一個微泡膜蛋白及其應用的制作方法

專利名稱：一個微泡膜蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一個新發現的磷酸化CSElL細胞微泡膜蛋白及其應用。
背景技術：
細胞微泡(microvesicles)是由細胞膜衍生釋放到細胞外環境中的小粒子,其大小約直徑O. Iym至100 μπι。微泡參與蛋白酶、基因、小分子核糖核酸(RNA)、激素受體、細胞胞器等，在細胞與細胞之間的轉移，因而與多種疾病，包括癌癥的惡化有關(Simak 2006； Cocucci 2009 ；Muralidharan-Chari2010)。腫瘤細胞的侵襲和轉移為癌癥患者死亡的主要因素。腫瘤細胞藉由分泌蛋白酶，分解細胞外基質而進行癌侵襲和癌轉移。由腫瘤細胞釋放的微泡，富含可分解細胞外基質的蛋白酶，從而在癌細胞的侵襲和轉移上，起到重要作用(Cocucci 2009)。CSElL 蛋白(染色體分離-I 類蛋白，chromosome segregation 1-likeprotein)或稱細胞凋亡易感蛋白(CAS, cellular apoptosis susceptibility protein)(GenBank登錄號U33286),高度表現于多種癌癥的組織檢體(Brinkmannl995 ；Tung 2009 ；Tai 2010) o CSElL之前被Scherf等人發現可被細胞外信號調節激酶(extracellularsignal-regulated kinase, E RK)憐酸化，因此是一個酪氨酸憐酸化蛋白(tyrosinephosphorylated protein),且Scherf等人發現酪氨酸磷酸化的CSElL蛋白其功能在于促使細胞蛋白由細胞質往細胞核運輸(Scherf 1998)。目前所查資料表明，和CSElL蛋白相關的專利包括US6，664，057是關于鑒別一種與癌癥有關之人類染色體20ql3. 2上之新穎擴增子(amplicon)(此擴增子含CSElL基因)。US 6，072，031是關于CSElL之互補脫氧核糖核酸(complementary DNA, cDNA)及胺基酸序列，用于偵測正常細胞及癌細胞中CSElL基因之表現及擴增，此外將反義CSElL基因序列引入活細胞中可抑制細胞凋亡。US 6，207，380是關于衍生自角蛋白/細胞角蛋白、CSElL或mat-8的多肽及多核苷酸于人體泌尿道組織之表現，用于偵測、診斷、監測、活體內造影、預防或治療個體罹患泌尿系統疾病(如泌尿系統癌)。US 6，207，380亦揭示特異結合至泌尿道組織角蛋白/細胞角蛋白、CSElL或mat-8編碼之多肽或蛋白質之抗體，該分子有助于治療泌尿道疾病。故US6，207, 380描述利用特異結合至泌尿道組織之角蛋白/細胞角蛋白、CSElL或mat-8之抗體以治療泌尿道疾病。US 6，232，086揭示CSElL之互補脫氧核糖核酸及胺基酸序列，用于偵測正常細胞及癌細胞中CSElL基因之表現及擴增。US 6，156，564是關于偵測人類增生性細胞之方法，其包含測量人體組織檢體中CSElL蛋白質之表現量，以及偵測該人類蛋白質表現量較正常非增生性人類細胞之CSElL蛋白質表現量高至少兩倍以上。US 6，440，737是關于調控CSElL基因表現之反義化合物、組合物及方法。US20080081339是關于測量幾十個體液抗體，包括體液中CSElL “自體抗體“(非CSElL蛋白)作為前列腺癌的診斷標志物。US20050260639是關于檢測從體液或身體組織分離出之“癌細胞”內的CSE1L，以診斷胰腺癌。W02009/052573是關于檢測從體液或身體組織分離出之“癌細胞”內的幾百個轉錄核糖核酸包括CSElL的核糖核酸，以診斷胃腸癌。US20100120074是關于測量體液中的CSElL蛋白以診斷轉移性癌癥。由上述之說明可知這些先前技藝(專利)的內容，都在偵測細胞層級之CSElL基因表現或體液CSElL蛋白。

發明內容
本發明的一方面涉及于體外分離、結合或檢測微泡的方法，用以診斷或治療疾病。在本發明的一方面涉及診斷腫瘤的方法，包含以下步驟1)取得哺乳動物之體液；2)于體外檢測受檢測個體體液中微泡的CSElL或磷酸化CSElL量；2)于體外檢測正常個體體液中微泡的CSElL或磷酸化CSElL量做為對照組；3)依據受檢測個體與對照組個體 體液中微泡的CSElL或磷酸化CSElL量的差別，判別受檢測個體是否有腫瘤。在本發明的一方面涉及診斷腫瘤的方法，包含以下步驟1)取得哺乳動物之體液；2)于體外檢測受檢測個體體液中磷酸化CSElL量；2)于體外檢測正常個體體液中磷酸化CSElL量做為對照組；3)依據受檢測個體與對照組個體體液中磷酸化CSElL量的差別，判別受檢測個體是否有腫瘤。在本發明的一方面涉及由體液分離微泡的方法，包含以下步驟1)取得哺乳動物之體液；2)于體外以可和CSElL或磷酸化CSElL結合的抗體，分離與抗體結合之微泡。在本發明的一方面涉及檢測體液中微泡的方法，包含以下步驟1)取得哺乳動物之體液；2)于體外以抗CSElL抗體或抗磷酸化CSElL抗體，檢測與抗體結合之微泡。在本發明的一方面也涉及以可和CSElL或磷酸化CSElL結合的抗體與細胞微泡結合，用于預防或治療疾病的方法。優先考慮的疾病是癌癥。在本發明的一方面也涉及以含有抗CSElL抗體或抗磷酸化CSElL抗體的組合物與細胞微泡結合，以用于診斷或治療疾病。優先考慮的疾病是癌癥。本發明的其它用途，特點，及優點可以從下面的詳細描述和數據圖標中顯示。


圖I為本發明實施例I的圖，以免疫墨點法(immunoblotting),分析B16-dEV,B16-ras, B16-CSE1L，和 B16_Ras/anti_CSElL 細胞的 Ras 和 CSElL 蛋白的表達量。圖2為本發明實施例2的圖，顯示v-H-ras癌基因轉染誘導癌細胞微泡生成。圖3為本發明實施例3的圖，顯示v-H-ras癌基因轉染增加癌細胞分泌CSE1L。圖4為本發明實施例4的圖，顯示CSElL是一個磷酸化的蛋白。圖5為本發明實施例5的圖，顯示v-H-ras癌基因轉染增加癌細胞內CSElL蛋白之磷酸化，以及磷酸化CSElL蛋白存在于癌血清中。圖6為本發明實施例6的圖，顯示磷酸化ERK與CSElL高表達于大腸直腸癌腫瘤，且相對表染色強度一致。圖7為本發明實施例7的圖，顯示CSElL介導v-H-ras癌基因所誘導的癌細胞微泡生成。
圖8為本發明實施例8的圖，顯示CSElL介導v-H-ras癌基因所誘導的癌細胞侵襲。圖9為本發明實施例9的圖，顯示CSElL介導v-H-ras癌基因所誘導的癌細胞轉移。圖10為本發明實施例10的圖，顯示CSElL位于微泡膜，而且抗CSElL的抗體能夠尋找并結合腫瘤。圖11為本發明實施例11的圖，顯示抗磷酸化CSElL抗體針對磷酸化CSElL蛋白 的專一'I"生結合。圖12為本發明實施例12的圖，顯示磷酸化CSElL蛋白位于細胞微泡。圖13為本發明實施例13的圖，顯示相對于由健康獻血者血清中分離到的微泡，由癌癥患者血清中分離到的微泡有較高的CSElL和磷酸化CSElL盛行率。圖14為本發明實施例14的圖，顯示相對于健康獻血者血清的磷酸化CSE1L，癌癥患者血清有較高的磷酸化CSElL盛行率。
