專利名稱：從茶葉加工下腳料中制備高純度單體兒茶素的方法
技術領域：
本發明涉及植物提取物，特別是茶葉提取物，具體是從茶葉加工下腳料中制備高純度單體兒茶素的方法。
背景技術：
茶葉作為中華民族的傳統保健飲料已有四五千年的歷史。我國是茶葉生產大國，茶葉資源非常豐富，年產成品茶約60萬噸。開發茶葉的新用途，開展茶葉的綜合利用，尤其是利用低檔茶葉或茶葉加工的下腳料來生產高附加值的精細化學品，是ー個具有重要意義的研究課題。60年代初，日本科學家發現茶葉提取物中含有一種抗氧化活性成分，各國科學家相繼深入研究，證明它是ー類 多酚化合物，即茶多酚(TP)。茶多酚是茶葉中多酚類物質的總稱。為白色無定形粉末，易溶于水，可溶于こ醇、甲醇、丙酮、こ酸こ酷，不溶于氯仿。緑茶中茶多酚的含量較高，占其質量的15% 30%。茶多酚類物質大致可分為6種黃烷醇類，4-羥基黃烷醇類，花色苷類，黃酮類，黃酮醇類和酚酸類。其中以黃烷醇類(主要是兒茶素類化合物)最為重要，占茶多酚總量的60% 80%。其次是黃酮類，其它酚類物質含量比較少。茶多酚于1996年列入GB2760-1996食品添加劑國家標準，用作抗氧化劑，1997年列為中成藥原料。茶多酚已成為醫藥、食品界開發的熱點，目前除了茶多酚片劑、膠囊劑等夕卜，作為抗氧化劑和食品添加劑在糧油食品、方便食品、水廣品、肉制品、調味品、糖果、飲料等多類食品中均有廣泛的應用，有強勁的市場需求，開發和應用前景十分廣闊。實際上，在茶多酚的有效組成份中以黃烷醇類為主，黃烷醇類又以兒茶素類物質為主。兒茶素類物質的含量約占茶多酚總量的70%左右。兒茶素類化合物是茶多酚的主要成分，其結構式可表示為
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若R1=OH, R,=:，則為左旋-表沒食子兒茶素沒食子酸酷(L-EGCG)；
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R1=OH, R2=H,則為左旋-表沒食子兒茶素(L-EGC) ^1=H, U' ■, f ·則為左旋_表
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兒茶素沒食子酸酷(L-ECG) ^1=H, R2=H,則為左旅-表兒茶素(L-EC)。兒茶素類化合物的基本結構均為2-連(或鄰)苯酚基苯并吡喃衍生物，正是這種結構中具有連或鄰苯酚基，作為抗氧化劑的活性就高于一般非酚類或單酚羥基類抗氧化劑。其等摩爾濃度的抗氧化能力依次為L-EGCG > L-EGC > L-ECG > L-EC0從茶葉中提取的茶多酚抗氧化劑是這些兒茶素的混合物。其抗氧化性優于丁基羥基茴香醚(BHA)、ニ丁基羥基甲苯(BHT)、叔丁基對苯ニ酚(TBHQ)等。國內外學者進行了急性毒性、亞急性毒性和各種藥理實驗研究，結果表明這些兒茶素安全無毒。兒茶素是茶葉中的重要組分，已廣泛應用于食品加工，醫藥保健與日用化工等領域，其中兒茶素単體表沒食子兒茶素沒食子酸酷(EGCG)的藥理活性最強，更加引起人們的關注。兒茶素的主要生理活性表現在抗氧化、抗菌消炎、抗病毒、抗癌抗突變、以及用于心血管疾病和對免疫系統的調節作用。酯型兒茶素(EGCG)，其還原性甚至可達L-VC之100倍。在醫學方面可防治心血管疾病、可抗癌抗突變、可治療皮炎、有降血糖、降血壓、抗病毒等多種作用。在酶工程方面能通過氫鍵與蛋白質和酶結合形成沉淀，分離出酶和蛋白質，以保證食品醫藥用酶的安全衛生和特殊要求。 目前，兒茶素已經成為脫離茶多酚的ー種獨立產品，在醫藥方面取得了令人矚目的進展，其嚴格的質量要求、先進的技術、昂貴的售價和誘人的利潤正引起全球的優秀科學家和工程師的極大興趣。干綠茶葉中茶多酚的含量約20%，低檔茶，茶梗，茶末等下腳料以及殺青葉、秋季剪枝葉中均可含10%左右的茶多酚，充分而有效地利用這ー資源優勢，深度開發優質和高附加值的茶多酚產品，其經濟效益是十分顯著的。應用和開發領域十分廣闊。