專利名稱：大豆生育期e1-b3a基因及其編碼蛋白的制作方法
技術領域：
本發明涉及大豆生育期el_b3a基因及其編碼蛋白。
背景技術：
El基因位于著絲點附近，自Bernard (1971)年報道以來，人們一直沒有克隆出其功能基因。由于該基因位于近著絲點(pericentromeric region),遺傳重組率較低，不利于采用圖位克隆法克隆出該基因，在發明專利名稱ー種大豆生育期El基因及其編碼蛋白，專利申請號為201210112662.9中，公布出El基因序列及其相應的蛋白序列后，證明大豆生育期El基因具有強烈抑制大豆開花的生理功能。其蛋白質序列雖然并不能鑒定出B3結構域，但是與B3結構域基因具有遠緣的關系。B3結構域基因是ー類較為保守的植物特有的 轉錄因子，一般只有100-120氨基酸，常與其他結構域共同起作用。B3結構域中含有與DNA相結合的特殊位點，一般與DNA分子的大溝起作用。在含有B3結構域的蛋白質對抗逆性反應、植物的生長與發育等諸多方面起重要作用。同吋，El基因具有ー個核定位信號，其特征為親核蛋白一般都含有的能保證整個蛋白質能夠通過核孔復合體被運到細胞核內的特殊的短肽氨基酸序列。在大豆栽培品種中，其El基因的突變如何影響著大豆生育期(開花期及成熟期)是ー個非常重要的科學問題，目前還沒有在分子水平上的相關研究報道。
發明內容
本發明的目的是提供了大豆生育期el_b3a基因及其編碼蛋白。本發明的大 生育期el-b3a基因的基因序列如序列表Seq ID No:l所不。本發明的大豆生育期el_b3a基因的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No 2所示。本發明的大豆生育期el_b3a基因是大豆生育期El基因(發明專利申請號201210112662. 9)的突變型基因。本發明的有益效果本發明是在克隆出大豆生育期El基因(發明專利申請號201210112662.9)的基礎上，進ー步對El基因序列進行深入系統的研究。由于在大豆中具有典型的B3基因結構域基因，本基因是代表ー類新型的基因家族，我們已證實El基因可以代表著El位點的功能，即具有抑制大豆開花的功能。本發明對不同品種及近等基因系中El基因序列進行了研究，并確定了 el-b3a基因，其對大豆生開花具有促進作用。大豆生育期El基因在氨基酸序列55 174區域存在著ー個與B3結構域遠緣相似的區域，大豆生育期el_b3a基因的核苷酸序列在33Γ336處發生3個堿基突變及在337 338處有2個堿基缺失，在蛋白質的C未端發生移碼，在氨基酸序列中fill處與大豆生育期基因El相同，112^147處為錯位氨基酸序列，因移碼(frameshift)而形成了終止子(見Seq ID No :2)，而且在148位產生了終止密碼子，因而本發明的大豆生育期el_b3a基因在氨基酸65位從蘇氨酸改變為異亮氨酸，改變了大豆生育期El基因(發明專利申請號201210112662. 9)的B3結構域的完整性，從而使大豆開花提前，說明El基因中類似于B3的結構域的改變，引發了大豆El基因功能的改變。具有該基因的品種煙黃3號表現為早花特性。
圖I為el_b3a電泳圖，其中，I號為中黃13,2號為合豐55,3號為Jack,4號為煙黃3號,5號為墾豐18,6號為合豐50 ；圖2具el_b3a基因的大豆品種煙黃3號在長日照16小時光照/8小時黑暗條件下，出苗后45天照片，其中，箭頭所指的是已開放的大豆花朵；圖3具大豆生育期El基因的大豆品種Harosoy-El在長日照16小時光照/8小時 黑暗條件下，出苗后45天的照片。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式的大豆生育期el_b3a基因的突變基因序列如序列表 Seq IDNo 1 所示。本實施方式是在克隆出大豆生育期El基因(發明專利申請號201210112662.9)的基礎上，進一步對El基因序列進行深入系統的研究。由于在大 中具有典型的Β3基因結構域基因，本基因是代表ー類新型的基因家族，我們已證實EI基因可以代表著EI位點的功能，即具有抑制大豆開花的功能。本實施方式對不同品種及近等基因系中El基因序列進行了研究，并確定了 el-b3a基因，其對大豆生開花具有促進作用。大豆生育期El基因在氨基酸序列55 174區域存在著ー個與B3結構域遠緣相似的區域，大豆生育期el_b3a基因的核苷酸序列在33Γ336處發生3個堿基突變及在337 338處有2個堿基缺失，在蛋白質的C未端發生移碼，在氨基酸序列中fill處與大豆生育期基因El相同，112^147處為錯位氨基酸序列，因移碼(frameshift)而形成了終止子(見Seq ID No :2)，而且在148位產生了終止密碼子，因而本實施方式的大豆生育期el_b3a基因的氨基酸65位從蘇氨酸改變為異亮氨酸，改變了大豆生育期El基因(發明專利申請號201210112662.9)的B3結構域的完整性，從而使大豆開花提前，說明El基因中類似于B3的結構域的改變，引發了大豆El基因功能的改變。具有該基因的品種煙黃3號表現為早花特性。
具體實施方式
