抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體的制作方法

專利名稱：抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及ー種抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體。特別地，本發明涉及ー種在Fe區的氨基酸序列中具有修飾并且表現出增強的ADCC活性的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體。
背景技術：
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3，GPC3)是ー種存在于細胞表面的硫酸こ酰 肝素蛋白聚糖家族，并且提示GPC3可能參與癌細胞發展和生長中的細胞分化，但是它的功能仍然沒有被很好地闡明。已經發現某種結合GPC3的抗體通過其ADCC(抗體依賴的細胞毒性)活性和⑶C(補體依賴的細胞毒性)具有細胞生長抑制效果(W02003/000883，在此全文引入作為參考)。在發展利用抗體的細胞毒性活性的抗癌癥劑時，期望利用的抗體具有增強的ADCC活性。因此，對于GPC3-識別抗體而言，具有增強的細胞毒性的抗-GPC3抗體是所期望的。本發明的ー個目的是提供ー種與普通抗體相比具有增強的細胞毒性的抗-GPC3抗體。發明概沭發現了ー種具有增強的ADCC活性的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體可通過修飾抗體的Fe區的氨基酸序列而獲得。在ー個方面，本發明提供了ー種包含在Fe區引入的一個或多個氨基酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體。在另一方面，本發明提供了ー種抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體，其中Fe區的位點239、298、326、330和332處的ー個或多個氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代。在另一方面，本發明提供了ー種抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體，其選自(a) Fe區的位點332處的氨基酸殘基被另ー氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體；(b)Fc區的位點239、330和332處的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體；(c)Fc區的位點239、298和332處的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體；(d)Fc區的位點239、326和332處的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體；(e)Fc區的位點239、298、326和332處的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體。在另一方面，本發明提供了ー種抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體，其選自(a)在Fe區的位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；(b)在Fe區的位點239處具有天冬氨酸，在位點330處具有亮氨酸，在位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；(c)在Fe區的位點239處具有天冬氨酸，在位點298處具有丙氨酸，在位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；(d)在Fe區的位點239處具有天冬氨酸，在位點326處具有蘇氨酸，在位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；
(e)在Fe區的位點239處具有天冬氨酸，在位點298處具有丙氨酸，在位點326處具有谷氨酸，在位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體。在另一方面，本發明提供了ー種抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體，其選自(a)Fe區的位點332處的氨基酸殘基被谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；(b)Fc區的位點239、330和332處的氨基酸殘基分別被天冬氨酸、亮氨酸、谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；(c)Fc區的位點239、298和332處的氨基酸殘基分別被天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；(d)Fc區的位點239、326和332處的氨基酸殘基分別被天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；(e)Fc區的位點239、298、326和332處的氨基酸殘基分別被天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體。在另一方面，本發明提供了 ー種包含本發明的杭-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體和藥學上可接受的載體的抗癌劑，以及一種治療癌癥患者的方法，包括給患者施用本發明的抗癌劑。在另一方面，本發明提供了一種制備具有增強的細胞毒性的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體的方法，包括(i)培養ー種工程化宿主細胞，該宿主細胞表達編碼抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體的多核苷酸，其中所述抗體的Fe區的位點239、298、326、330和332處的ー個或多個氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代；和(ii)從培養物中分離抗體。在另一方面，本發明提供了一種制備具有增強的細胞毒性的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體的方法，包括(i)培養ー種工程化宿主細胞，該宿主細胞表達編碼抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體的多核苷酸，其中所述抗體選自(a) Fe區的位點332處的氨基酸殘基被另ー氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體；(b)Fc區的位點239、330和332處的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體；
(c) Fe區的位點239、298和332處的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體；(d)Fc區的位點239、326和332處的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體；(e)Fc區的位點239、298、326和332處的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；和(ii)從培養物中分離抗體。在另一方面，本發明提供了一種制備具有增強的細胞毒性的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體的方法，包括(i)培養ー種工程化宿主細胞，該宿主細胞表達編碼抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體的多核苷酸，其中所述抗體選自 (a)在Fe區的位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；(b)在Fe區的位點239處具有天冬氨酸，在位點330處具有亮氨酸，在位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；(c)在Fe區的位點239處具有天冬氨酸，在位點298處具有丙氨酸，在位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；(d)在Fe區的位點239處具有天冬氨酸，在位點326處具有蘇氨酸，在位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；(e)在Fe區的位點239處具有天冬氨酸，在位點298處具有丙氨酸，在位點326處具有谷氨酸，在位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；和(ii)從培養物中分離抗體。在另一方面，本發明提供了ー種抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體，其選自(a)具有包含SEQ ID NO :34所示氨基酸序列的CH2-CH3結構域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體；(b)具有包含SEQ ID NO 35所示氨基酸序列的CH2-CH3結構域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體；(c)具有包含SEQ ID NO 36所示氨基酸序列的CH2-CH3結構域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體；(d)具有包含SEQ ID NO 37所示氨基酸序列的CH2-CH3結構域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體；和(e)具有包含SEQ ID NO 38所示氨基酸序列的CH2-CH3結構域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體。本發明提供了 第I項.