茶多酚的提取和應用受到國內外的廣泛關注，開拓了茶葉化學研究的新領域，發展以農副產物為原料的精細化學品，開發“緑色技木”，發展“緑色工程”已成為熱門課題。到目前為止，茶多酚的提取エ藝和兒茶素的分離純化在國內外都有有較多的報道，但我國的研究較多，報道也較系統全面。有代表性的，也是水平較高的是由中國家業科學院茶葉研究所、西南農業大學、華中農業大學共同承擔的農業部八五重點科研項目"茶葉有效成分提出取及加工技術研究"，1996年通過農業部成果鑒定，專家認定達到國際領先水平。鑒定結果為①得率高，95%的茶多酚提取率可達3.5%，而一般エ藝僅I. 5% 級品質好，活性高，有機溶劑殘留低。具有生理活性兒茶素含量在60%以上，而一般エ藝僅為30%。而由福建物質結構研究所開發成功的高純度茶多酚的提取エ藝技術及有效成分的分離技木，95%的茶多酚提取率可達8. 0%以上，具有生理活性兒茶素含量在65%以上。劉軍海等的“復合酶法提取茶多酚エ藝條件研究”以低檔綠茶為原料，采用復合酶法在較低溫度下提取茶多酚。以單因素試驗考察了酶用量、提取溫度、提取時間及pH對茶多酚提取率的影響。通過正交試驗優化并確定最佳提取エ藝條件酶用量為O. 20%、提取溫度為60°C、提取時間80min、pH為4. 6。結果表明，在此エ藝下，茶多酚提取率為13.6%，其中兒茶素占荼葉干重的含量比沸水提取法最大可高出2. 31%。鐘世安等“大孔吸附樹脂對酯型兒茶素吸附性能的研究”系統研究了 AB-8，PA，HPD600，NKA-9，NKA-II等5種大孔吸附樹脂對EGCG的吸附性能。結果表明，這5種大孔吸附樹脂對EGCG的吸附效率隨AB-8，PA，HPD600, NKA-9, NKA-II的順序依次減小.選擇大孔吸附樹脂PA為吸附劑，用PA時EGCG、ECG、GCG進行靜態和動態吸附實驗“及解吸劑的選擇實驗，研究了吸附速率曲線，確定了最佳吸附流速，根據解吸效果和綠色提取的需要，決定選用無毒有機溶劑C作為解脫劑。在專利文 獻方面，已有技術也有很多
CN1367171兒茶素中EGCg有效含量達90%以上，可直接用于藥物原料。
CN1379027產品純度可達90%以上，其副產品為茶多酚和咖啡堿。本發明已成功通過エ業化生產試驗。
CN1683363所選用的溶劑價廉、毒性小、易于回收、無殘留，所得樣品純度高達到95%以上，成本低、時間短、操作簡單。CN102304115A提供茶鮮葉中酯型兒茶素的提取方法，需加入液氮。CN101182319用こ酰化試劑使茶多酚中的多酚物質羥基こ酰化，然后用硅膠柱色譜分離得到全こ酰化的表沒食子兒茶素沒食子酸酷，再使全こ酰化的表沒食子兒茶素沒食子酸酯在酸性條件下和質子性溶劑中水解得到表沒食子兒茶素沒食子酸酷。CN101381359通過咖啡因沉淀、液相萃取和閃爍硅膠柱色譜技術聯用純化。上述方法都有不足之處，有的收得率理想，有的分離效果不好，有的成本高，有的要使用特別的物料。另外這些研究普遍的只是注與眾不同的創新，而不能形成一套完整的ェ藝。
發明內容
本發明的目的是提供一種從茶葉加工下腳料中制備高純度單體兒茶素的方法。本發明的方法包括提取茶多酚、分離出兒茶素并進行純化，其エ藝過程包含
A.原料粉碎；
B.加水在酸性條件下加入由纖維素酶、蛋白酶和果膠酶組成的復合酶進行酶解；
C.酶解液用こ酸こ酯萃取，萃取液濃縮和/或干燥，得茶多酚粗品；
D.將濃縮或/和干燥物加水成液體，調節PH5.6 6. 5，加入CaCl2和ZnCl2混合沉淀
劑；
E.濾出的沉淀物以稀鹽酸溶解后直接經大孔樹脂吸附，水洗后，再こ醇洗脫，濃縮こ醇洗脫液和/或干燥，得茶多酚精品；然后，
F.加水成液體，用大孔樹脂吸附，水洗后再用こ醇水溶液洗脫，分別收集含EGCG，GCG,ECG純度為98%以上的洗脫液；然后，
G.加水使各洗脫液的こ醇濃度為I 10%;然后，
