專利名稱：高活性降血壓肽及其制備方法
技術領域：
本發明涉及保健性功能食品及藥品制備領域。具體地，本發明涉及高活性降血壓肽及其制備方法。
背景技術：
高血壓是一種常見的心腦血管疾病，它的發病率高，常伴有心臟、血管、肺以及腎臟功能器官的改變，能引發中風、冠心病等多種疾病。目前，臨床上治療高血壓多采用含有人工合成的降血壓肽的藥品，但人們發現，這種降血壓肽在臨床應用過程中會產生不同程度的副作用。因此，尋找天然的、更安全的降血壓肽意義重大。然而，目前制備天然降血壓肽的方法仍有待改進。
發明內容
本發明是基于發明人的下列發現而完成的核桃作為油料作物，榨油剩余的餅柏，多數被遺棄不能被充分利用。核桃蛋白餅柏中的核桃蛋白含量極高，并且核桃蛋白是大腦最好的營養物質，有著“抗氧化之王”的美稱。利用核桃柏篩選高活性的ACE (血管緊張素轉化酶)抑制肽既可以良好利用核桃加工的剩余產物，又可以得到高活性的降血壓肽。本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在于提出一種制備天然、高活性的降血壓肽的方法及其產品。根據本發明的一個方面，本發明提供了一種高活性降血壓肽。根據本發明的實施例，該高活性降血壓肽具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。根據本發明的具體示例，本發明的高活性降血壓肽的序列為(C端一N端)酪氨酸-谷氨酸-脯氨酸(Tyr - Glu-Pro,YEP)。發明人驚奇地發現，本發明的高活性降血壓肽，其血管緊張素轉化酶抑制活性(在本文中有時也稱為“ACE抑制活性”)高，能夠有效地抑制血管緊張素轉化酶的活性，從而能夠有效地應用于治療高血壓藥物的制備，并且該高活性降血壓肽的生產成本低，具有巨大的實用價值和經濟效益。根據本發明的另一方面，本發明還提供了一種制備上述高活性降血壓肽的方法。根據本發明的實施例，該方法包括利用堿提酸沉法從脫脂核桃粉中提取核桃蛋白；利用蛋白酶對核桃蛋白進行水解，以便獲得水解產物；以及對水解產物依次進行超濾處理、第一凝膠色譜處理、第二凝膠色譜處理和反相高效液相色譜處理，以便獲得高活性降血壓肽。發明人驚奇地發現，利用該方法能夠有效地制備具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的高活性降血壓肽，并且該高活性降血壓肽純度高，能夠有效地抑制血管緊張素轉化酶的活性，進一步通過抑制血管緊張素轉化酶的活性能夠控制血壓，從而能夠有效地應用于治療高血壓藥物的制備。此外，需要說明的是，利用本發明的制備高活性降血壓肽的方法及其產品，現階段均未見報道。根據本發明的實施例，在本發明的制備高活性降血壓肽的方法中，利用堿提酸沉法從脫脂核桃粉中提取核桃蛋白可以進一步包括將脫脂核桃粉與水按照重量比1:10的比例進行混合，并使所得到的混合物在PH 8. O、溫度65攝氏度下進行水解5小時，以便獲得堿提產物；將堿提產物進行第一離心，并收集第一離心上清液；將第一離心上清液在PH4. 5下進行酸沉，以便獲得酸沉產物；將酸沉產物進行第二離心，并收集第二離心沉淀物；以及將第二離心沉淀物進行水洗至中性，以便獲得核桃蛋白。根據本發明的實施例，在本發明的制備高活性降血壓肽的方法中，利用堿提酸沉法從脫脂核桃粉中提取核桃蛋白進一步包括將核桃蛋白進行真空冷凍干燥。由此，在真空低溫的環境下能夠揮干溶劑，維持樣品即核桃蛋白的活性。
根據本發明的實施例，在本發明的制備高活性降血壓肽的方法中，蛋白酶的種類不受特別限制，只要能夠使核桃蛋白有效水解，從而能夠獲得實驗所需的多肽即可。根據本法民的一些具體示例，蛋白酶可以為選自木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和堿性蛋白酶的至少一種，優選胃蛋白酶或堿性蛋白酶，更優選胃蛋白酶。其中，在本文中所使用的表達方式“蛋白酶可以為選自木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和堿性蛋白酶的至少一種”是指，對核桃蛋白進行水解時，可以僅采用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和堿性蛋白酶的任意一種作為蛋白酶，也可以是采用三者的任意組合作為蛋白酶，既可以同時使用三種蛋白酶，也可以依次使用三種蛋白酶。根據本發明的實施例，使用蛋白酶進行水解處理的條件，并不受特別限制。只要能夠實現蛋白酶對所得到的核桃蛋白進行水解即可。根據本發明的實施例，在本發明的制備高活性降血壓肽的方法中，蛋白酶為木瓜蛋白酶，其中，利用木瓜蛋白酶對核桃蛋白進行水解的料液比為25g/L，加酶量為3 (質量/體積)％，pH值為6，水解溫度為50°C，水解時間為4h。根據本發明的實施例，在本發明的制備高活性降血壓肽的方法中，蛋白酶為胃蛋白酶，利用胃蛋白酶對核桃蛋白進行水解的料液比為25g/L，加酶量為4 (質量/體積)％，pH值為2，水解溫度為55°C，水解時間為4h。根據本發明的實施例，在本發明的制備高活性降血壓肽的方法中，蛋白酶為堿性蛋白酶，利用堿性蛋白酶對核桃蛋白進行水解的料液比為25g/L，加酶量為7 (質量/體積)％，pH值為10，水解溫度為60°C，水解時間為2h。