ー種包含在Fe區導入的一個或多個氨基酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體。第2項.ー種抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體，其中Fe區的位點239、298、326、330和332處的ー個或多個氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代。第3項.ー種抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體，其選自(a)Fe區的位點332的氨基酸殘基被另ー氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體；(b)Fc區的位點239、330和332處的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體；(c)Fc區的位點239、298和332處的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體；(d)Fc區的位點239、326和332處的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體；(e)Fc區的位點239、298、326和332處的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體。第4項.ー種抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體，其選自 (a)在Fe區的位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；(b)在Fe區的位點239處具有天冬氨酸，在位點330處具有亮氨酸，在位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；(c)在Fe區的位點239處具有天冬氨酸，在位點298處具有丙氨酸，在位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；(d)在Fe區的位點239處具有天冬氨酸，在位點326處具有蘇氨酸，在位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；(e)在Fe區的位點239處具有天冬氨酸，在位點298處具有丙氨酸，在位點326處具有谷氨酸，在位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體。第5項.ー種抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體，其選自(a)Fe區的位點332處的氨基酸殘基被谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；(b)Fc區的位點239、330和332處的氨基酸殘基分別被天冬氨酸、亮氨酸、谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；(c)Fc區的位點239、298和332處的氨基酸殘基分別被天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；(d)Fc區的位點239、326和332處的氨基酸殘基分別被天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；(e)Fc區的位點239、298、326和332處的氨基酸殘基分別被天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體。第6項.ー種包含第1-5項任ー項所述的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體和藥學上可接受的載體的抗癌劑。第7項.一種治療癌癥患者的方法，包括給患者施用如第6項所述的抗癌劑。第8項.一種制備具有增強的細胞毒性的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體的方法，包括(i)培養ー種工程化宿主細胞，該宿主細胞表達編碼抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體的多核苷酸，其中所述抗體的Fe區的位點239、298、326、330和332處的ー個或多個氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代；和(ii)從培養物中分離所述抗體。
第9項.一種制備具有增強的細胞毒性的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體的方法，包括(i)培養ー種工程化宿主細胞，該宿主細胞表達編碼抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體的多核苷酸，其中所述抗體選自(a) Fe區的位點332處的氨基酸殘基被另ー氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體；(b)Fc區的位點239、330和332處的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體；(c)Fc區的位點239、298和332處的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體； (d)Fc區的位點239、326和332處的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體；(e)Fc區的位點239、298、326和332處的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；和(ii)從培養物中分離所述抗體。第10項.一種制備具有增強的細胞毒性的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體的方法，包括(i)培養ー種工程化宿主細胞，該宿主細胞表達編碼抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體的多核苷酸，其中所述抗體選自(a)在Fe區的位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；(b)在Fe區的位點239處具有天冬氨酸，在位點330處具有亮氨酸，在位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；(c)在Fe區的位點239處具有天冬氨酸，在位點298處具有丙氨酸，在位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；(d)在Fe區的位點239處具有天冬氨酸，在位點326處具有蘇氨酸，在位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；(e)在Fe區的位點239處具有天冬氨酸，在位點298處具有丙氨酸，在位點326處具有谷氨酸，在位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體；和(ii)從培養物中分離所述抗體。第11項.ー種抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體，其選自(a)具有包含SEQ ID NO :34所示氨基酸序列的CH2-CH3結構域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體；(b)具有包含SEQ ID NO 35所示氨基酸序列的CH2-CH3結構域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體；(C)具有包含SEQ ID NO 36所示氨基酸序列的CH2-CH3結構域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體；(d)具有包含SEQ ID NO 37所示氨基酸序列的CH2-CH3結構域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體；(e)具有包含SEQ ID NO 38所示氨基酸序列的CH2-CH3結構域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體。


圖I顯示了制備本發明的Fe-修飾的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體的方案。圖2顯示了純化的本發明的Fe-修飾的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體的SDS-PAGE分析結果。圖3顯示了通過凝膠滲透柱分析的純化的Fe-修飾的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體的色譜圖。圖4顯示了利用來源于人外周血的PBMC，Fe-修飾的和野生型人源化抗-磷脂酰 肌醇蛋白聚糖_3抗體對SK-03細胞的ADCC活性。圖5顯示了利用來源于小鼠骨髄的效應細胞，Fe-修飾的和野生型人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體對HepG2細胞的ADCC活性。發明詳沭本發明提供了ー種在Fe區具有修飾的抗體。圖I顯示了本發明的Fe-修飾的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體的結構和制備方案。通常，抗體是大約150，000道爾頓的異四聚體，包含兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)。每條輕鏈通過一個共價ニ硫鍵與重鏈結合，并且重鏈之間的ニ硫鍵數目根據抗體的同種型而改變。重鏈和輕鏈均具有相隔一定間距的鏈內ニ硫鍵。每條重鏈在其ー個末端具有可變區(VH)，并且具有與其連接的多個恒定區。每條輕鏈在其ー個末端具有可變區(VL)，并且在另一端具有恒定區。輕鏈的恒定區與重鏈的第一恒定區平行，輕鏈的可變區與重鏈的可變區平行。確信特定氨基酸殘基組成了輕鏈和重鏈可變區的界面(Clothia等人，J. Mol. Biol.