H.再分別用與F同型號的大孔樹脂吸附，用90 99.5%こ醇洗脫，洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥得成品。本發明的方法的原料取自新鮮茶葉、剪枝茶葉、非發酵過的茶葉加工下腳料。為了更好地提取有效成分，原料需要粉碎至20 80目。上述，在Bエ序，加水量為茶葉干重的10 20倍，PH=3 6. 5，復合酶組成比例為纖維素酶蛋白酶果膠酶=0. I 5 :0. I 5 :0. I 5，復合酶用量為茶葉干重的O. I 1%，溫度40 65で。在Dエ序加水量為粗品干重的10 20倍，CaCl2和ZnCl2混合沉淀劑的混合比例=1 0. 01 99，Ca2+和Zn2+的量和與溶液中茶多酚的量=0. 01 O. 05 (mol/g)。在Eエ序稀鹽酸的濃度為O. 1% 10%，水洗的水用量為大孔樹脂體積的I 5倍，乙醇濃度為90% 99. 5%。在F工序加水量為精品干重的2 5倍，水洗的水為去離子水，其用量為大孔樹脂體積的I 5倍，之后乙醇水溶液洗脫的程序為用I 3倍樹脂體積量的10%乙醇水溶液洗脫——用I 3倍樹脂體積量的20%乙醇水溶液洗脫——用I 3倍樹脂體積量的30%乙醇水溶液洗脫——用I 3倍樹脂體積量的90% 99. 5%乙醇洗柱。本發明中，大孔樹脂選自非極性大孔吸附樹脂、弱極性大孔吸附樹脂和氫鍵型大孔吸附樹脂。優選 D101、AB-8、DMl30、HPD826、ADS-17。在實際過程中，B工序的酶解需要攪拌提取三次，每次攪拌3(T90min，過濾，合并濾液經乙酸乙酯萃取后真空濃縮、干燥。 在D工序,加入混合沉淀劑也需要攪拌30min"90min,以促使反應完全。本發明采用酶輔助浸提是一種綠色、安全、環保的生產工藝，蛋白酶、果膠酶、纖維素酶的復合酶在低溫條件下分解構成細胞壁及細胞間質的纖維素和果膠質以及植物蛋白。復合酶法提取茶多酚，茶多酚的提取率為If 15%，已經達到有機溶劑法的效果。其有效成分兒茶素的提取率可達8. 0%以上。酶法提取的反應條件比較溫和，避免了有效成分的高溫氧化，從而提高了兒茶素的提取率。沸水提取是在高溫下進行，高溫水提導致部分熱穩定性較差的兒茶素氧化失活；酶法提取的最大優勢在于提取過程溫度低，從而最大限度地減少了茶多酚提取過程中活性成份兒茶素的損失。TP粗品含有多種多酚類物質，就是兒茶素，這是茶多酚的有效成分，但是也含有雜質。金屬離子沉淀法利用酚類物質能與某些金屬離子絡合生成沉淀物特點，使其在與其它物質分離而出，從而得到純度較高的茶多酚。目前常用金屬離子用Zn、Al、Fe、Mg、Ba、Ca等離子，研究發現使用復合金屬離子更加有利于茶多酚的純化。我們選用ZnCl2、CaCl2作復合沉淀劑，在pH值為5. 6 6. 5的條件下，使兒茶素以金屬鹽的形式沉淀，沉淀物經去離子水洗滌后，用稀鹽酸溶解，將溶解液直接上大孔樹脂柱，去離子水洗去無機離子后再用乙醇洗脫，洗脫液濃縮、干燥(實際生產中濃縮后直接轉下道工序)。得到純度高于98%的高純度茶多酚，兒茶素的總含量達到65%以上，其中EGCG的含量大于55%。較現有方法在茶多酚純度、EGCG含量等技術指標方面有較大的提高。該方法使用鋅離子和鈣離子，并采用大孔樹脂這一普遍應有于食品藥品行業的新型材料，選擇性和提取率較高，產品純度高，對人體無毒害，同時，Zn2+和Ca2+還具有多種生理保健功能，因而安全性和實用性較強。該方法還減少了有機溶劑的使用量，有利于安全生產和環境保護。同時，沉淀法所需設備少，工藝規程簡單，成本低。TP精品中，存在混合的天然酯型兒茶素。目前，茶葉中已發現含量較高的兒茶素主要有7種EGCG(表沒食子兒茶素沒食子酸酯)、ECG (表兒茶素沒食子酸酯)、GCG (沒食子兒荼素沒食子酸酯)、EGC (表沒食子兒茶素)、GC(沒食子兒茶素)、EC (表兒茶素)、C (兒茶素)。在藥學上現己確定茶多酚中的主要成分酯型兒茶素有EGCG、ECG、GCG，而其中EGCG的含量最多，且它是極具抗癌的有效成分。在實際應用上，特別是在高端需求方面，各種兒茶素需要以單體的形式加入使用，所以還需要對TP精品進一步處理，獲得各種單體兒茶素。