具體實施例方式細胞微泡為由細胞產生，分布于細胞膜，或從細胞釋放，可發現于體液和培養細胞的培養基(Simak 2006 ； Cocucci 2009 ； Mur a I i dhar an-Char i 2010)。本發明所述的微泡，包括及適用于與細胞膜結合的微泡，及從細胞釋放的微泡。本發明所述的微泡，也包括及適用于所有大小的細胞微泡。本發明首先發現CSElL調控細胞生成微泡、磷酸化CSElL位于微泡的膜上、磷酸化CSElL普遍存在于癌癥患者的血清中。微泡在多種疾病尤其癌癥惡化過程中起重要的作用(Simak 2006)。因此，可與CSElL或磷酸化CSElL結合的組合物，如抗CSElL抗體或抗磷酸化CSElL抗體與其衍生物、以及藥品的成分，可以用于檢測或結合體液微泡，進而診斷或控制疾病。微泡參與蛋白酶、基因、小分子核糖核酸、激素受體、細胞胞器等在細胞與細胞之間的轉移，因而與多種疾病，包括凝血疾病，傷口愈合，動脈粥樣硬化，冠狀動脈疾病，糖尿病，血液病，傳染病，炎癥性疾病，神經系統疾病，癌癥等的惡化有關(Simak 2006 ;Cocucci2009 ；Muralidharan-Chari 2010)。因此,微泡的蛋白分子,尤其是位于微泡膜上的蛋白分子，可以用來作為診斷疾病的標志物。另外，可以利用和微泡膜蛋白結合的抗體或組合物與微泡結合，應用于醫療成像或治療疾病。在本發明的另一的發現是，CSElL與Ras和ERK細胞信號通路連結，激活的Ras和ERK信號通路可磷酸化CSE1L，磷酸化CSElL普遍性地存在于癌癥患者血清中。另外，在癌癥的診斷上,檢測血清磷酸化CSElL的癌癥檢驗靈敏度，高于檢測血清非磷酸化CSElL的癌癥檢驗敏度。因此，磷酸化CSElL具有癌癥診斷的臨床應用性。本發明的另一發現是，癌癥患者的體液中有磷酸化CSElL存在，而且雖然正常(健康)人的體液也有CSElL存在，但是在正常人的體液中很難檢測到磷酸化CSElL(實施例5)。之前有研究指出，一個可被細胞分泌的蛋白若同時具有蛋白磷酸化形(phosphorylatedform)和去磷酸化形(dephosphorylated form),則并非此蛋白的磷酸化形和去磷酸化形都可被細胞分泌(Konishi 1994 ；Fendrick 1997)。因此，本發明的另一發現是磷酸化CSElL是一種分泌蛋白，且磷酸化CSElL可在癌癥患者的體液中被檢測到。
本發明的另一個發現是磷酸化CSElL為微泡的膜蛋白，且抗CSElL的抗體能夠尋找并結合腫瘤。經腫瘤細胞釋放的微泡仍然殘留在腫瘤周圍環境。因此，利用CSElL結合劑或磷酸化CSElL結合劑與治療藥物或細胞毒性劑結合，可應用于癌癥治療。此外，利用CSElL結合劑或磷酸化CSElL結合劑與可發出熒光、幅射或其它可被偵測訊息的物質結合，可應用于疾病醫療成像。本發明的另一個方面涉及利用可結合CSEIL或磷酸化CSEIL的組合物或抗體，應用于生物體液內微泡，包括細胞條件培養液(cell conditioned media)內微泡的分離和分析。所述包括可結合CSElL或磷酸化CSElL的化合物或抗體的方法或試劑套組盒，適用于(但不僅限于)，超速離心(ultracentrifugation),免疫親和純化(immunoprecipitation),親和純化(affinity purification), (microfiltration),流式細胞儀或突光激活細胞分選(fluorescence activated cell sorter),酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay),抗體芯片(microarray),生物芯片(biochips),色譜法(chromatography),免疫墨點法(immunoblotting),微流體系統(microfluidic systems),微流控芯片(microfluidic chip),及其它免疫學技術。·
本發明的另一個方面涉及以包含CSElL結合劑或磷酸化CSElL結合劑的方法或試劑盒，分離、分析或結合微泡，以診斷或監測疾病。CSElL或磷酸化CSElL的分析可以是定量(quantitative)或定性(qualitative)分析，并將分析結果與同時對一個或多個確定沒有疾病的生物體(做為對照組)的體液微泡內CSElL或磷酸化CSElL的分析結果進行比較。如果受檢測個體體液微泡內CSElL或磷酸化CSElL量與對照組進行比較結果有差異，可以指出腫瘤的狀況，例如有無腫瘤和腫瘤惡性程度的變化。由于體液中的微泡可能被溶解，因此微泡所載磷酸化CSElL可釋放到體液。本發明的另一個方面涉及以包含可以和磷酸化CSElL結合的結合劑(例如抗磷酸化CSElL的抗體)的方法或試劑盒，分離或分析體液內磷酸化CSE1L，以診斷或監測疾病。磷酸化CSElL的分析可以是定性性或定量性分析，并將分析結果與同時對一個或多個確定沒有疾病生物體(做為對照組)的體液內磷酸化CSElL的分析結果進行比較。如果受檢測個體體液磷酸化CSElL量與對照組進行比較結果有差異，可以指出腫瘤的狀況，例如有無腫瘤和腫瘤惡性程度的變化。本發明亦提供應用于上述偵測及診斷之套組。于診斷或偵測應用上，該套組可包含下述任何一者或所有檢測試劑、緩沖液、抗磷酸化CSElL抗體或可與磷酸化CSElL蛋白或磷酸化CSElL多肽結合且可顯示體液或體液微泡內磷酸化CSElL蛋白或磷酸化CSElL多肽含量之化學藥品、多肽及其它分子。本發明所述的“體液(biological fluid) ”指的是可由生物任何部位分離的流體樣品，包括但不限于血液，血清，血漿，尿液，淋巴液，腦脊液，痰液，胸腔液，乳頭吸出液，呼吸道液，腸道液，泌尿生殖道液，乳汁，淚液，唾液，淋巴液，精液，腦脊液，腹水，羊水，腫瘤囊液。也包括細胞條件培養液。在體液樣本的微泡也包括存在于體液樣本內之細胞細胞膜上的微泡。細胞條件培養液為已經培養細胞一段時間的培養液。“取得體液樣本”意指獲取用于本發明所描述方法之體液樣本。本發明所述的“腫瘤”是指個體具有引發癌癥之細胞存在。具有引發癌癥之細胞通常具有失控之增生、永生、轉移潛力、及某些特有的細胞型態及細胞標記之典型特征。在某些情況下，癌細胞呈腫瘤形式，但其亦可能于動物體中單獨存在或以獨立細胞形式(如白血病細胞)于血流中循環。本發明所述的“個體(subject) ”是指其細胞會產生微泡的動物。動物包括哺乳動物，尤其是人類。本發明所述的“正常個體(normal subject) ”是指個體沒有腫瘤或其它疾病。本發明所述的“受檢測個體(test subject) ”是指要被檢測有沒有腫瘤或其它疾病的個體。本發明所述的“于體外(in vitro) ”是指在一個活的個體之外的環境，通常是一種人工環境，如試管中或培養的環境。