，186 :651-666 (1985) ；Novotny 和 Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA82 4592-4596 (1985)，在此全文引入作為參考)。來源于脊椎動物的抗體的輕鏈基于其恒定區氨基酸序列可分為兩種不同的類型，稱為kappa(K)和IambdaO )。另外，抗體基于其重鏈恒定區的氨基酸序列可分為不同的類別。抗體包括至少五種主要類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中的ー些可分為亞類(同種型)，例如，IgG-l、IgG-2、IgG-3和IgG-4 ;IgA-l和IgA-2。不同類別的重鏈恒定區稱為α、δ、ε、Y和μ。每ー類別的免疫球蛋白的亞單元結構和三維結構是本領域已知的。也已知在 IgG-I 的 Fe 區的序列中存在同種異型，例如，Glm(I)、nGlm(l)、Glm(2)、Glm(3)、nGlm(17)Φ (M. S. Schanfield 和 E. van Loghem, “Human Immunoglobulin Allotypes，，Handbook ofExperimental Immunology, Vol. 3, ch94, ppl-18, Blackwe丄丄 Scientific Publishers.Oxford, U. K. 1986,4th Edition，在此全文引入作為參考)。Fe區表示抗體分子的Fe片段區域，包含鉸鏈區、CH2和CH3結構域的一部分，并且具有大約50，000的分子量。在分子用木瓜蛋白酶消化時，人IgG重鏈Fe區是從第225位的蘇氨酸到 C 末端(Burton, D. R. 1985. Immunoglobulin G !functional sites. Mol.Immunol. 22 :161_206，在此全文引入作為參考)。此處使用的氨基酸位點的編號參照Kabat等人的“EU指數”方法(Kabat EA等人，1991, Sequence of Proteins of Immunological Interest. 5th Ed. NIH,在此全文弓I入作為參考)。Fe區與效應細胞例如巨噬細胞和NK細胞的細胞表面上存在的Fe受體(FcR)結合。Fe受體參與抗體依賴的細胞毒性(ADCC)、過敏反應、id反應,等等。Fe受體的類型根據免疫球蛋白的亞型而改變。例如，IgG的Fe受體是Fe Y受體；IgE的Fe受體是Fe ε受體；IgA的Fe受體是Fe α受體。CH2-CH3域由CH2域和CH3域組成。人IgG重鏈的CH2-CH3域從第233位的丙氨酸到C-末端。Fe-修飾的杭體本發明的抗體是Fe-修飾的抗體，其中Fe區的氨基酸序列被修飾。本發明中使用的“修飾”或“位點特異性誘變(誘變)”包括用任何其他的氨基酸殘基取代原始(未修飾的)氨基酸殘基，刪除原始氨基酸殘基，和添加其他氨基酸殘基，但是優選地指用任何其他 的氨基酸殘基取代原始的氨基酸殘基。在此所指的原始(未修飾的)氨基酸序列通常是天然Fe區序列。在上下文中，氨基酸殘基的“修飾”和“誘變”以相同意義使用。在本發明中，氨基酸殘基的修飾可通過使編碼抗體的DNA突變而完成。在本發明中，“DNA突變”表示DNA以可能相應于待修飾的氨基酸殘基的方式被突變。更特別地，其表示編碼原始氨基酸殘基的DNA突變為編碼待修飾的氨基酸殘基的DNA。通常，它表示插入、缺失或取代原始DNA中的至少ー個核苷酸以產生編碼目的氨基酸殘基的密碼子的基因工程或誘變處理。特別地，編碼原始氨基酸殘基的密碼子用編碼待修飾的氨基酸殘基的密碼子取代。本領域技術人員按照已知技術可以容易地進行所述DNA突變，例如，按照位點特異性誘變方法例如PCR誘變方法(Hashimoto-Gogoh，Τ.等人，(1995)Gene 152,271-275 ；Zoller, MJ 和 Smith, Μ.，(1983)Methods EnzymoI.，100,468-500 ；Kramer, ff.等人，(1984)Nucleic Acids, Res.,12,9441-9456 ；Kramer ff.和 Fritz HJ,(1987)Methods EnzymoI. ,154,350-367 ；Kunkel,TA, (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,488-492 ；KunkeI, (1988)Methods EnzymoI.，85，2763-2766，均在此全文引入作為參考)。本發明中待修飾的Fe區的氨基酸殘基的數目沒有特別限制，可以修飾一個或多個(例如，從I到30個，或2、3、4或5個)氨基酸殘基。優選地，Fe區的位點239、298、326、330和332處的ー個或多個氨基酸殘基用其他氨基酸殘基取代。另外，Fe區的任意氨基酸殘基可用IgGl的任意同種異型的氨基酸殘基取代，例如，用Glm(I)和nGlm⑴的氨基酸殘基取代。本發明的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體沒有特別限制，只要它與磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3結合，但是優選地，該抗體特異性地與磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3結合。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的基因序列和氨基酸序列是已知的(Lage，H.等人，Gene 188 (1997)，151-156，在此全文引入作為參考)。本發明的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體優選地是IgG，更優選 IgGl。細胞毒件本發明的包含修飾的Fe區的杭-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體與具有天然或野生型Fe區的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體相比顯示出增強的細胞毒性。細胞毒性活性包括，例如，抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)活性，和補體依賴的細胞毒性(CDC)活性。在本發明中，CDC活性表示由補體系統引起的細胞毒性活性；ADCC活性表示，當特異性抗體粘附到靶細胞的細胞表面抗原上，具有Fe Y受體的細胞(例如，免疫細胞)通過Fe Y受體與Fe區結合，以此損傷靶細胞。確定抗體是否具有ADCC活性或⑶C活性可根據已知方法進行(例如，見CurrentProtocols in Immunology, Chapter 7， Immunologic Studies in Humans， Eaitor, JohnE. Coligan 等人，John Wiley&Sons, Inc. (1993)，在此全文引入作為參考)。例如，ADCC活性可以如下確定混合效應細胞、靶細胞和抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體,然后分析其ADCC活性的程度。效應細胞可包括，例如，小鼠脾細胞，或分離自骨髓或人外周血的單核細胞。靶細胞可包括建立的人細胞系，例如人肝細胞系HuH-7。將抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體加入到預先用51Cr標記并孵育的靶細胞中，然后以適當的比例將效應細胞加入到靶細胞中。孵育之后，收集上清液并分析放射活性，以確定抗體的ADCC活性。 ⑶C活性可如下確定混合上述標記的靶細胞和抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體，添加補體到混合物中并孵育，然后分析上清液的放射性。技述此處所述的術語“抗體”以其最廣泛的含意使用，表示任何和每種抗體，包括單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、抗體突變體、抗體片段、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、嵌合抗體、人源化抗體等，只要其顯示出期望的生物學活性。抗體和免疫球蛋白是具有相同結構特征的蛋白質，并且本發明的抗體包括免疫球蛋白。此處所述的術語“單克隆抗體”表示從實質上均質的抗體組中獲得的抗體，或者說，除了可能自然發生的少數突變體之外，該抗體組中的所有特定抗體是一致的。單克隆抗體是高度特異性的，通常作用于單個抗原位點。而且，與一般包括針對不同表位的不同抗體的普通多克隆抗體制劑相比，每種單克隆抗體針對ー種抗原上的單個表位。除了其特異性之外，單克隆抗體還具有另外ー個優點，即，它通過培養雜交瘤而合成，不會污染任何其他抗體。修飾語“單克隆”表示從實質上一致的抗體組中獲得的抗體的性質，不需要通過特定方法生產抗體。例如，本發明使用的單克隆抗體可根據(例如)雜交瘤方法(Kohler和Milstein，Nature 256 :495 (1975)，在此全文引入作為參考)或重組方法(USP4，816，567，在此全文引入作為參考)生產。本發明使用的單克隆抗體也可從噬菌體抗體文庫中分離(Clackson 等人,Nature352 :624-628 (1991) ;Marks 等人，J. Mol. Biol. , 222 581-597(1991)，均在此全文引入作為參考)。術語“抗體片段”表示全長抗體的一部分。本發明中使用的抗體片段優選地是保持抗體結合活性并且保持全長抗體的細胞毒性的抗體片段。多特異性抗體是對至少兩種不同抗原具有特異性的抗體。通常，這種類型的分子可與兩種抗原結合(即，雙特異性抗體)，但是在本說明書中，“多特異性抗體”包括對兩種以上的(例如，三種)抗原具有特異性的抗體。多特異性抗體可以是全長抗體或所述抗體的片段。例如，雙特異性抗體可識別兩種不同的抗原或可識別ー個抗原的不同表位。另外，其可識別細胞毒性物質。本發明的抗體也可以是嵌合抗體或人源化抗體。通常，嵌合抗體包含源于非人哺乳動物抗體的可變區，和源于人抗體的恒定區。另ー方面，人源化抗體包含源于非人哺乳動物的互補決定區，和源于人抗體的框架區和恒定區。嵌合抗體中的可變區的來源和人源化抗體中的CDR的來源沒有特別限制，可來源于任何動物。例如，可以利用源于小鼠抗體、大鼠抗體、兔抗體或駱駝抗體的任何序列(CookWJ等人，Protein Eng. 1996Jul 9(7) :623-8 ;Tsurushita N等人，J Tmmunol Methods. 2004Dec295(l_2) :9-19 ；Sato K 等人，Mol Tmmunol. 