我們首先采用大孔樹脂柱層析進行一次分離的方法(F工序)，洗脫劑使用乙醇-水。在除去雜質的同時，將各種兒茶素單獨分離開來，得到了高濃度的酯型兒茶素單體流份液。然后進行大孔樹脂柱層析進行二次純化(H工序)。將一次分離得到的兒茶素單體流份液再用大孔樹脂吸附，用高濃度的乙醇洗脫，得到純度大于99%的兒茶素單體乙醇液。之后濃縮，最后冷凍干燥，得到類白色的EGCG單體，檢測純度大于99%。我們選用一種新型的大孔樹脂——氫鍵吸附大孔樹脂。利用其氫鍵對酚類物質的選擇性強吸附，可以很好地分離各種成分，是分離酚類、黃酮類多成分混合物的新秀。大孔樹脂吸附吸附法具有成本低、效率高、穩定性好、容易再生等優點。國內企業將EGCG含量80%的多酚生產出含量大于98%的單體，得率約為30%，我們以TP精品(EGCG的含量大于50%)為原料，產出純度在99. 5%以上、含量大于98%的單體，得率接近50%。對茶多酚的檢測，本發明執行GB/T8313-2008。對兒茶素的檢測，本發明采用HPLC，色譜條件為
色譜柱(Column) Extend. C18 (4. 6x250mm, 5um)
流速(Flow Rate) :1. Oml / min
V 柱溫(Temperature):室溫
檢測波長(Peak Detect Wavelength) 280nm
進樣體積(Injection Volume) 10ul
流動相(Mobile Phase):甲醇水:乙酸=25 :74. 5 :0. 5
使用對照品繪制標準曲線，進樣，記錄峰面積，計算含量。本發明的方法的優點在于
I、粗產品的生產，即從茶葉中提取茶多酚，采用復合酶水法，條件比較溫和，避免了有效成分的高溫氧化，從而提高了兒茶素的提取率。2、粗產品的生產過程中，我們只用一次萃取，即用乙酸乙酯萃取，而不使用氯仿(起到脫除咖啡因的作用)，消除氯仿殘留確保產品安全。3、在TP精品的生產中，選用ZnCl2XaCl2作復合沉淀劑，可以比使用單一金屬離子更好地分離純化茶多酚中的各種酚類兒茶素。而且鋅和鈣還是對人體有生理保健的，是人體不可或缺的微量元素，即使在產品中有所存在也只是有益而無害。4、采用復合沉淀法的另外一個優點在于，可以很好地除去咖啡因。用這樣的方法，和前面的粗制工藝相結合，既可以除去咖啡因，又避開具有毒性的氯仿，是互相銜接揚長避短的一套完整的優化技術。5、在精制和純化高純度單體的過程中，都采用大孔樹脂特別是氫鍵吸附大孔樹月旨，作為一種有獨特性能、選擇性很強的新材料，選擇性和提取率較高，產品純度高，對人體
無毒害。6、本項目只使用乙醇這一常用的溶劑，安全無毒價格低。 7、從粗制開始，直到制成高純度單體兒茶素，過程中并不需要干燥，而是步步銜接順利流轉，形成一套完整的合理的工藝
粗品-沉淀-直接上大孔樹脂柱-乙醇洗脫液濃縮-上大孔樹脂-乙醇液-濃縮-冷凍干燥-產品。——這樣的工藝既能減少兒茶素在加工過程中的氧化，也使得生產過程簡單，提高得率和產量。8、整個生產中使用一種大孔樹脂和一種溶劑，給生產管理和物料采購及管理帶來便利。9、本工藝技術所得產品質量和產品得率，均比現有技術要高。
圖I是本發明的工藝流程圖。圖2是茶多酚粗品HPLC檢測圖譜。圖3是茶多酚精品HPLC檢測圖譜。
圖4是EGCG單體HPLC檢測圖譜。
具體實施例方式(一)粗產品的制備 實施例I
干茶葉下腳料(綠茶，而非紅茶)，100g，粉碎成50目，加入2000ml水，加溫至60°C浸泡，調節PH=6，加入由纖維素酶、蛋白酶和果膠酶組成的混合酶(比例I :1 :1)，復合酶用量為茶葉干重的O. 5%，攪拌60min，過濾，重復提取3次，合并濾液經乙酸乙酯萃取后真空濃縮、干燥。得到含量18. 1%的茶多酚21. 8g。按干茶葉含茶多酚30%、含兒茶素22%計，茶多酚的提取率為13. 2%。其中兒茶素的含量8. 1%，計算可以知道提取率8%。實施例2