·
本發明所述的“免疫學技術(immunological techniques) ”是指涉及任何以抗體為基礎的檢測技術，包括但不限于，斑點雜交，免疫墨點法，免疫沉淀，酶聯免疫吸附試驗(ELISA),和放射免疫分析(radioimmunoassay, RIA)技術。本發明所述的“斑點雜交(dot blot assay) ”是指將樣本固定在紙、玻璃纖維、或塑料板材的表面，可以用很多方法，包括以直接或間接標記抗體的雜交，檢測待檢測蛋白，待檢測蛋白的存在會形成明顯的檢測信號。本發明所述的“腫瘤祀向性(tumor targeting) ”是指化合物偏好或優先和腫瘤結合的能力。一個腫瘤靶向藥物成分是指藥物成分可偏好或優先結合到腫瘤組織。本發明所述的“癌癥治療(cancer therapy) ”是指可控制腫瘤生長，侵襲，轉移，或癌癥死亡率的技術、步驟、或物質。本發明所述的“醫療成像(medical imaging) ”是指臨床用途或醫療科學研究，使人體或動物組織器官產生圖像的技術。本發明所述的“治療藥劑(therapeutic agent) ”是指對癌細胞具有細胞毒性，生長抑制，或免疫抑制效果的藥劑或化合物。本發明所述的“抗體(antibody) ”是指(一)與相應抗原(如CSElL或磷酸化CSE1L)發生特異性結合反應的免疫球蛋白、免疫球蛋白多肽免疫活性部分(即免疫球蛋白的多肽，或片段及其包含抗原結合位點，可結合到一個特定的抗原(如CSElL或磷酸化CSEIL);或(二)任何免疫球蛋白的多肽或片段的衍生物等可結合到抗原(如CSElL或磷酸化 CSEIL)。本發明所述的抗體可以用已知的技術及方法生產。例如，單克隆抗體(monoclonalantibodies)、雜交瘤細胞(hybridoma)、重組抗體(recombinant antibodies)、卩遼菌體展不(phage display)等技術生產抗體。本發明所述的抗CSElL抗體，或抗磷酸化CSElL抗體與微泡間的結合反應，是以免疫原理技巧檢測。在典型的免疫檢測，可以將細胞、微泡或抗體固定于支持物(管柱、膜、或膠粒)上，分離掉未反應或未結合的物質后，可檢測這些抗體與微泡間的結合。固定細胞、微泡或抗體的方法為已知的技術。例如，它們可以經由化學聯結(chemical linking)反應或物理吸附(physical adsorption)方法直接固定到固相(solid phase)物質上。另外，本發明的抗體經過生物素聯結生物素化(biotinylated)后，也可將抗體間接地固定到吸附抗生素蛋白(avidin)或鏈霉抗生素蛋白(streptavidin)的固相物質上。當抗體聯結到磁性粒子，不僅抗體，包括微泡也可以快速且方便地被檢測和使用磁鐵分離。另外，當使用一種可識別多種抗原的抗體，例如多重特異性抗體(multispecific antibody),該抗體結合微泡上的CSElL或磷酸化CSE1L，然后也可以再結合其它抗原蛋白。另外，抗體也可以經過蛋白A(protein A)或G(protein G)或類似物固定到固相物質上。本發明所述的固定抗體的時間沒有特別限制，抗體可在與體液樣本混合接觸之前，之后，或同時間被固定。可以使用任何的固相物質固定抗體，此類固相物質包括以玻璃、有機聚合物、聚苯乙烯、娃膠(silica gel)、氧化招、活性炭等物質制成之纖維膜、粒子、纖維載體等。例如，本發明的抗體可以固定到試管、盤、碟子、或小珠子的反應容器的內壁。使用本發明所述抗體檢測或定量微泡，包括但不限于以下免疫學方法，例如，熒光抗體法，酶聯免疫吸附(ELISA),放射免疫分析(radioimmunoassay, RIA),免疫組織化學染色(見 Monoclonal Antibodies Principle and Pract ice, 3rd ed. (1996) AcademicPress)，免疫墨點法，及免疫沉淀。本發明所述的“平均量(average amount) ”之計算方法,為在一個或多個樣本,先確定CSElL或磷酸化CSElL在每個樣本內的值(水平)或濃度，然后計算CSElL或磷酸化CSElL在這些樣本的平均值或平均濃度。平均值可以由多個樣本的單獨值經過總加而成為總加值，再除以值的個數決定平均值。“微泡的CSElL的平均量”是指在一個或多個對照體液樣本內，CSElL蛋白在微泡的平均量。“微泡的磷酸化CSElL的平均量”是指在一個或多個對照體液樣本內，磷酸化CSElL蛋白在微泡的平均量。“體液樣本中的磷酸化CSElL的平均量”是指在一個或多個對照體液樣本內，磷酸化CSElL蛋白的平均量。受檢測體液樣本內微泡的CSElL或磷酸化CSElL的量，或受檢測體液樣本內磷酸化CSElL的量，高于對照組體液樣本中的CSElL或磷酸化CSElL的平均量，是指和對照組體液樣本比較下，受檢測體液樣本CSElL或磷酸化CSElL量的增加。“量的增加”通常是至少10%，或至少有20%或50%，或100%，或至少2倍，或至少是5倍，或者可高達10倍甚至20倍的增加。本發明所述的“臨界值(cut-off value)”或“陽性判定值”是指一個閾值，用以區分及判斷受檢測個體是否患有疾病或其疾病之情況。臨界值是一個由統計得出的適當數值，使用于疾病診斷上，其中測試值的平均(mean)和標準差(standard deviation, SD)從同一類患者測試及計算獲得。當病人的測試值小于這個臨界值時，病人被視為陰性(例如無腫瘤)，當病人的測試值大于或等于臨界值，病人被視為陽性(例如有腫瘤)。本發明所述的“藥物組合(pharmaceutical composition) ”是指一種或多種藥物及一種或多種輔藥、藥物賦形劑的組合。本發明所述的“藥物的賦形劑、稀釋劑或載體(pharmaceutical excipient,diluent or carrier) ”包括任何經政府監管機構核準的藥用輔料,稀釋劑或載體,例如磷酸鹽緩沖液、水、水油乳液等。也包括任何藥典中使用的藥劑。本發明所述的“試劑盒(kit) ”或“試劑套組”是指配有進行分析或測定所必需的全部試劑的成套用品。試劑盒內包含一個或多個試劑項目，包括但不限于，化合物、組合物成分、儀器或設備等。本發明所述的試劑盒可以附或不附使用說明或操作手冊。除非另有定義，本發明所述的所有技術和科學術語和一般慣用的技術和科學術語具有相同含義。本發明不限于本發明所述的特定檢測方法、檢測指導準則(protocol)、和檢測試劑，因為這些檢測方法和試劑可適度改變而能達到相同結果與目的。本發明所使用的科學術語是為了要做具體化的描述，并不是要限制本發明的范圍或領域。