1994 Apr 31(5) :371-81 ；Preparationof genetically engineered monoclonal antibodies for human immunotherapy. HumAntibodies Hybridomas. 1992 Jul 3(3) :137-45 ;Genetically engineered antibodies progress and prospects. Crit Rev Immunol. 1992 ; 12 (3-4) :125-68,均在此全文引入作為參考)。對于嵌合抗體和人源化抗體的恒定區，可利用源于人抗體的恒定區。例如，H-鏈可利用C Y 1> C Y 2> C Y 3> C Y 4, L-鏈可利用Ck和CA。嵌合抗體是通過組合源于不同動物的序列而構建的抗體，例如，它是包含小鼠抗 體的重鏈和輕鏈可變區以及人抗體的重鏈和輕鏈恒定區的抗體。所述嵌合抗體可用任何已知的方法構建。例如，連接編碼小鼠抗體可變區的DNA和編碼人抗體恒定區的DNA，然后將其插入到ー種表達載體中，并且導入到宿主中，以產生目標抗體。人源化抗體，也被稱為重構人抗體，通過將非人哺乳動物的抗體例如小鼠抗體的互補決定區(CDR)移植到人抗體的互補決定區之中而構建。制備人源化抗體的常用遺傳重組方法是本領域已知的(見EP 125023 ;W096/02576，在此全文引入作為參考)。特別地，為了將小鼠抗體的⑶R與人抗體的框架區(FR)連接而設計的DNA序列可通過PCR方法合成，該PCR方法使用構建為具有與⑶R和FR末端區域重疊部分的幾種寡核苷酸作為引物(見W098/13388中描述的方法，在此全文引入作為參考)。選擇將要與CDR連接的人抗體的框架區，以使互補決定區可形成良好的抗原結合位點。如果期望，抗體可變區的框架區的氨基酸可被取代，以使重構人抗體的互補決定區可形成適合的抗原結合位點(Sato, K.等人,Cancer Res. (1993) 53,851-856,在此全文引入作為參考)。另外，本發明的抗體也包括在上述Fe區特定位點之外的區域或⑶R區中具有ー個或多個氨基酸突變的抗體，和與本發明抗體功能等價的抗體。為了制備包含與某種多肽不同的氨基酸序列但功能等價的多肽，本領域技術人員公知向多肽中導入突變的方法。例如，本領域技術人員可按照位點特異性誘變或類似方法向本發明的抗體中導入突變，以制備與該抗體功能等價的抗體。氨基酸突變也可自發發生。優選地，一種氨基酸殘基被突變為具有與原始殘基接近的側鏈性質的另一氨基酸殘基。例如，關于其性質，氨基酸側鏈包括疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、具有脂肪族側鏈的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、側鏈含羥基的氨基酸(S、T、Y)、側鏈含硫原子的氨基酸(C、M)，側鏈含羧酸和氨基的氨基酸(D、N、E、Q)、側鏈含堿基的氨基酸(R、K、H)，具有芳香族側鏈的氨基酸(H、F、Y、W)(括號中的字母是氨基酸的單字母代碼)。已知具有通過ー個或多個氨基酸殘基的缺失、添加和/用任何其他氨基酸取代而從原始氨基酸序列修飾的氨基酸序列的多肽仍然實質上保持了原始多肽的生物學活性(Mark, D. F.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666 ；Zoller,M. J.和 Smith, Μ· , Nucleic Acids Research (1982) 10,6487-6500 ；ffang, A.等人，Science224，1431-1433 ；Dalbadie-McFarland, G.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79，6409-6413，全部在此全文引入作為參考)。用于本發明的抗體可以是與不同類型的分子例如非肽聚合物如聚こニ醇(PEG)、放射性物質和毒素結合的偶聯抗體。所述偶聯抗體可通過抗體的化學修飾而獲得。化學修飾方法在本領域中已經建立。本發明的抗體可包括這些偶聯抗體(D. J. King.，Applications and Engineering of Monoclonal antibodies. ,1998 T.J.Internationa丄Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer. ,1998 Marcel Dekker Inc ；Chari等人，Cancer Res.，1992 Vol 152 :127 ;Liu 等人，Proc Natl Acad Sci USA.，1996 Vol 93 8681，均全文在此引入作為參考)。杭體制各 本發明的抗體可根據本領域技術人員已知的方法制備。具體而言，將編碼目標抗體的DNA插入到ー種表達載體中。在此步驟中，DNA以可在表達控制區例如增強子和啟動子的控制之下表達的方式插入到表達載體中。接下來，用表達載體轉染宿主細胞，并且在宿主細胞中表達抗體。在這ー過程中，可利用適合的宿主和適合的表達載體的組合。載體的例子包括M13 載體、pUC 載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script。對于cDNA的亞克隆和分離，例如，也可利用pGEM-T、pDIRECT和pT7。表達載體對于抗體生產是特別有用的。當大腸桿菌例如JM109、DH5 α、HBlOl或XLl-Blue用作宿主時，表達載體必須不可缺少地具有驅動載體在大腸桿菌中有效表達的啟動子，例如，IacZ 啟動子(Ward 等人，Nature (1989) 341，544-546 ；FASEB J. (1992)6，2422-2427，在此全文引入作為參考)、araB啟動子(Better等人，Science (1988) 240，1041-1043，在此全文引入作為參考)或T7啟動子。這種類型的載體也包括PGEX-5X-1 (Pharmacia)、QIA表達系統(QIAGEN)、pEGFP和pET (在此情況中，宿主優選為表達T7RNA聚合酶的BL21)。載體可包括用于多肽分泌的信號序列。對于用于多肽分泌的信號序列，例如，pelB信號序列(Lei,S. P.等人，Bacteriol. (1987) 169，4397，在此引入作為參考)可用于在大腸桿菌周質中生產。載體向宿主細胞中的導入可(例如)按照氯化鈣方法或電穿孔方法來實現。除了大腸桿菌表達載體，本發明中用于多肽生產的載體包括，例如，來源于哺乳動物的表達載體(例如，pcDNA3 (Invitrogen)、pEGF_B0S (Nucleic acids, Res.，1990,18 (17)，p.5322，*l$A,*.,)、pEF、pCDM8);來源于昆蟲細胞的表達載體(例如，Bac-toBAC桿狀病毒表達系統(GIBC0 BRL)、pBacPAK8);來源于植物的表達載體(例如，pMHl、pMH2)；來源于動物病毒的表達載體(例如，pHSV、pMV、pAdexLcw)，來源于逆轉錄病毒的表達載體(例如，pZIPneo),來源于酵母的表達載體(例如，畢赤酵母表達試劑盒(Invitrogen)、pNVlUSP-QOl);來源于枯草桿菌的表達載體(例如，pPL608、pKTH50)。對于在動物細胞例如CHO細胞、COS細胞或NIH3T3細胞中的表達，載體必須不可缺少地具有細胞內表達所需的啟動子，例如，SV40啟動子(Mulligan等人，Nature (1979) 277，108，在此全文引入作為參考)、MMTV-LTR啟動子、EFla啟動子(Mizushima等人，NucleicAcids Res. (1990) 18，5322，在此全文引入作為參考)、CAG 啟動子(Gene (1991) 108，193，在此全文引入作為參考)、CMV啟動子。優選地，載體具有用于篩選被轉化細胞的基因(例如，能夠用藥物(例如，新霉素，G418)區別的抗藥性基因)。具有所述特性的載體包括，例如，pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13。進ー步，為了在細胞中穩定基因表達和提高基因拷貝數，將具有互補的DHFR基因的載體(例如，pCHOI)導入核酸合成途徑缺陷的CHO細胞中以補救該缺陷，并應用氨甲喋呤(MTX)擴增。為了基因瞬時表達的目的，用具有SV40復制起點的載體(例如，pcd)轉化在染色體上具有表達SV40T抗原的基因的COS細胞。復制起點也可來源于多瘤病毒、腺病毒、牛多瘤病毒(BPV)，等等。進ー步，為了在宿主細胞系統中增加基因拷貝數，表達載體可包含選擇性標記物，例如氨基糖苷轉移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Ecogpt)基因、ニ氫葉酸還原酶(dhfr)基因。藥物纟目合物本發明也涉及ー種包含本發明抗體的藥物組合物。由于本發明的抗體表現出增強 的細胞毒性活性，因此它適合用于藥物組合物中，并且特別地，它作為抗癌劑是有用的。由于已經表明抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體對來源于肝癌的細胞系具有細胞毒性(例如，W003/00883，在此全文引入作為參考)，本發明的抗體作為治療肝癌的藥物是特別有用的。當本發明的抗體在藥物組合物中使用時，考慮到對人的抗原性，優選人源化抗體。本發明的藥物組合物可包含藥學上可接受的載體。藥學上可接受的載體包括，例如，無菌水、生理鹽水、穩定劑、賦形劑、抗氧化劑(例如，抗壞血酸)、緩沖液(例如，磷酸、檸檬酸、其他有機酸)、防腐劑、表面活性劑(例如，PEG、Tween)、螯合劑(例如，EDTA)或粘合剤。另外，本發明的藥物組合物可進ー步包含任何其他低分子多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、賴氨酸；糖，例如多糖、單糖；碳水化合物；糖醇，例如甘露醇、山梨糖醇。當組合物制備為注射用水溶液吋，它可與等滲溶液組合，該等滲溶液包含，例如，生理鹽水、葡萄糖或其他任何輔劑，例如，D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉，并且與適當的溶解助劑組合，例如醇(例如，こ醇)、多元醇(例如，丙ニ醇、PEG)、非離子表面活性劑(例如，聚山梨酯80、HC0-50)。如果期望，可將組合物包封到微膠囊中(羥甲基纖維素、明膠、聚(甲基丙烯酸甲酷)等的微膠囊)，或可形成為膠體給藥系統(例如，脂質體、白蛋白微球、微乳劑、納米顆粒、納米膠囊)(見 Remington' s Pharmaceutical Science, 16th edition, Oslo Ed.,1980，在此全文引入作為參考)。