鮮茶葉60°C烘干，取干重100g，粉碎成20目，加入IOOOml水，加溫至40°C浸泡，調節PH=3，加入由纖維素酶、蛋白酶和果膠酶組成的混合酶(比例5 :0. I :5)，復合酶用量為茶葉干重的O. 1%，攪拌90min，過濾，重復提取3次，合并濾液經乙酸乙酯萃取后真空濃縮、干燥。得到含量17. 5%的茶多酚34. 6g。按烘干茶葉含茶多酚36%、含兒茶素28%計，茶多酚的提取率為16. 8%。其中兒茶素的含量7. 6%，計算可以知道提取率9. 4%。實施例3
與實施例I相同的干茶葉100g，粉碎成80目，加入1500ml水，加溫至50°C浸泡，調節PH=6. 5，加入由纖維素酶、蛋白酶和果膠酶組成的混合酶(比例0. I 5 :5)，復合酶用量為茶葉干重的1%，攪拌30min，過濾，重復提取3次，合并濾液經乙酸乙酯萃取后真空濃縮、干燥。得到含量16. 9%的茶多酚26. 5g，茶多酚的提取率為14. 9%。其中兒茶素的含量6. 97%，計算可以知道提取率8. 4%。實施例4
與實施例I相同的干茶葉100g，粉碎成60目，加入1800ml水，加溫至55°C浸泡，調節PH=5. 5，加入由纖維素酶、蛋白酶和果膠酶組成的混合酶(比例5 5 :0. 1)，復合酶用量為茶葉干重的0. 25%，攪拌60min，過濾，重復提取3次，合并濾液經乙酸乙酯萃取后真空濃縮、干燥。得到含量18. 7%的茶多酚25. 0g，茶多酚的提取率為15. 6%。其中兒茶素的含量8. 7%，計算可以知道提取率9. 9%。(二)TP精品的制備 實施例I茶多酚粗品10g，200ml水溶解，加入CaCl2和ZnCl2混合沉淀劑(混合比例I :l)，Ca2+和Zn2+的量總和為O. 5mol,調節PH=6，攪拌60min，沉淀物過濾、水洗滌，以O. 1%的稀鹽酸溶解后直接經AB-8型大孔樹脂吸附(大孔樹脂的重量是溶液中固體重量的10倍)，用I倍量(I/kg)樹脂體積的水流洗，然后95%乙醇洗脫，收集有效洗脫液，在60°C真空濃縮、干燥。得到純度為99. 1%的高純度茶多酚I. 05g，兒茶素的含量為64. 3%，其中EGCG含量為57. 86%。按粗品含茶多酚15%、含兒茶素9%計，茶多酚收得率為69. 4%，兒茶素的收得率為75. 1%。實施例2
茶多酚粗品10g，IOOml水溶解，加入CaCl2和ZnCl2混合沉淀劑(混合比例I :99)，Ca2+和Zn2+的量總和為O. Imol,調節PH=5. 6，攪拌60min，沉淀物過濾、水洗滌，以10%的稀鹽酸溶解后直接經AB-8型大孔樹脂吸附(大孔樹脂的重量是溶液中固體重量的10倍)，用5倍量(Ι/kg)樹脂體積的水流洗，然后90%乙醇洗脫，收集有效洗脫液，在60°C真空濃縮、干燥。得到純度為98. 9%的高純度茶多酚I. 06g，兒茶素的含量為63. 3%，其中EGCG含量為57. 0%。按粗品含茶多酚15%、含兒茶素9%計，茶多酚收得率為69. 9%，兒茶素的收得率為74. 6%。實施例3
茶多酚粗品10g，150ml水溶解，加入CaClJP 2冗12混合沉淀劑(混合比例I :0. 01), Ca2+和Zn2+的量總和為O. 3mol,調節PH=6. 5，攪拌60min，沉淀物過濾、水洗滌，以1%的稀鹽酸溶解后直接經DlOl型大孔樹脂吸附(大孔樹脂的重量是溶液中固體重量的10倍)，用3倍量(Ι/kg)樹脂體積的水流洗，然后99. 5%乙醇洗脫，收集有效洗脫液，在60°C真空濃縮、干燥。得到純度為99. 7%的高純度茶多酚I. 08g,兒茶素的含量為63. 25%，其中EGCG含量為56. 93%。按粗品含茶多酚15%、含兒茶素9%計，茶多酚收得率為71. 8%，兒茶素的收得率為75. 9%。(三)兒茶素單體的制備 實施例I