CSElL蛋白及其編碼基因為已知的技藝。CSElL基因(GenBank編號U33286)之脫氧核糖核酸(DNA)序列如下所示序列I (SEQ ID NO. 1)I gtcgcgccat tttgccgggg tttgaatgtg aggcggagcg gcggcaggagcggatagtgc61 cagctacggt ccgcggctgg ggttccctcc tccgtttctg tatccccacgagatcctata121 gcaatggaac tcagcgatgc aaatctgcaa acactaacag aatatttaaagaaaacactt181 gatcctgatcctgccatccg acgtccagct gagaaatttc ttgaatctgttgaaggaaat 241 cagaattatccactgttgct tttgacatta ctggagaagt cccaggataatgttatcaaa301 gtatgtgcttcagtaacatt caaaaactat attaaaagga actggagaattgttgaagat361 gaaccaaacaaaatttgtga agccgatcga gtggccatta aagccaacatagtgcacttg421 atgcttagcagcccagagca aattcagaag cagttaagtg atgcaattagcattattggc481 agagaagattttccacagaa atggcctgac ttgctgacag aaatggtgaatcgctttcag541 agtggagatttccatgttat taatggagtc ctccgtacag cacattcattatttaaaaga601 taccgtcatgaatttaagtc aaacgagtta tggactgaaa ttaagcttgttctggatgcc661 tttgctttgcctttgactaa tctttttaag gccactattg aactctgcagtacccatgca721 aatgatgcctctgccctgag gattctgttt tcttccctga tcctgatctcaaaattgttc781 tatagtttaaactttcagga tctccctgaa ttttgggaag gtaatatggaaacttggatg841 aataatttccatactctctt aacattggat aataagcttt tacaaactgatgatgaagag901 gaagccggcttattggagct cttaaaatcc cagatttgtg ataatgccgcactctatgca961 caaaagtacgatgaagaatt ccagcgatac ctgcctcgtt ttgttacagccatctggaat1021 ttactagttacaacgggtca agaggttaaa tatgatttgt tggtaagtaatgcaattcaa1081 tttctggcttcagtttgtga gagacctcat tataagaatc tatttgaggaccagaacacg1141 ctgacaagtatctgtgaaaa ggttattgtg cctaacatgg aatttagagctgctgatgaa1201 gaagcatttgaagataattc tgaggagtac ataaggagag atttggaaggatctgatatt1261 gatactagacgcagggctgc ttgtgatctg gtacgaggat tatgcaagttttttgaggga1321 cctgtgacaggaatcttctc tggttatgtt aattccatgc tgcaggaatacgcaaaaaat1381 ccatctgtcaactggaaaca caaagatgca gccatctacc tagtgacatctttggcatca1441 aaagcccaaacacagaagca tggaattaca caagcaaatg aacttgtaaacctaactgag1501 ttctttgtgaatcacatcct ccctgattta aaatcagcta atgtgaatgaatttcctgtc1561 cttaaagctgacggtatcaa atatattatg atttttagaa atcaagtgccaaaagaacat1621 cttttagtctcgattcctct cttgattaat catcttcaag ctggaagtattgttgttcat1681 acttacgcagctcatgctct tgaacggctc tttactatgc gagggcctaacaatgccact1741 ctctttacagctgcagaaat cgcaccgttt gttgagattc tgctaacaaaccttttcaaa1801 gctctcacacttcctggctc ttcagaaaat gaatatatta tgaaagctatcatgagaagt1861 ttttctctcctacaagaagc cataatcccc tacatcccta ctctcatcactcagcttaca1921 cagaagctattagctgttag taagaaccca agcaaacctc actttaatcactacatgttt1981 gaagcaatatgtttatccat aagaataact tgcaaagcta accctgctgctgttgtaaat2041 tttgaggaggctttgttttt ggtgtttact gaaatcttac aaaatgatgtgcaagaattt2101 attccatacgtctttcaagt gatgtctttg cttctggaaa cacacaaaaatgacatcccg