而且，配制緩釋藥物的方法是已知的并可應用于本發明(Langer 等人，J. Biomed. Mater. Res.，1981,15 :167-277 ；Langer, Chem. Tech.，1982,12 98-105 ；USP 3, 773, 919 ；EP 58，481 ;Sidman 等人，Biopolymers 1983，22 :547-556 ;EP133，988)。組合物可通過ロ服或腸胃外施用于患者，但優選腸胃外途徑。本發明藥物組合物的形狀(制劑劑型)沒有特別限制，包括，例如，注射劑、經鼻制劑、經肺制劑、經皮制劑、凍干制劑、溶液。優選的是凍干制劑。凍干可以采用本領域技術人員公知的任何方法實現(Pharm. Biotechnol. , 2002,13，109-133 ；Int.J. Pharm.，2000，203(1-2)，1-60 ；Pharm. Res.，1997，14(8)，969-975，均在此全文引入作為參考)。例如，將組合物溶液適當地等分到凍干小瓶或類似容器中，井置于冰箱或凍干機中，或浸入冷凍劑例如丙酮/干冰和液氮中。當抗體制劑形成為高濃度溶液制劑時，它可根據本領域技術人員公知的方法制備。例如，可采用J. Pharm. Sci. , 2004,93 (6)，1390-1402(在此全文引入作為參考)描述的利用TFF膜的膜濃縮法。注射制劑可以全身或局部給藥，例如，以靜脈內注射、肌肉內注射、腹膜內注射或皮下注射的方式。根據施用組合物的患者的年齡和狀況，可適當地選擇給藥方法。劑量可選自，例如，單元劑量為從O. 0001mg/kg體重到1000mg/kg體重的范圍。可選地,劑量可選自O. 001到IOOOOOmg/體重的范圍。然而，本發明不應局限于上述劑量和給藥方法。本發明將參考下面的實施例進行更詳細的描述，但本發明不應局限于這些實施例。
實施例實施例I :Fc_修飾的抗-GPC3抗體的產生
實施例1-1 :用于誘變的Fe盒的制備Fe修飾的人源化抗-GPC3抗體在SEQ ID NO : 19所示的H-鏈氨基酸序列中具有下表所示的氨基酸取代。圖I顯示了本發明的Fe-修飾的抗體的結構和制備策略。
V22「 I332E
V209S239D/A330L/I332E
V212S239D/S298A/I332E
V922S239D/K326T/I332E
V1608S239D/S298A/K326T/I332E
V209nGlm(l) S239D/A330L/I332E/D356E/L358M利用SEQ ID NO 1到NO 9所示的引物，根據PCR步移法產生了用于構建五種名為V22、V209、V212、V922和V1608的Fe-修飾抗體的Fe-突變盒。具體地，通用引物Fl和通用Rl用于V22、V209和V922 ;引物212-F1和212-F1用于V212和V1608。在下述的PCR反應溶液中進行第一階段PCR 混合5 μ I的X 10K0D緩沖液、分別5 μ I和2 μ I的dNTPs和MgCl2 (附帶于KOD聚合酶中，Toyobo)。加入上述引物組合(2(^11101/1，各1“1)、(1!120 35. 5 μ I和5單位/μ IKOD聚合酶0. 5 μ 1，以產生50 μ I的總量。PCR在下述條件下進行。96 0C I 分鐘；(98 0C 15 秒；65°C 2 秒；74°C 15 秒)X 2 循環；74°C 30 秒；4°C。取出一微升的第一階段擴增產物，用于接下來的第二階段PCR反應。具體地，通用引物F2和212-R2用于V22和V212 ;通用引物F2和209-R2用于V209 ;通用引物F2和922-R2用于V922 ;通用引物F2和1608-R2用于V1608。第二階段PCR在下述PCR反應溶液中進行混合X 10K0D緩沖液5 μ I、dNTPs和MgCl2分別5 μ I和2 μ I (附帶于KOD聚合酶中，Toyobo)。加入上述引物組合(20μπιΟ1/1，各1μ 1)、1μ I的第一階段擴增產物作為模板、dH20 35. 5 μ I和5單位/ μ I KOD聚合酶0. 5 μ 1，以產生51 μ I的總量。PCR在下述條件下進行。
96 °C I 分鐘；(98°C 15 秒；65°C 2 秒；74°C 15 秒)X 5 循環；74°C 30 秒；4°C。取出一微升的第二階段擴增產物，用于接下來的第三階段PCR反應。具體地，通用引物F3和通用R3用于V22、V209、V212、V922和V1608，第三階段PCR在下述PCR反應溶液
中進行。混合X 10K0D緩沖液5 μ I、dNTPs和MgCl2分別5 μ I和2 μ I (附帶于KOD聚合酶中，Toyobo)。加入上述引物組合(2(^11101/1，各1レ1)、1レ1的第二階段擴增產物作為模板、dH20 35. 5 μ I和5單位/μ IKOD聚合酶O. 5μ1，以產生51 μ I的總量。利用這些，在下述條件下進行PCR。960C I 分鐘；(98°C 15 秒；65°C 2 秒；74°C 20 秒)X 35 循環；74°C I 分鐘；4°C。·
將獲得的每個片段亞克隆入pBluescriptSK+中并確認其序列。正向引物212-F1(SEQID NO 1)agttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacgccacgtaccgtgtggtcagcgtcc正向引物通用F2(SEQ ID NO 2)tctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggagg正向引物通用F3(SEQ ID NO 3)gcacctgagctcctggggggaccggacgtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtgg反向引物212-R1(SEQID NO 4)ggagaccttgcacttgtactccttgccattcagccagtcctggtgcaggacggtgaggacgctgaccacacggtacgtggcgttgtactgctcc反向引物209-R2(SEQID NO 5)ggctgccctttggctttggagatggttttctcctcgggcagtgggagggctttgttggagaccttgcacttgtactccttgccattcagcc反向引物212-R2(SEQID NO 6)ggctgccctttggctttggagatggttttctcctcgggggctgggagggctttgttggagaccttgcacttgtactccttgccattcagcc反向引物922-R2(SEQID NO 7)ggctgccctttggctttggagatggttttctcctcgggggctgggagggcggtgttggagaccttgcacttgtactccttgccattcagcc反向引物1608-R2(SEQID NO 8)ggctgccctttggctttggagatggttttctcctcgggggctgggagggcctcgttggagaccttgcacttgtactccttgccattcagcc反向引物通用R3 (SEQ ID NO 9)gagctccccgggatgggggcagggtgtacacctgtggttctcggggctgccctttggctttggagatggttttctcctcgg實施例1-2 :表達Fe-修飾的抗-GPC3抗體的載體的制備根據發明人先前制備的編碼人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體的基因(H-鏈，SEQ ID NO :10 ;L-鏈，SEQ ID NO :11)，構建ー種用于表達本發明的Fe-修飾的抗-GPC3抗體的載體，其在下面的實施例中被稱為“野生型”。野生型人源化抗-GPC3抗體的H-鏈可變區和L-鏈可變區的氨基酸序列分別顯示于 SEQ ID NO 21 (ver. k)和 SEQ ID NO 22 (ver. a)中。野生型人源化抗-GPC3 抗體的 CDR序列顯示如下。H-鏈CDRl DYEMH (SEQ ID NO 23)CDR2 ALDPKTCDTAYSQKFKG(SEQ ID NO :24)CDR3 FYSYTY(SEQ ID NO 25)
L-鏈CDRl RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID NO 26)CDR2 KVSNRFS(SEQ ID NO 27)CDR3 SQNTHVPPT(SEQ ID NO 28)利用SEQ ID NO : 10所示的杭-人GPC3抗體H-鏈基因作為模板，利用預先引入作為沉默突變的ー個SacI位點的SEQ ID NO :11的引物和SEQ ID NO : 12的引物，在下述條件下進行PCR。混合X 10K0D緩沖液5 μ I、dNTPs和MgCl2分別5 μ I和2 μ I (附帶于KOD聚合酶中，Toyobo)。加入如上所述的引物組合(2(^11101/1，各14 1)、14 1的GPC3抗體H-鏈基因作為模板、dH20 34. 5 μ I和5單位/ μ I KOD聚合酶O. 5 μ 1，以得到50 μ I的總量。在下述條件下進行PCR。960C I 分鐘；(98°C 15 秒；65°C 2 秒；74°C 30 秒)X 35 循環；74°C 30 秒；4°C。將獲得的片段導入到pBluescriptSK+(pB-Sacless)的SmaI位點內，其中SacI位點已經事先用DNA平端化試劑盒(Takara Bio)補平，并且確認其序列(pB-GPCSacmt)。接下來，從包含SEQ ID NO 10所示抗-GPC3抗體H-鏈基因的載體上切下大約290bp的SmaI-BamHI片段，該片段對應于抗-人GPC3抗體H-鏈的C-末端序列，將該片段導入到pB-GPCSacmt (pB-GPCSacmtC)的相應位點中。接下來，將實施例1-1中產生的V22、V209、V212、V922或V1608的Fe-突變盒導入到pB-GPCSacmtC的SacI-SmaI位點中，并且確認pB-GPCSacmtC的序列。進一歩，為了完成突變的H-鏈的構建，將SEQ ID NO 10所示GPC3抗體H-鏈基因的大約415bp的EcoRI-NheI片段與其連接，以獲得編碼Fe-突變的H-鏈的基因。獲得的編碼突變H-鏈的基因用EcoRI-NotI酶切，并導入到動物細胞表達載體pCXND3(pC-aGPCh)的相應位點中。接下來，用HindIII酶切包含SEQ ID N0:13所示的抗-GPC3抗體L-鏈基因和啟動子區的大約3. Ikb的片段，并且與pC-aGPCh的相應位點連接，以獲得抗-GPC3抗體表達載體(pC-aGPChl)。V22、V209、V212、V922和V1608的載體 pC-aGPChl 被分別命名為 pC-aGPChl (22)、pC-aGPChl (209)、pC-aGPChl (212)、pC-aGPChl(922)和 pC-aGPChl(1608)。V22、V209、V212、V922和V1608的H鏈的氨基酸序列分別顯示于V22(SEQ ID NO:29)、V209(SEQ ID NO :30)、V212 (SEQ ID NO :31)、V922 (SEQ ID NO :32)和 V1608(SEQ IDNO 33)中。V22、V209、V212、V922和V1608的CH2-CH3結構域的氨基酸序列分別顯示于〔021 ￡ ATTACTGTACAAGATTCTACTCCTATACTTACTGGGGCCAGGGAA〔0220U 000^00^0>000^0^00^0>00^>00>00 000000>^000^0〔0221U TTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGOI--10222U GGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGA〔0223Uoggtgtogtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacao
I--10224U OTTOCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAG—0225U 00^00^0>000^0000^00>00>00^^0000>000>0>00^>0>
I--10226I——I^0^00 00^0 ^0>0 0000>00 0>00 00^00>0
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I--10228Uoosooo>oo>oo,po o,poo,pooggggaccgtcagtcttcctcI--10229U joooooo ooo oo>o>oCCTCATGATCTCCCGGACCCC
〔023s TGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCT〔0231U ^^OTCMGTTCMCTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATMI--10232U hooo o>o> oooooooc)aggagcagtacaacagcacgtaoI--10233Uο ο ο>οο ο3ο>οο οο,ροο>οο>οο>οτοοοτ6αα
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〔0232 GAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGI--10237U >oo o oo>oojoagcctgacctgcctggtcaaaggcttcta
I--10238I——I
I--1023S 0>0 0 0^>0 0>00>0000^0000^00^00>0^000>00
I--10240UOOTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGG
〔0241U hoooagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggo〔0242U hotgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgg
I--10243I——I
〔0244〕 I蓉NSIF (SEQ ID NO :11)
〔02私O」 gcr+agcaccaagggcccar+cggr+cr+r+cccccr+ggcacccr+ccr+cc
19
反向引物NS_R(SEQID NO :12)gagctcaggtgctgggcacggtgggcatgtgtgagttttgtcac杭-人GPC3 抗體 L-鏈(SEQ ID NO : 13)AAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCGTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATT
AGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTT CCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGT
GCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTC
CAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCCTCGAGCCACCATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACA GTAATAGGAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCTCTCAAAATACACATGTTCCTCCTACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAA
GTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGATAAGTCGAGGTCGAGGAATTCACTCCTCAGGTGCAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCACAAATACCACTGAGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACA
TATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCAACATATGCCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTTGGCTATAAAGAGGTCATCAGTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTTGACTTGAGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAAATTTTCCTTACATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCATAGCTGTCCCTCTTCTCTTATGGAGATCCCTCGACCTGCAGCCCAAGCTT實施例1-3 V209nGlm(l)同種異型的產生為獲得V209的同種異型nGlm(l)、其Glm(I)同種異型，形成了用于nGlm(l)同種異型的盒。具體地，利用SEQ ID NO :14和NO :15所示的正向引物HerSmaF和反向引物HerNotR,并且利用SEQ ID NO 10所示的并且在實施例1_2中產生的抗-GPC3抗體H-鏈基因作為模板，在下述條件下進行PCR。
混合X 10K0D緩沖液5 μ I、dNTPs和MgCl2分別5 μ I和2 μ I (附帶于KOD聚合酶中，Toyobo)。加入上述引物組合(2(^11101/1，各1レ1)、6 03抗體!1-鏈基因I μ l、dH2034. 5 μ I和5單位/ μ I KOD聚合酶O. 5 μ 1，以獲得50 μ I的總量。在下述條件下進行PCR。960C I 分鐘；(98°C 15 秒；65°C 2 秒；74°C 30 秒)X 35 循環；74°C 30 秒；4°C。將獲得的片段亞克隆入pBluescriptSK+(pBher)中，確認其序列。接下來，從實施例1-2描述的pC-aGPChl (209)中切下大約290bp的SmaI-NotI片段。另ー方面，以同樣的方式從PBher中切下SmaI-NotI片段，將大約290bp的片段導入到pC-aGPChl (209)的相應位點中進行替換，以獲得nGlm (I)同種異型表達載體(pC-aGPChl (209Her))。正向引物HerSmaF(SEQ ID NO :14)gggaggagatgaccaagaaccaggtcaccctgacctgcc 反向引物HerNotR(SEQ ID NO :15)tttgcggccgcttatcatttacccggagacagggagaggctc實施例2 =Fc-修飾的抗-GPC3抗體的制備實施例2-1 =Fc-修飾的抗-GPC3抗體在CHO細胞中的表達用PvuI酶切十微升的Fe-修飾的抗-GPC3抗體表達載體pC_aGPChl (22)、pC-aGPChl (209)、pC-aGPChl (212)、pC-aGPChl(922)、pC-aGPChl (1608)或pC-aGPChl (209Her)以產生線性DNA。將其通過電穿孔法在I. 5kV和25 μ F的條件下導入到2 X106/0. 6ml PBS (-)的CHO細胞(DXB11S株)中。細胞在37°C、8% CO2的培養箱中培養。在包含400 μ g/ml遺傳霉素的CH0-S-SFMII培養基(Invitrogen)中篩選細胞。選擇的細胞以O. 4細胞/100 μ I/孔的密度接種到96孔板中包含400 μ g/ml遺傳霉素的CH0-S-SFMII培養基中，通過限制稀釋法克隆細胞。用BIAC0RE 3000分析培養上清液。抗原利用其上固定有融合蛋白GST-GPC3(SEQ ID NO :16所示的抗原GST和人磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3)的芯片定量，選擇高表達的細胞。GPC3 肽的氨基酸序列(SEQ ID NO: 16)AELAYDLDVDDAPGNSQQATPKDNEISTFHNLGNVHSPLK實施例2-2 =Fc-修飾的抗-GPC3抗體的純化將表達Fe-修飾的人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗體的CHO細胞的培養上清液加樣到用包含150mM NaCl的IOmM檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(PH7. 5)平衡的rProtein ASepharose Fast Flow柱上。該柱用相同的緩沖液、用包含IM NaCl的IOmM朽1檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(PH7. 