液，檢測每一收集管洗脫液在254 nm的吸光度值和鋅信號值，以收集管序號為橫坐標、以254 nm和鋅信號值為縱坐標作圖，可得到兩個組分峰，第一個峰的254 nm吸光度值高而鋅的信號值低,第二個峰的254 nm吸光度值低而鋅的信號值高，因此第二個峰對應的組分即類金屬硫蛋白的目標物。
全文摘要
本發明公開了一種具有美白功能的小球藻類金屬硫蛋白的提取方法，本發明采用氯化鋅脅迫培養普通海洋小球藻，通過不同鋅脅迫濃度和脅迫時間的考察，可獲得類金屬硫蛋白的最優誘導條件，通過提取、分離和純化過程，得到類金屬硫蛋白制品。通過抑制酪氨酸酶活性試驗證明，小球藻類金屬硫蛋白濃度為1.2mg/mL時，能使二酚酶的活性下降87%，使單酚酶在2300秒內未呈現出活性，說明該蛋白質具有良好的美白功能，在化妝品、保健品領域有廣闊的應用前景。
文檔編號C07K14/405GK102675436SQ20121018013
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月4日 優先權日2012年6月4日
發明者楊洪, 黃志勇 申請人:集美大學