2161 tcttcctata tggccttatt tcctcatctc cttcagccag tgctttggga aagaacagga2221 aatattcctg ctctagtgag gcttcttcaa gcattcttag aacgcggttc aaacacaata2281 gcaagtgctg cagctgacaa aattcctggg ttactaggtg tctttcagaa gctgattgca2341 tccaaagcaa atgaccacca aggtttttat cttctaaaca gtataataga gcacatgcct2401 cctgaatcag ttgaccaata taggaaacaa atcttcattc tgctattcca gagacttcag2461 aattccaaaa caaccaagtt tatcaagagt tttttagtct ttattaattt gtattgcata2521 aaatatgggg cactagcact acaagaaata tttgatggta tacaaccaaa aatgtttgga 2581 atggttttgg aaaaaattat tattcctgaa attcagaagg tatctggaaa tgtagagaaa2641 aagatctgtg cggttggcat aaccaactta ctaacagaat gtcccccaat gatggacact2701 gagtatacca aactgtggac tccattatta cagtctttga ttggtctttt tgagttaccc2761 gaagatgata ccattcctga tgaggaacat tttattgaca tagaagatac accaggatat2821 cagactgcct tctcacagtt ggcatttgct gggaaaaaag agcatgatcc tgtaggtcaa2881 atggtgaata accccaaaat tcacctggca cagtcacttc acatgttgtc taccgcctgt2941 ccaggaaggg ttccatcaat ggtgagcacc agcctgaatg cagaagcgct ccagtatctc3001 caagggtacc ttcaggcagc cagtgtgaca ctgctttaaa ctgcattttt ctaatgggct3061 aaacccagat ggtttcctag gaaatcacag gcttctgagc acagctgcat taaaacaaag3121 gaagttttcc ttttgaactt gtcacgaCSElL蛋白(蛋白質ID編號AAC50367. I)之胺基酸序列如下所示序列2 (SEQ ID NO. 2)MELSDANLQTLTEYLKKTLDPDPAIRRPAEKFLESVEGNQNYPLLLLTLLEKSQDNVIKVCASVTFKNYIKRNWRIVEDEPNKICEADRVAIKANIVHLMLSSPEQIQKQLSDAISIIGREDFPQKWPDLLTEMVNRFQS⑶FHVINGVLRTAHSLFKRYRHEFKSNELWTEIKLVLDAFALPLTNLFKATIELCSTHANDASALRILFSSLILISKLFYSLNFQDLPEFWEGNMETWMNNFHTLLTLDNKLLQTDDEEEAGLLELLKSQICDNAALYAQKYDEEFQRYLPRFVTAIWNLLVTTGQEVKYDLLVSNAIQFLASVCERPHYKNLFEDQNTLTSICEKVIVPNMEFRAADEEAFEDNSEEYIRRDLEGSDIDTRRRAACDLVRGLCKFFEGPVTGIFSGYVNSMLQEYAKNPSVNWKHKDAAIYLVTSLASKAQTQKHGITQANELVNLTEFFVNHILPDLKSANVNEFPVLKADGIKYIMIFRNQVPKEHLLVSIPLLINHLQAGSIWHTYAAHALERLFTMRGPNNATLFTAAEIAPFVEILLTNLFKALTLPGSSENEYIMKAIMRSFSLLQEAIIPYIPTLITQLTQKLLAVSKNPSKPHFNHYMFEAICLSIRITCKANPAAVVNFEEALFLVFTEILQNDVQEFIPYVFQVMSLLLETHKNDIPSSYMALFPHLLQPVLWERTGNIPALVRLLQAFLERGSNTIASAAADKIPGLLGVFQKLIAS
KANDHQGFYLLNSIIEHMPPESVDQYRKQIFILLFQRLQNSKTTKFIKSFLVFINLYCIKYGALALQEIFDGIQPKMFGMVLEKI11PEIQKVSGNVEKKICAVGITNLLTECPPMMDTEYTKLWTPLLQSLIGLFELPEDDTIPDEEHFIDIEDTPGYQTAFSQLAFAGKKEHDPVGQMVNNPKIHLAQSLHMLSTACPGRVPSMVSTSLNAEALQYLQGYLQAASVTLL用于產生抗磷酸化CSElL (蛋白質ID編號AAC50367. I)抗體之磷酸化肽的氨基酸序列如下序列3 (SEQ ID NO. 3)
LTpEYpLKKTLDPDPAC[Tp 代表磷酸化蘇氨酸(phosphothreonine)，Yp 代表磷酸化酪氨酸(phosphotyrosine)]實施例抗體實施例所使用之抗體為抗p21/ras抗體(EP1125Y) (Epitomics，美國)；抗CSElL 抗體(3D8)，抗 MAPK1/MAPK3 抗體(phospho T202/204，G15-B) (Abnova，臺灣，中國)；抗CSElL抗體(24)，抗磷酸化酪氨酸抗體(PY20)，抗磷酸化絲氨酸及磷酸化蘇氨酸(phospho-serine/threonine)抗體(22A/pSer/Thr) (BD Pharmingen,美國)；抗 β-微管蛋白抗體(D66) (Sigma Chemicals，美國)；抗β-肌動蛋白抗體(Ab_5)，抗GFP抗體(Ab-I) (Lab Vision，美國)；抗匪 _2抗體(H-76)，抗磷酸化蘇氨酸抗體(H2) (Santa CruzBiotechnology，美國)；山羊抗小鼠 IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories，美國)；聯結Alexa Fluor 488(或568)的山羊抗小鼠(或抗兔)IgG二級抗體(Molecular Probes，美國)。·基因表達載體pZIP-v-H-ras為一種可以表達v_H_Ras蛋白的表達載體，含有新霉素(neomycin)轉染選擇標記，由Dr. Charming J Der提供。pcDNA-CSElL為一種可以表達CSElL蛋白的表達載體，含有新霉素轉染選擇標記，為之前自行建構(Tung 2009) ο可降低細胞CSElL基因表達的 CSElL 短發夾 RNA (shRNA，short hairpin RNA)載體(SC-29909-SH，Santa CruzBiotechnology)，和其對照控制 shRNA 載體(SC-108060, Santa Cruz Biotechnology),含有P票呤霉素(puromycin)轉染選擇標記，購自Santa Cruz公司(Santa CruzBiotechnology)。細胞和基因轉染B16F10 黑色素瘤細胞系購自 American Type Culture Collection (美國)。以 10% 之胎牛血清(FBS)、100units/mL 青霉素(penicillin)、100mg/mL 鏈霉素(streptomycin)及 2mM 谷氨酸(glutamate)補充之 DMEM 培養基(Dulbecco' s ModifiedEagle' s Medium)于37°C，濕潤之5 % CO2大氣條件下培養細胞。