TP精品IOgJa 50ml的去離子水溶解，用AB-8型大孔樹脂柱吸附，大孔樹脂的重量是溶液中固體重量的10倍，然后向柱中加入IOOml (為大孔樹脂體積的I倍量)去離子水，待水從柱下端流完，將IOOml的10%乙醇水溶液從柱頂端往下流洗，接著用IOOml的20%乙醇水溶液、IOOml的30%乙醇水溶液、IOOml的90%乙醇水溶液依次流洗，收集含EGCG純度為98%以上的洗脫液，往洗脫液中加水使乙醇濃度降至10%，再經同型號的大孔樹脂吸附(大孔樹脂的重量是溶液中固體重量的10倍)，用90%乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥，得到類白色的EGCG單體重量為3. 02g，檢測純度為99. 5%，含量為98. 6%，按TP精品中EGCG含量58%計算，收得率為51. 3%。實施例2
TP精品IOgJa 20ml的去離子水溶解，用AB-8型大孔樹脂柱吸附，大孔樹脂的重量是溶液中固體重量的10倍，然后向柱中加入500ml (為大孔樹脂體積的5倍量)去離子水，待水從柱下端流完，將300ml的10%乙醇水溶液從柱頂端往下流洗，接著用300ml的20%乙醇水溶液、300ml的30%乙醇水溶液、300ml的99. 5%乙醇水溶液依次流洗，收集純度為98%以上的洗脫液，往洗脫液中加水使乙醇濃度降至5%，經同型號的大孔樹脂吸附(大孔樹脂的重量是溶液中固體重量的10倍)，用99. 5%乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥，得到類白色 的EGCG單體重量為3. 06g,檢測純度為99. 2%，含量為98. 1%，按TP精品中EGCG含量58%計算，收得率為51.8%。實施例3
TP精品IOgJa 30ml的去離子水溶解，用AB-8型大孔樹脂柱吸附，大孔樹脂的重量是溶液中固體重量的10倍，然后向柱中加入300ml (為大孔樹脂體積的3倍量)去離子水，待水從柱下端流完，將200ml的10%乙醇水溶液從柱頂端往下流洗，接著用200ml的20%乙醇水溶液、200ml的30%乙醇水 溶液、200ml的95%乙醇水溶液依次流洗，收集含EGCG純度為98%以上的洗脫液，往洗脫液中加水使乙醇濃度降至1%，再經同型號的大孔樹脂吸附(大孔樹脂的重量是溶液中固體重量的10倍)，用95%乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥，得到類白色的EGCG單體重量為3. 03g,測純度為99. 2%，EGCG含量為98. 8%，按TP精品中EGCG含量58%計算，收得率為51. 6%。實施例4
TP精品10g，加30ml的去離子水溶解，用DlOl型大孔樹脂柱吸附，大孔樹脂的重量是溶液中固體重量的10倍，然后向柱中加入300ml (為大孔樹脂體積的3倍量)去離子水，待水從柱下端流完，將200ml的10%乙醇水溶液從柱頂端往下流洗，接著用200ml的20%乙醇水溶液、200ml的30%乙醇水溶液、200ml的95%乙醇水溶液依次流洗，收集含EGCG純度為98%以上的洗脫液，往洗脫液中加水使乙醇濃度降至5%，再經同型號的大孔樹脂吸附(大孔樹脂的重量是溶液中固體重量的10倍)，用95%乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥，得到類白色的EGCG單體重量為3. 07g，檢測純度為99. 2%，EGCG含量為99. 0%，按TP精品中EGCG含量58%計算，收得率為52. 4%。實施例5
TP精品10g，加30ml的去離子水溶解，用DM130型大孔樹脂柱吸附，大孔樹脂的重量是溶液中固體重量的10倍，然后向柱中加入300ml (為大孔樹脂體積的3倍量)去離子水，待水從柱下端流完，將200ml的10%乙醇水溶液從柱頂端往下流洗，接著用200ml的20%乙醇水溶液、200ml的30%乙醇水溶液、200ml的95%乙醇水溶液依次流洗，收集含EGCG純度為98%以上的洗脫液，往洗脫液中加水使乙醇濃度降至5%，再經同型號的大孔樹脂吸附(大孔樹脂的重量是溶液中固體重量的10倍)，用95%乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥，得到類白色的EGCG單體重量為3. Og,檢測純度為99. 1%，EGCG含量為98. 8%，按TP精品中EGCG含量58%計算，收得率為51. 1%。實施例6