5)、然后用IOmM的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(PH7. 5)洗滌，吸附到柱子上的蛋白質用20mM的こ酸洗脫。向包含Fe-修飾的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗體的20mMこ酸級分中加入IMtris-HCl緩沖液(pH 8. 5)以將pH從5調節到6，并且通過0. 22 μ m的濾器過濾。向過濾的級分中加入相當量的MilliQ水，加樣到用20mMこ酸緩沖液(PH6. 0)平衡的SP Sepharose Fast Flow柱上。該柱用相同的緩沖液洗滌，然后用包含20mM NaCl的20mMこ酸緩沖液(PH6. 0)洗脫吸附于柱子上的蛋白質，以獲得純化的Fe-修飾的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗體。圖2顯示了利用已知方法(Nature，227，680，1970，在此全文引入作為參考)進行的，純化的本發明Fe-修飾的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗體的SDS-PAGE (聚丙烯酰胺凝膠電泳)結果，以分析抗體的分子量和純度。每種純化的Fe-修飾的人源化杭-磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗體在非還原條件下顯示大約150KDa分子量的單一條帶，在還原條件下顯示大約50kDa和大約25kDa的兩條條帶。這些分子量與根據抗體H-鏈和L-鏈cDNAs的核苷酸序列預測的基本一致，并且進一歩與以下報道一致IgG型抗體在非還原條件下具有大約150kDa的分子量，在還原條件下H-鏈具有大約50kDa的分子量，L-鏈具有大約25kDa分子量,其中其分子內ニ硫鍵被切開(Antibodies, Chapter 14, Monoclonal Antibodies,在此全文引入作為參考)。已經證實，每種Fe-修飾的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗體表達為具有正確結構的抗體分子，并且同樣地純化。圖3 顯不了通過凝膠滲透柱(Superdex 200PC3. 2/30,GE Amersham Biosciences)分析，純化的Fe-修飾的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體的色譜圖。實施例3 =Fc-修飾的抗-GPC3抗體的ADCC活性的測定實施例3-1 :人磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3 (GPC3)的cDNA克隆
以按照通常方法從結腸癌細胞系Caco2中制備的第一鏈cDNA作為模板，利用Advantage〗試劑盒(CL0NETECH)通過PCR擴增了編碼人GPC3的全長cDNA。具體地，50 μ I包含2 μ I Caco2衍生的cDNA的反應溶液，I μ I的正義引物(GATATC-ATGGCCGGGACCGTGCGCACCGCGT, SEQ ID NO : 17)，I μ I 反義引物(GCTAGC-TCAGTGCACCAGGAAGAAGAAGCAC，SEQ IDNO : 18)，5 μ I 的 Advantage〗10 X PCR 緩沖液，8 μ I 的 dNTX 混合物(I. 25mM)和 I. O μ I 的Advantage聚合酶混合物，進行94°C I分鐘；63°C 30秒；68°C 3分鐘的35個循環。利用pGEM-T Easy載體系統I (Promega)將PCR擴增產物插入到TA載體pGEM_Teasy中。產物的序列利用ABI3100 DNA測序儀進行確認。以這種方式，分離編碼全長人GPC3的cDNA。人GPC3基因的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO : 19中，人GPC3蛋白的氨基酸序列顯示于SEQ IDNO 20 中。實施例3-2 :表達全長GPC3的人肝癌細胞系(SK-03)的制備為了獲得評價抗-GPC3抗體的生物學活性的細胞系，建立了一種能夠表達全長GPC3的人肝癌細胞系。用PvuI處理的Iyg全長人GPC3基因表達載體與2 μ I FuGENE (Roche)混合，形成一種復合物，然后將其加入到SK-HEP-I細胞(購自ATCC)中進行基因導入。細胞在CO2培養箱中培養24小時，然后，利用含有終濃度lmg/ml的遺傳霉素(Invitrogen)和10% FBS的Dulbecco MEM(D-MEMjSIGMA)選擇GPC3-表達細胞。收集獲得的遺傳霉素抗性菌落，按照有限稀釋法克隆細胞。通過利用嵌合GC33抗體和FITC-標記的山羊杭-人IgG抗體(ICN)的流式細胞術確定每個細胞克隆中人GPC3的表達，以獲得穩定表達細胞系SK-03。實施例3-3 :用來源于人外周血的PBMC測定ADCC活性實施例3-3-1 :人PBMC溶液的制備從一名健康人中采集添加了肝素的外周血，用PBS(-)稀釋2倍，并且覆蓋于Ficol 1-Paque PLUS (Amersham)之上。離心(500 X g，30 分鐘，20°C )之后，收集單核細胞部分的間層。將單核細胞洗滌三次，并且在10% FBS/RPMI中懸浮，以制備人PBMC溶液。實施例3-3-2 :靶細胞的制備SK-03細胞保存在含有lmg/ml遺傳霉素和10 % FBS (ThermoTrace)的D-MEM培養基(SIGMA)中。利用細胞分離緩沖液(InvitiOgen)使細胞從培養皿上脫落，并且以IXlO4細胞/孔轉移到96孔U形底板(Falcon)的每個孔中，培養I天。培養之后，加入5. 55MBq鉻-51，細胞在37°C、5% CO2培養箱中進ー步培養4小吋。細胞用培養液洗滌一次，懸浮于50μ I的10% FBS/RPMI1640培養基中，以制備靶細胞。實施例3-3-3 :鉻釋放實驗(ADCC活性)將50 μ I制備為預定濃度的抗體溶液倍加入到靶細胞中，并且在室溫下反應15分鐘。接下來，加入100μ I人PBMC溶液(5Χ105細胞/孔)，并且離心，然后在37°C、5% CO2培養箱中培養4小吋。培養之后，離心培養板，用Y計數器計數100 μ I培養上清液的放射性。樣品的比鉻釋放率根據下式獲得比鉻釋放率(％ ) = (A-C) X 10(V(B-C)，其中A表示每孔中放射性(cpm)的平均值；B表示每孔中放射性(cpm)平均值，其中100 μ 12% ΝΡ-40水溶液(Nonidet Ρ_40，編號252-23，Nacalai Tesque)和50 μ I的10% FBS/RPMI培養液加入到靶細胞中；C表示每孔中的放射性(cpm)平均值，其中150 μ I的10% FBS/RPMI培養液加入到靶細胞中。
實驗重復進行三次，計算樣品的ADCC活性)平均值。結果顯示于圖4中。Fe-修飾的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗體V22、V209、V922、V1608和V209(nGlm(l))相對于野生型抗體(WT)都具有增強的ADCC活性。其中，V22的活性比其他的低，但是在V209、V922、V1608和V209(nGlm(l))之間只發現很小的活性差別。實施例3-4 :利用來源于小鼠骨髓的效應細胞測定ADCC活性實施例3-4-1 :來源于小鼠骨髓的效應細胞懸浮液的制備從SCID小鼠(來自Nippon Clea，雄性，10周齡)的股骨中收集骨髓細胞，以5X IO5細胞/ml的密度懸浮于10% FBS/RPMI1640培養液中。小鼠GM-CSF(P印ro Tech)和人IL-2 (Pepro Tech)分別以終濃度10ng/ml和50ng/ml加入。細胞在37°C>5% CO2培養箱器中培養5天。培養之后，用刮刀使細胞脫落，用培養液洗滌一次，以5X IO6細胞/ml的密度懸浮于10% FBS/RPMI1640培養液中，以制備來源于小鼠骨髓的效應細胞懸浮液。實施例3-4-2 :靶細胞的制備人肝癌細胞!fepG2(購自 ATCC)保持在含有 10 % FBS (Thermo Trace)的 RPMI1640培養液(SIGMA)中。利用細胞分離緩沖液(InvitiOgen)使細胞從培養皿上脫落，并以
IX IO4細胞/孔的密度轉移到96孔U形底培養板(Falcon)的每個孔中，培養I天。培養之后，加入5. 55MBq的鉻_51，細胞在37°C、5% CO2培養箱中繼續培養4小時。細胞用培養液洗滌一次，并且懸浮于50μ I的10% FBS/RPMI1640培養液中，以制備靶細胞。實施例3-4-3 :鉻釋放實驗(ADCC活性)向靶細胞中加入50 μ I的制備為預定濃度的抗體溶液，在室溫下反應15分鐘。接下來，加入100 μ I來源于小鼠骨髓的效應細胞懸浮液(5Χ105細胞/孔)，離心，然后在37°C、5% CO2培養箱中培養4小時。培養之后，離心培養板，利用Y計數器計數100μ1的培養上清液的放射性。根據下式獲得樣品的比鉻釋放率比鉻釋放率(％ ) = (A-C) X 10(V(B-C)，其中A表示每孔中放射性(cpm)的平均值；B表示每孔中放射性(cpm)平均值，其中100 μ 12% ΝΡ-40水溶液(Nonidet P_40，編號252-23，Nacalai Tesque)和50 μ I的10% FBS/RPMI培養液加入到靶細胞；C表示每孔中的放射性(cpm)平均值，其中150 μ I的10% FBS/RPMI培養液加入到靶細胞。實驗重復進行三次，計算樣品的ADCC活性)平均值。
結果顯示于圖5中。Fe-修飾的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗體V22、V209和V1608相對于野生型抗體(WT)都具有增強的ADCC活性。エ業實用件Fe-修飾的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體在治療癌癥例如肝癌中是有用的。·
權利要求
1.一種抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體，其中Fe區的位點239、298、326、330和332處的一個或多個氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代。