利用脂質轉染胺試劑Lipofectamine plus reagent (Invitrogen，美國)以基因表達載體轉染細胞。以高濃度新霉素和嘌呤霉素篩選經轉染之細胞3周。收集多重抗藥性純系(>100)并增殖成大量細胞。將經轉染之細胞維持于含有新霉素和嘌呤霉素之培養基中。用于本文所述實驗之細胞則培養于不含新霉素和嘌呤霉素之培養基中。免疫墨點法以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，并以刮取法收集細胞。以RIPA放射免疫沈淀緩沖液(radioimmunoprecipitation buffer) [25mM三輕甲基氨基甲焼鹽酸鹽(Tris-HCUpH 7.2)，0. 1% 十二烷基硫酸鈉(SDS)，0. I % Triton X_100，l% 脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate)，150mM 氯化鈉(NaCl)，ImM 乙二胺四乙酸(EDTA)，5mM 正鑰1酸鈉(sodium orthovanadate)，ImM 苯甲基橫酸化氟(phenylmethylsulfonyl fluoride)，10 μ g/mL 抑肽酶(aprotinin)，5 μ g/mL 亮抑酶肽(Ieupeptin)，25mM β -甘油磷酸(β-glycerophosphate)，5mM 氟化鈉(sodium fluoride)]溶解收集之細胞。以 BCA 蛋白質檢測套組(Pierce，美國)測定蛋白質濃度。將50 μ g之蛋白質檢體做十二烷基石黃酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠電泳(SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate-polyacryIamidegel electrophoresis)。將蛋白質轉潰至硝酸纖維素膜(nitrocellulose membranes ；Amersham Pharmacia,英國)。硝酸纖維素膜于4°C下和含1%牛血清白蛋白(BSA, bovineserum albumin), 50mM 三輕甲基氨基甲燒鹽酸鹽(Tris-HCl,pH 7. 6), 150mM 氯化鈉，O. I %Tween-20的免疫染色封閉液(blocking buffer)反應16小時。再將硝酸纖維素膜于室溫下與一級抗體反應I小時，接著與辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)結合之二級抗體反應 I 小時。利用 Forte 免疫墨點偵測系統(Forte Western HRP Substrate ；Millipore,美國)測定蛋白含量。免疫沉淀反應以磷酸鹽緩沖液洗滌細胞，收集細胞，加入適量放射免疫沈淀緩沖液，在冰上或者4°C下裂解20分鐘，12，OOOrpm離心10分鐘后取上清；用BCA蛋白質檢測套組(Pierce，美國)測定蛋白濃度。將定量細胞裂解液(500 μ g)、相應的抗體、和30 μ L蛋白A/G-微珠(protein A/G-beads)加入免疫沉淀緩沖液(immunoprecipitation buffer)[含 50mM三輕 甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl，pH 7. 5)，150mM氯化鈉]的試管中，于4°C緩慢搖晃孵育過夜；免疫沉淀反應后，在4°C下，以3，OOOrpm速度離心5分鐘，將蛋白A/G-微珠離心至管底；后將上清液小心吸去，蛋白A/G-微珠用ImL放射免疫沈淀緩沖液洗3-4次；最后加入50 μ L的2倍十二燒基硫酸鈉蛋白加樣緩沖液(SDS protein Loading buffer),在沸水中煮10分鐘；用免疫墨點法分析。以抗GFP的鼠抗體進行控制組免疫沉淀反應。在以血清樣品進行免疫沉淀方面，將血清和與瓊脂糖偶聯的抗磷酸化蘇氨酸抗體(agarose-conjugated anti-phosphothreonine antibodies, H2)(Santa CruzBiotechnology)于磷酸鹽緩沖液中，在4 °C緩慢搖晃孵育過夜；免疫沉淀反應后，在4 °C下，以3，OOOrpm速度離心5分鐘。后將上清液小心吸去，以ImL磷酸鹽緩沖液洗沉淀物3-4次，最后加入50yL的2倍十二烷基硫酸鈉蛋白加樣緩沖液(SDS proteinLoading buffer)，在沸水中煮10分鐘；用免疫墨點法分析。以和瓊脂糖偶聯的小鼠正常IgG(agarose-conjugated normal mouse IgG)進行控制組免疫沉淀反應。免疫熒光實驗及微泡計數將生長于12 X 12mm蓋玻片之細胞以IOOOrpm離心10分鐘。以磷酸鹽緩沖液洗滌并以4%多聚甲醒(paraformaldehyde)之磷酸鹽緩沖液固定細胞,再以甲醇(methanol)處理細胞，之后將細胞以含有0. 1%牛血清白蛋白之磷酸鹽緩沖液反應一小時。使細胞與一級抗體反應一小時后以磷酸鹽緩沖液洗滌，接著與Alexa Fluor 488 (或568)山羊抗小鼠(或抗兔)IgG 二級抗體反應一小時后以磷酸鹽緩沖液洗滌。以倒立式熒光顯微鏡觀察細胞。實驗進行三次獨立實驗，每次實驗含兩個蓋玻片，每片蓋玻片隨機取5個視野觀察。每次實驗觀察三百個細胞并計算這些細胞表面的微泡，由三個獨立實驗所計數的微泡數目繪統計圖并顯示統計標準偏差。細胞增殖分析將相同數量之細胞(IXlO4細胞個數/盤)接種于100-mm細胞培養盤。細胞接種后，每隔24小時以臺盼藍拒染試驗(trypan blue exclusion assay)計算細胞數量。每隔三天更新培養液。每個時間點算三盤細胞，每盤只計算一次。條件培養基(conditionedmedium)
將相同數量之細胞接種于100-_細胞培養盤，先使細胞生長至快滿(sub-confluence)后以磷酸鹽緩沖液洗滌，接著將細胞培養于不含血清之培養液培養48小時后，測定細胞數，收集該培養液，并以10，OOOrpm離心收集之培養液10分鐘后收集上清液，以移除任何可能之懸浮細胞或細胞碎片。微泡收集