TP精品IOgJp 30ml的去離子水溶解，用HPD826型大孔樹脂柱吸附，大孔樹脂的重量是溶液中固體重量的10倍，然后向柱中加入300ml (為大孔樹脂體積的3倍量)去離子水，待水從柱下端流完，將200ml的10%乙醇水溶液從柱頂端往下流洗，接著用200ml的20%乙醇水溶液、200ml的30%乙醇水溶液、200ml的95%乙醇水溶液依次流洗，收集含EGCG純度為98%以上的洗脫液，往洗脫液中加水使乙醇濃度降至5%，再經同型號的大孔樹脂吸附(大孔樹脂的重量是溶液中固體重量的10倍)，用95%乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥，得到類白色的EGCG單體重量為3. 04g，檢測純度為99. 7%，含量為99. 3%，按TP精品中EGCG含量58%計算，收得率為52. 0%。實施例7
TP精品IOgJp 30ml的去離子水溶解，用ADS-17型大孔樹脂柱吸附，大孔樹脂的重量是溶液中固體重量的10倍，然后向柱中加入300ml (為大孔樹脂體積的3倍量)去離子水，待水從柱下端流完，將200ml的10%乙醇水溶液從柱頂端往下流洗，接著用200ml的20%乙醇水溶液、200ml的30%乙醇水溶液、200ml的95%乙醇水溶液依次流洗，收集含EGCG純度為98%以上的洗脫液，往洗脫液中加水使乙醇濃度降至5%，再經同型號的大孔樹脂吸附(大孔樹脂的重量是溶液中固體重量的10倍)，用95%乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥，得到類白色的EGCG單體重量為2. 96g，檢測純度為99. 8%，含量為99. 0%，按TP精品中EGCG含量58%計算，收得率為50. 5%。實施例8
干茶葉下腳料(綠茶，而非紅茶)，100g，粉碎成50目，加入2000ml水，加溫至60°C浸泡，調節PH=6，加入由纖維素酶、蛋白酶和果膠酶組成的混合酶(比例I :1 :1)，復合酶用量為茶葉干重的O. 5%，攪拌60min，過濾，重復提取3次，合并濾液經乙酸乙酯萃取后真空濃縮得到茶多酚粗品濃縮物46. 45g。EGCG純度為25. 88%，含量為8. 562% (見附圖2)。取少量粗品濃縮物干燥計算得濃縮物干重是濃縮物的46. 55%。 取茶多酚粗品濃縮物43g(含干重20g)，300ml水溶解，加入CaCl2和ZnCl2混合沉淀劑(混合比例I :I)，Ca2+和Zn2+的量總和為lmol，調節PH=6，攪拌60min，沉淀物過濾、水洗滌，以O. 1%的稀鹽酸溶解后直接經AB-8型大孔樹脂吸附(大孔樹脂的重量是溶液中固體重量的10倍)，用2倍量(Ι/kg)樹脂體積的水流洗，然后95%乙醇洗脫，收集有效洗脫液，在60°C真空濃縮得到茶多酚精品濃縮物4. 71g。EGCG純度為66. 38%，含量為56. 851% (見附圖3)。取少量精品濃縮物干燥計算得濃縮物干重為濃縮物的45. 2%。。取茶多酚精品濃縮物4. 42g (含干重2g)，加6ml的去離子水溶解，用AB-8型大孔樹脂柱吸附，大孔樹脂的重量是溶液中固體重量的10倍，然后向柱中加入60ml (為大孔樹脂體積的3倍量)去離子水，待水從柱下端流完，將40ml的10%乙醇水溶液從柱頂端往下流洗，接著用40ml的20%乙醇水溶液、40ml的30%乙醇水溶液、40ml的95%乙醇水溶液依次流洗，收集含EGCG純度為98%以上的洗脫液，往洗脫液中加水使乙醇濃度降至5%，再經同型號的大孔樹脂吸附(大孔樹脂的重量是溶液中固體重量的10倍)，用95%乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥，得到類白色的EGCG單體重量為O. 63g，檢測純度為99. 13%,含量為98. 738% (見附圖 4)。按干茶葉含茶多酚30%、含兒茶素22%計，通過如下計算，