ニ 本實施方式的大豆生育期el_b3a基因的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No 2所示。本實施方式是在克隆出大豆生育期El基因(發明專利申請號201210112662.9)的基礎上，進一步對El基因序列進行深入系統的研究。由于在大 中具有典型的Β3基因結構域基因，本基因是代表ー類新型的基因家族，我們已證實EI基因可以代表著EI位點的功能，即具有抑制大豆開花的功能。本實施方式對不同品種及近等基因系中El基因序列進行了研究，并確定了 el-b3a基因，其對大豆生開花具有促進作用。大豆生育期El基因在氨基酸序列55 174區域存在著ー個與B3結構域遠緣相似的區域，大豆生育期el_b3a基因的核苷酸序列在33Γ336處發生3個堿基突變及在337 338處有2個堿基缺失，在蛋白質的C未端發生移碼，在氨基酸序列中fill處與大豆生育期基因El相同，112^147處為錯位氨基酸序列，因移碼(frameshift)而形成了終止子(見Seq ID No :2)，而且在148位產生了終止密碼子，因而本實施方式的大豆生育期el_b3a基因的氨基酸65位從蘇氨酸改變為異亮氨酸，改變了大豆生育期El基因(發明專利申請號201210112662.9)的B3結構域的完整性，從而使大豆開花提前，說明El基因中類似于B3的結構域的改變，引發了大豆El基因功能的改變。具有該基因的品種煙黃3號表現為早花特性。通過以下試驗驗證本發明的效果(I)本發明的el_b3a基因是通過如下方法得到的取長至三葉真葉期煙黃3號大豆品種的葉片，采用CTAB法提取葉片基因組DNA ；以提取的DNA為模板通過Kl與K2引物，采用購買自Takara公司的高保真酶primerSTARHS擴增el-b3a基因，PCR反應條件如下94°C預變性10min，94°C變性30s，60°C退火15s，72°C延伸lmin，共30循環，再72°C延伸7min，將PCR產物在ABI3130測序儀(ABI公司)上進行測序。 測序結果表明大豆生育期el_b3a基因具有序列表中Seq ID No :1的核苷酸序列，序列表中的Seq ID No 1由522個堿基組成，并編碼具有序列表中Seq ID No 2的氨基酸序列的蛋白質。(2)大豆El基因中el_b3a基因鑒定一、取長至三葉真葉期待測品種的葉片，采用CTAB法提取葉片基因組DNA ;ニ、以步驟ー提取的基因組DNA為模板，Fl和F2為引物，采用購買自Takara公司的rTaq酶進行擴增，PCR反應條件如下95°C預變性3min ;95°C變性20s，58°C退火30s，72°C延伸40s，共32個循環，再72°C延伸7min ;三、取經步驟ニ PCR后的8 μ I (其濃度約為300ng/μ I)，稀釋I倍后，經BfuI限制性內切酶(購買自Takara公司)，在37° C溫度下，消化3h ;四、然后將步驟三酶切后的產物，采用13%非變性PAGE膠電泳進行檢測；其中，步驟一所述的待測品種中黃13，合豐55，Jack，煙黃3號，墾豐18和合豐50。電泳檢測結果如圖I所示，由圖I可知，4號煙黃3號品種出現2條條帶(如BC所示)，即為el-b3a基因型，而1、2、3、5和6號只有一條條帶(如A所示)，即沒有并不能被BfuI消化，則為El的其它基因型。(3) el_b3a基因的功能驗證一、大豆品種帶有el_b3a基因的表型分析為進ー步驗證el_b3a基因型的功能，將含有el_b3a基因的煙黃3號與含有大豆生育期El基因(發明專利申請號201210112662.9)的Harosoy-El品種，種植在人工培養箱中(人工控制日照長度長日照為16小時光照/8小時黑暗，中等長照為13. 5小時/9. 5小時，短日照條件為12小時光照/12小時黑暗)，光源為熒光燈與白熾燈，其光強為235^270 μ mo I · s^1 ·πΓ2，同時，在自然光照的田間種植，觀察含有el_b3a基因煙黃3號品種與含有大豆生育期El基因(發明專利申請號201210112662. 9)的Harosoy-El品種從出苗到開花的天數。結果如表I所示，從表I中可以看出，大豆為短日照作物，在短日照(12小時光照/12小時黑暗)條件下，含有大豆生育期El基因的Harosoy-El品種與含有el_b3a基因的煙黃3號種開花天數(從播種到開花)相當，大約30天左右；而在長日照條件(16小時光照/8小時黑暗)下，含有大豆生育期El基因的Harosoy-El品種的開花天數超過70天，而含有el-b3a基因的煙黃3號品種為43天左右，在中等日照條件下，含有el_b3a基因的煙黃3號品種在45天時已經開花(圖2)，而含有大豆生育期El基因的Harosoy-El品種則處于營養生長狀況(圖3)。el_b3a基因是在我國自己培育的大豆品種煙黃3號中發現的，說明el_b3a基因代表著一個極其重要的一類變異，對于全面了解El基因的機理起決定作用。表I品種帶有el_b3a基因與帶有El基因型的比較
權利要求
1.大豆生育期el-b3a基因，其特征在于大豆生育期el-b3a基因的基因序列如序列表SeqID No 1 所示。
2.如權利要求I所述的大豆生育期el_b3a基因的編碼蛋白，其特征在于大豆生育期el-b3a基因編碼蛋白的氣基酸序列如序列表Seq ID No:2所不。
全文摘要
大豆生育期e1-b3a基因及其編碼蛋白，它涉及大豆生育期e1-b3a基因及其編碼蛋白。本發明提供了大豆生育期e1-b3a基因及其編碼蛋白。本發明的大豆生育期e1-b3a基因的基因序列如序列表Seq ID No1所示。本發明的大豆生育期e1-b3a基因的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No2所示。本發明通過品種的相關的遺傳及分子功能驗證，e1-b3a基因與E1基因相比，具有促進開花的功能。
文檔編號C07K14/415GK102690831SQ20121016217
公開日2012年9月26日 申請日期2012年5月23日 優先權日2012年5月23日
發明者劉寶輝, 呂世翔, 吳紅艷, 夏正俊, 翟紅, 邱麗娟 申請人:中國科學院東北地理與農業生態研究所