細胞條件培養基和血清中之微泡，基本上以分子篩選層析(size exclusionchromatography)及超高速離心技術收集。簡言之，將細胞條件培養基或血清注入Sepharose 2管柱(Amersham Biosciences,美國)。單獨收集每I毫升通過管柱流出的液體，并且以光度儀器測量280nm吸光度。將含大于50萬kDa的收集蛋白質液體在4°C下離心105，OOOg 一小時。離心下來的即為含有微泡的沉淀物，加入50 μ L的磷酸鹽緩沖液均勻混合并低溫保存。GST-CSE1L融合蛋白合成及CSElL蛋白純化GST-CSE1L融合蛋白質是利用小麥胚芽無細胞蛋白質合成系統(wheat germcell-free protein synthesis system ；CellFree Sciences,日本)合成。簡言之，以限制酶切割出pcDNA-CSElL載體的CSElL蛋白合成序列，再將CSElL蛋白合成序列以接合酶接合至Ij pPEU-EOl小麥胚芽表達載體(CellFree Sciences)。將2微克(μ g)的CSElL小麥胚芽表達載體加入含轉錄溶液(transcription premix solution ；CellFree Sciences)的試管中，在37°C進行轉錄反應6小時。將10微升(yL)的轉錄訊息核糖核甘酸(mRNA)產物與10微升的小麥胚芽提取液(WEPR0 3240，CellFree Sciences)混合，并將此混合液注入到含SUB-AMIX(CeIIFree Sciences)試管的下層，在26°C進行蛋白轉譯反應16小時以合成GST-CSE1L融合蛋白。利用GST純化組件(Bulk GST Purification Modules,Amersham Pharmacia,美國)以谷胱甘妝-瓊脂糖凝膠 4B 珠(glutathione-Sepharose 4Bbeads Amersham Pharmacia,美國)純化GST-CSE1L融合蛋白。接著，以磷酸鹽緩沖液洗漆含融合蛋白的管柱，再以還原之谷胱甘肽(reduced glutathione ；Amersham Pharmacia)分離融合蛋白。以凝血酶(thrombin ;Sigma Chemicals,美國)于3units/100 μ g融合蛋白質的濃度下于22°C切割GST-CSE1L融合蛋白16小時。以Amicon Ultra-4離心過濾組(Millipore，美國)移除凝血酶及GST。利用抗CSElL抗體以免疫墨點法確認純化之CSE1L。以BCA蛋白質檢測套組(Pierce)測定CSElL蛋白濃度。組織微陣列切片和免疫組織化學反應將癌組織和相鄰非癌組織石蠟塊切成適度大小，將組織石蠟塊排列及制成組織微陣列切片。以4μπι厚度的組織微陣列切片進行免疫組織化學反應。切片于二甲苯去石蠟并以乙醇復水后，于95°C下將其浸于檸檬酸鹽緩沖液中10分鐘。利用Histostain套組(Zymed,美國)以標記鏈霉抗生物素-生物素法(labeled streptavidin-biotin method)進行免疫組織化學反應。以3%溶于水之過氧化氫遮蓋組織切片內源性過氧化酶活性，之后于室溫下以5%牛血清白蛋白培育I小時以遮蓋非專一性染色。于室溫下使切片與稀釋50倍之抗體反應I小時，之后與生物素化之二級抗體(biotinylated secondary antibodies)反應，最后與鏈霉抗生物素標定之過氧化酶(streptavidin-labeled peroxidase)反應。以二氨基聯苯胺(diaminobenzidine)使切片顯影并以蒸懼水洗漆,最后以Mayer' s蘇木清(Mayer1 s hematoxylin)進行復染。
以Matrigel做細胞侵襲性分析將matrigel基質膠(BD Pharmingen,美國)以I : 10的比例稀釋于DMEM中，并和不含聚乙烯卩比咯唳酮之8 μ m孔徑聚碳酸濾紙(polyvinylpyrrolidone-freepolycarbonate filters ;Costar,美國)于4°C共置16小時，之后以DMEM洗漆濾紙4次后，將其置于微趨化室(microchemotaxis chambers)中。以O. I %胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(trypsin-EDTA)處理細胞并將細胞重新懸浮于含有10%胎牛血清之DMEM培養基，之后以不含血清之DMEM培養基洗滌細胞。最后將細胞(3 X IO5)懸浮于DMEM(200 μ L)并置于微趨化室之上層隔間。將含有20%胎牛血清之細胞培養液(300 μ L)置于微趨化室之下層當作細胞侵襲引誘劑。于細胞培養箱中培養10小時后，以棉花棒完全拭去微趨化室上層隔間濾紙上面之細胞。以甲醇固定微趨化室上層隔間之濾紙下面的細胞，并以Liu' s A及Liu' s B試劑染色，之后于顯微鏡下計數。重復檢測三次，每次檢測包括四個重復。于每個樣本，隨機選擇10個顯微鏡視野計數侵襲到微趨化室濾紙下面的細胞，并且將計數平均統計。·免疫電子顯微鏡(immunogold electron microscopy)用磷酸鹽緩沖液洗漆細胞，并固定在含0. 5%戍二醒(glutaraldehyde)和2%多聚甲醒(paraformaldehyde)的輕乙基狐嗪乙橫酸(HEPES, hydroxyethyl-piperazineethanesulafonic acid)緩沖液(pH值6. 8) 15分鐘,然后再將細胞在含2%多聚甲醒的輕乙基狐嗪乙磺酸緩沖液于4°C反應14天。樣品再用80%乙醇脫水再以Lowicryl HM20樹脂(Polysciences，日本)處理及進行聚合反應24小時。將含細胞的樹脂塊做超薄切片，然后將切片置于涂有2%氯丁橡膠(Neoprene,Ohken,日本)的鎳網(nickel gids)上。樣品以100%乙醇處理3分鐘后，浸泡在65°C的0.0IM乙二胺四乙酸(EDTA，pH值7. 2) 24小時。樣品用磷酸鹽緩沖液洗三次，再和含1%牛血清白蛋白和0. 1% Tween-20的磷酸鹽緩沖液反應15分鐘。樣品再和稀釋于磷酸鹽緩沖液(I 30)的抗體反應I小時，用磷酸鹽緩沖液洗三次，再和偶聯納米金粒子的二級抗體(gold-labeled secondary antibodies)反應，再用磷酸鹽緩沖液洗三次。之后樣品以醋酸鈾(uranyl acetate)染色，以HitachiH-7000 (Hitachi，日本)電子顯微鏡觀察。明膠酶譜檢測(gelatinzymography assay)依細胞數量調整細胞條件培養基體積，取由細胞條件培養基收集的微泡，進行明膠酶譜檢測。將微泡溶于不含還原劑二硫蘇糖醇(dithiothreitol)或2-巰基乙醇(2-Mercaptoethanol)的2倍十二燒基硫酸鈉蛋白加樣緩沖液(SDS protein Loadingbuffer),以含lmg/mL明膠(gelatin)的10%十二燒基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。之后將凝膠以含2. 5% Triton X-100的水洗兩次，每次30分鐘去除十二烷基硫酸鈉(SDS)，并隨后將凝膠置于明膠酶譜緩沖液[50mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl，pH 7.6)，200mM氯化鈉，IOmM氯化鈣(CaCl2)]于37°C放置24小時。