EGCG 收得率=0. 63*98. 738%* (4. 71/4. 42) * (46. 45/43) / (100*22%) *100%=3· 25%
權利要求
1.從茶葉加工下腳料中制備高純度單體兒茶素的方法，包括提取茶多酚、分離出兒茶素并進行純化，其特征在于エ藝過程包含 A.原料粉碎； B.加水在酸性條件下加入由纖維素酶、蛋白酶和果膠酶組成的復合酶進行酶解； C.過濾后酶解液用こ酸こ酯萃取，萃取液濃縮和/或干燥，得茶多酚粗品； D.將濃縮或/和干燥物加水成液體，調節PH5.6 6. 5，加入CaCl2和ZnCl2混合沉淀劑； E.濾出的沉淀物以稀鹽酸轉溶后直接經大孔樹脂吸附，水洗后，再こ醇洗脫，濃縮こ醇洗脫液和/或干燥，得茶多酚精品；然后， F.加水成液體，用大孔樹脂吸附，水洗后再用こ醇水溶液洗脫，分別收集含EGCG，GCG,ECG純度為98%以上的洗脫液；然后， G.加水使各洗脫液的こ醇濃度為I 10%;然后， H.再分別用與F同型號的大孔樹脂吸附，用90 99.5%こ醇洗脫，洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥得成品。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在干原料取自新鮮茶葉、剪枝茶葉、非發酵過的茶葉加工下腳料，粉碎至20 80目。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于在Bエ序加水量為茶葉干重的10 20倍，PH=3 6. 5，復合酶組成比例為纖維素酶蛋白酶果膠酶=0. I 5 :0. I 5 :0. I 5，復合酶用量為茶葉干重的O. I 1%，溫度40 65°C。
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于在Dエ序加水量為粗品干重的10 20倍，CaCl2和ZnCl2混合沉淀劑的混合比例=1 :0. 01 99，Ca2+和Zn2+的量和與溶液中茶多酌·的量=O. 01 O. 05 (mol/g)。
5.根據權利要求I所述的方法，其特征在于在Eエ序稀鹽酸的濃度為O.1% 10%，水洗的水用量為大孔樹脂體積的I 5倍，こ醇濃度為90% 99. 5%。
6.根據權利要求I所述的方法，其特征在于在Fエ序加水量為精品干重的2 5倍，水洗的水為去離子水，其用量為大孔樹脂體積的I 5倍，之后こ醇水溶液洗脫的程序為用I 3倍樹脂體積量的10%こ醇水溶液洗脫——用I 3倍樹脂體積量的20%こ醇水溶液洗脫——用I 3倍樹脂體積量的30%こ醇水溶液洗脫——用I 3倍樹脂體積量的90% 99. 5%こ醇洗柱。
7.根據權利要求1、5或6所述的方法，其特征在于大孔樹脂選自非極性大孔樹脂、弱極性大孔樹脂和氫鍵型大孔吸附樹脂。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于大孔樹脂選自DlOl、AB-8、DM130、HPD826、ADS-17。
全文摘要
從茶葉加工下腳料中制備高純度單體兒茶素的方法，包括提取茶多酚、分離出兒茶素并進行純化，其工藝過程包含以新鮮茶葉、剪枝茶葉、非發酵過茶葉的加工下腳料為原料，通過加入由纖維素酶、蛋白酶和果膠酶組成的復合酶進行酶解輔助提取茶多酚，然后用由CaCl2和ZnCl2組成的混合沉淀劑對茶多酚進行沉淀、大孔樹脂層析柱一次分離、大孔樹脂層析柱二次純化，得到高純度單體EGCG。本發明不用氯仿，從提取到精制到純化過程銜接緊密，產品質量好，得率高。
文檔編號C07D311/62GK102702163SQ20121017830
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月1日 優先權日2012年6月1日
發明者易建平, 李健, 王家祥 申請人:廣西濟康生物科技有限公司