2.一種抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體，其選自 (a)Fe區的位點332的氨基酸殘基被另一氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體； (b)Fc區的位點239、330和332處的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體； (c)Fc區的位點239、298和332處的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體； (d)Fc區的位點239、326和332處的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體； (e)Fc區的位點239、298、326和332處的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體。
3.一種抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體，其選自 (a)在Fe區的位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體； (b)在Fe區的位點239處具有天冬氨酸，在位點330處具有亮氨酸，在位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體； (c)在Fe區的位點239處具有天冬氨酸，在位點298處具有丙氨酸，在位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體； (d)在Fe區的位點239處具有天冬氨酸，在位點326處具有蘇氨酸，在位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體； (e)在Fe區的位點239處具有天冬氨酸，在位點298處具有丙氨酸，在位點326處具有谷氨酸，在位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體。
4.一種抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體，其選自 (a)Fe區的位點332處的氨基酸殘基被谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體； (b)Fc區的位點239、330和332處的氨基酸殘基分別被天冬氨酸、亮氨酸、谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體； (C)Fc區的位點239、298和332處的氨基酸殘基分別被天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體； (d)Fc區的位點239、326和332處的氨基酸殘基分別被天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體； (e)Fc區的位點239、298、326和332處的氨基酸殘基分別被天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體。
5.一種抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體，其選自 (a)具有包含SEQID NO:34所示氨基酸序列的CH2-CH3結構域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體； (b)具有包含SEQID NO 35所示氨基酸序列的CH2-CH3結構域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體；(C)具有包含SEQ ID NO :36所示氨基酸序列的CH2-CH3結構域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體； (d)具有包含SEQID NO 37所示氨基酸序列的CH2-CH3結構域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體； (e)具有包含SEQID NO 38所示氨基酸序列的CH2-CH3結構域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體。
6.權利要求1-5任一項的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體，其中所述抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體包含具有如SEQ ID NO: 23所示的CDRljBSEQ ID NO :24所示的CDR2和如SEQ ID NO :25所示的CDR3的H鏈，和具有如SEQ ID NO : 26所示的CDRl、如SEQ ID NO:27所示的CDR2和如SEQ ID NO 28所示的CDR3的L鏈。
7.糖-3上的同-表位，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3結合包含具有如SEQ ID N0:23所示的CDRU SEQ ID NO 24所示的CDR2和如SEQ ID NO 25所示的CDR3的H鏈和具有如SEQID NO 26 所示的 CDRUn SEQ ID NO 27 所示的 CDR2 和如 SEQ ID NO 28 所示的 CDR3 的 L鏈且其中Fe區的位點239、298、326、330和332處的一個或多個氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的抗體。
8.一種包含如權利要求1-7任一項所述的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體和藥學上可接受的載體的抗癌劑。
9.一種治療癌癥患者的方法，包括給患者施用如權利要求8所述的抗癌劑。
10.一種制備具有增強的細胞毒性的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體的方法，包括 (i)培養一種工程化宿主細胞，該宿主細胞表達編碼抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體的多核苷酸，其中所述抗體的Fe區的位點239、298、326、330和332處的一個或多個氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代；和( )從培養物中分離所述抗體。
11.一種制備具有增強的細胞毒性的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體的方法，包括 (i)培養一種工程化宿主細胞，該宿主細胞表達編碼抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體的多核苷酸，其中所述抗體選自 (a)Fe區的位點332處的氨基酸殘基被另一氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體； (b)Fc區的位點239、330和332處的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體； (c)Fc區的位點239、298和332處的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體； (d)Fc區的位點239、326和332處的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體； (e)Fc區的位點239、298、326和332處的氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體；和 ( )從培養物中分離所述抗體。
12.—種制備具有增強的細胞毒性的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體的方法，包括(i)培養一種工程化宿主細胞，該宿主細胞表達編碼抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體的多核苷酸，其中所述抗體選自 (a)在Fe區的位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3抗體； (b)在Fe區的位點239處具有天冬氨酸，在位點330處具有亮氨酸，在位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體； (c)在Fe區的位點239處具有天冬氨酸，在位點298處具有丙氨酸，在位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體； (d)在Fe區的位點239處具有天冬氨酸，在位點326處具有蘇氨酸，在位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體； (e)在Fe區的位點239處具有天冬氨酸，在位點298處具有丙氨酸，在位點326處具有谷氨酸，在位點332處具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體；和 ( )從培養物中分離所述抗體。
全文摘要
公開了一種包含在Fc區導入的一個或多個氨基酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體。優選地，在該抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體中，Fc區的位點239、298、326、330和332處的一個或多個氨基酸殘基被其他氨基酸殘基取代。由于本發明的Fc-修飾的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體顯示出增強的ADCC活性，其在治療癌癥例如肝癌中是有用的。還公開了一種包含本發明的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體和藥學上可接受的載體的抗癌劑，以及一種治療癌癥患者的方法，包括給患者施用本發明的抗癌劑。
文檔編號C07K16/18GK102850455SQ20121017800
公開日2013年1月2日 申請日期2006年10月11日 優先權日2005年10月14日
發明者G·A·拉扎爾, B·I·達希雅特, 岡部尚文, 杉本正道, 飯島成幸, 周鄉泉 申請人:中外制藥株式會社, 贊科股份有限公司