將凝膠以Comassie blue染色液(0. 125% Comassie blue R-250，50%甲醇，10%乙酸)染色30分鐘，再以脫色液(20%甲醇，10%乙酸，70%水)脫色，直到清晰的透明條帶顯現。動物癌轉移實驗于標準環境下(22°C;50%濕度；12小時之光/暗周期)，將6至7周(N = 18)及14至15周(N = 26)大之C57BL/6小鼠(實驗動物中心，臺灣，中國)圈養于動物室。實驗包括 4 組[即注射 B16-dEV 細胞(N = 11)，B16-CSE1L 細胞(N = 14)，B16-ras 細胞(N =8)，和B16-Ras/anti-CSElL細胞(N = 11)的小鼠]，且不同年齡的小鼠被均勻地分布在四組。每只鼠由尾靜脈注射100 yL含3X IO4細胞的磷酸鹽緩沖液。注射后三個星期將小鼠犧牲。以肉眼檢驗及顯微檢驗計數小鼠肺中之腫瘤數。小鼠之飼育及實驗程序均依照臺灣實驗動物管理委員會之規范。有3只注射B16-dEV細胞的小鼠、10只注射B16-CSE1L細胞的小鼠、4只注射B16-ras細胞的小鼠、和I只注射B16-Ras/anti_CSElL細胞的小鼠，于注射3周后失去生命，因而被排除肺腫瘤統計。另外，有I只注射B16-dEV細胞的小鼠、I只注射B16-CSE1L細胞的小鼠、O只注射B16-ras細胞的小鼠、和3只注射B16-Ras/anti_CSElL細胞的小鼠，沒有生長腫瘤，因而也被排除腫瘤統計。病人和腫瘤樣本 腫瘤樣本為從臺灣彰化基督教醫院之115個大腸直腸癌病患，取得未經癌治療處理之癌組織及血清檢體。腫瘤檢體在遵循及通過機構倫理審查委員會(IRB)審查核準之指導方針，及告知病患同意下，于診斷及手術時取得檢體。腫瘤的分級和分類，是根據第六版美國聯合委員會的癌癥分期手冊。健康捐贈者的血清樣品，獲得自60個健康人(平均年齡
61.0±8. 7歲；年齡范圍，22-71歲)。收集之血液于室溫下放置至少30分鐘，以形成凝塊。接著使檢體于4°C以1300g離心20分鐘，收集血清。將血清以10，OOOrpm離心10分鐘，收集上清液，以移除任何可能之懸浮細胞或細胞殘骸，并保存于-80°C冷凍以備后續檢測使用。將所有檢體以特定標簽標示以保護病患隱私。在進行分析前所有檢體都未經解凍。患者的臨床病理特征整理于表格I。表格I、大腸直腸癌病患之臨床病理特征
fiuBwiiesI............(■..■: I............(W2_n_,——I(第3期____________(i_4 面，
s Uig( I)s I Hgi1 I I) si agt' III) s I age I V)
_ (η ^ 13) (η = 43) (η = -13) (η = 16)
f 均年齡(范 1到)，歲數“ 66. O 土65.4 +60.3 ±71. I +
I_I 11.5 42-84 丨 10. O, 40-93 丨 15. 2, 28-92 ii.2, 46-8權利要求
1.一種可結合CSElL的抗體或可結合磷酸化CSElL的抗體。
2.如權利要求項1，為一種可結合磷酸化CSElL的抗體。
3.一種于體外檢測受檢測個體腫瘤的方法，包括以下步驟 (1)取得受檢測個體的體液樣本為受檢測體液樣本； (2)取得一個或多個正常個體的體液樣本做為對照組體液樣本； (3)于體外，以權利要求I所述抗體，與受檢測體液樣本及對照組體液樣本分別混合及反應；及 (4)測量受檢測體液樣本中微泡的CSElL或磷酸化CSElL的量； (5)測量對照組體液樣本中微泡的CSElL或磷酸化CSElL的量，比較在步驟(4)測得 之量及步驟(5)測得之平均量，若步驟(4)所述受檢測體液樣本中微泡的CSElL或磷酸化CSElL的量，高于步驟(5)所述對照組體液樣本中微泡的CSElL或磷酸化CSElL的平均量，則表示受檢測個體有腫瘤之可能性。
4.如權利要求項3的方法，CSElL或磷酸化CSElL在所述樣本中的量，以斑點雜交法(dot blot assay)進行檢測。
5.如權利要求項3的方法，CSElL在所述樣本中的量，以抗CSElL抗體和微泡之結合進行檢測。磷酸化CSElL在所述樣本中的量，以抗磷酸化CSElL抗體和微泡之結合進行檢測。
6.如權利要求項3的方法，個體為人類。
7.—種于體外檢測個體腫瘤的方法，包括以下步驟 (1)取得受檢測個體的體液樣本為受檢測體液樣本； (2)取得一個或多個正常個體的體液樣本做為對照組體液樣本； (3)于體外，以權利要求項2所述抗體，與受檢測體液樣本及對照組體液樣本分別混合及反應；及 (4)測量受檢測體液樣本的磷酸化CSElL的量； (5)測量對照組體液樣本的磷酸化CSElL的量， 比較在步驟(4)測得之量及步驟(5)測得之平均量，若步驟(4)所述受檢測體液樣本中的磷酸化CSElL的量，高于步驟(5)所述對照組體液樣本中的磷酸化CSElL的平均量，則表示受檢測個體有腫瘤之可能性。
8.如權利要求項7的方法，磷酸化CSElL在所述樣本中的量，以酶聯免疫吸附試驗(ELISA)進行檢測。
9.如權利要求項7的方法，磷酸化CSElL在所述樣本中的量，以抗磷酸化CSElL抗體和磷酸化CSElL之結合進行檢測。
10.如權利要求項7的方法，個體為人類。
11.一種于體外從個體的體液樣本分離微泡之方法，包括以下步驟 (1)取得個體的體液樣本； (2)于體外以權利要求項I所述抗體，與體液樣本混合及反應'及 (3)分離與抗體結合之微泡。
12.如權利要求項11的方法，個體為動物。
13.如權利要求項11的方法，個體為人類。
14.一種含有抗CSElL抗體或抗磷酸化CSElL抗體的藥物組合物及藥物的賦形劑、稀釋劑或載體。
15.一種于體外檢測體液樣本微泡之方法，步驟包括于體外以權利要求項I所述抗體與體液樣本混合及反應；及檢測抗體之結合。當抗體和體液樣本中微泡的CSElL或磷酸化CSElL結合,表不微泡存在于體液樣本。
16.一個用于于體外檢測或分離體液樣本內之微泡的試劑盒,該試劑盒含有權利要求項I所述抗體。
17.一個用于于體外檢測體液樣本內之磷酸化CSElL的試劑盒，該試劑盒含有權利要求項2所述抗體。
全文摘要
細胞微泡與疾病有關，本發明涉及一個新發現的磷酸化CSE1L(染色體分離-1類蛋白，chromosome segregation 1-like protein)微泡膜蛋白及其應用。所揭示包含可與CSE1L或磷酸化CSE1L結合的組合物，用于分離、檢測或結合微泡，應用于疾病診斷或治療。
文檔編號C07K16/18GK102952190SQ20121016178
公開日2013年3月6日 申請日期2012年5月23日 優先權日2011年8月18日
發明者江明聰 申請人:江明聰