其中，在本文中所采用的術語“料液比”是指核桃蛋白與去離子水的質量體積比，如“利用胃蛋白酶對核桃蛋白進行水解的料液比為25g/L”中的料液比是指核桃蛋白與去離子水的質量體積比為25g/L。本發明的發明人驚奇的發現，通過采用前面所述的水解條件，利用相應的蛋白酶能夠非常有效地獲得本發明的高活性降血壓肽。根據本發明的實施例，在得到水解產物后超濾處理、第一凝膠色譜處理、第二凝膠色譜處理和反相高效液相色譜處理的條件并不受特別限制。根據本發明的實施例，在本發明的制備高活性降血壓肽的方法中，對所述水解產物依次進行超濾處理、第一凝膠色譜處理、第二凝膠色譜處理和反相高效液相色譜處理進一步包括利用截留分子量不超過30000，優選不超過10000的超濾膜對所述水解產物進行超濾處理，以便得到濾液；將所述濾液進行第一凝膠色譜處理并對所得到的各組分進行血管緊張素轉化酶抑制活性檢測，以便得到血管緊張素轉化酶抑制活性最高的組分作為第一凝膠色譜產物，根據本發明的實施例，優選所述第一凝膠色譜處理采用Sephadex G25 Medium柱,流動相為IOmM pH 7. O 的 Tris-HCl,流速為 lml/min ；將所述第一凝膠色譜產物進行第二凝膠色譜處理并對所得到的各組分進行血管緊張素轉化酶抑制活性檢測，以便得到血管緊張素轉化酶抑制活性最高的組分作為第二凝膠色譜產物，根據本發明的實施例，優選所述第二凝膠色譜處理采用Superdex Peptide10/300GL柱，流動相為20mM pH 7. O的PBS，流速為0. 5ml/min ;以及將所述第二凝膠色譜產物進行反相高效液相色譜處理并對所得到的各組分進行血管緊張素轉化酶抑制活性檢測，以便得到血管緊張素轉化酶抑制活性最高的組分作為所述高活性降血壓肽，根據本發明的實施例，優選所述反相高效液相色譜處理采用ZorbaxSB-C18柱，流動相A為0. 06% TFA的水，流動相B為0. 05% TFA的乙腈，流速為0. 8ml/min。由此，申請人驚奇地發現，通過利用前面所述的條件進行超濾處理、第一凝膠色譜處理、第二凝膠色譜處理和反相高效液相色譜處理，能夠有效地獲得高活性降血壓肽。此外，需要說明的是，本發明的高活性降血壓肽，現階段尚未見報道，其是本申請的發明人經過艱苦的創造性勞動和優化的工作，從核桃柏中提取制備的新的、天然、安全的降血壓肽，這為更安全、有效的高血壓治療藥物的制備提供了新希望。而本領域的技術人員 可以理解的是，還可以根據本發明提供的高活性降血壓肽的氨基酸序列，即SEQ ID N0:1所示的氨酸-谷氨酸-脯氨酸(Tyr - Glu - Pro，YEP)，利用肽自動合成儀通過合成方法人工合成該高活性降血壓肽。本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。
本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中圖I顯示了根據本發明一個實施例的制備高活性降血壓肽過程中的S^hadex G25Medium柱層析色譜圖，其中A顯示了胃蛋白酶水解產物的Sephadex G25 Medium柱層析色譜圖，B顯示了堿性蛋白酶水解產物的Sephadex G25 Medium柱層析色譜圖；圖2顯示了根據本發明一個實施例的制備高活性降血壓肽過程中的Superdex Peptide 10/300 GL凝膠過濾色譜圖；圖3顯示了根據本發明一個實施例的制備高活性降血壓肽過程中的ZorbaxSB-C18柱反相高效液相色譜圖；以及圖4是顯示了根據本發明一個實施例的制備獲得的高活性降血壓肽的質譜圖。
具體實施例方式下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。一般方法在本發明的實施例中，所采用的工藝路線由以下步驟構成I.利用堿提酸沉法從脫脂核桃粉中提取核桃蛋白將脫脂核桃粉與水按I :10比例溶解，在PH 8. 0，水解溫度65°C的條件下水解5h后，終止水解反應，離心取上清液，在等電點4. 5條件下進行酸沉，離心取沉淀，水洗沉淀至中性，然后將其迅速真空冷凍干燥保存，并通過考馬斯亮藍法測定其蛋白含量為86. 32%。2.利用蛋白酶對上述獲得的核桃蛋白進行水解，以便獲得水解產物，其中各蛋白酶的水解條件如下I)木瓜蛋白酶料液比為25g/L，加酶量3% (m/v),pH 6，溫度50°C，水解時間4h。2)胃蛋白酶料液比為25g/L，加酶量4% (m/v), pH 2，溫度55°C，水解時間4h。3)堿性蛋白酶料液比為25g/L，加酶量7%(m/v)，pH 10，溫度60°C，水解時間2h。3.超濾處理(通過采用不同的超濾膜，得到不同分子量的活性濾液)將所得到的水解產物在4°C條件下經不同分子量大小的超濾膜(MWC0 30000,10000,5000)進行超濾，獲得具有不同分子量的濾液，并測定各部分濾液的體外ACE (血管緊張素轉化酶)抑制活性。然后，將濾液采用真空冷凍干燥保存。 4. ACE (血管緊張素轉化酶)抑制活性測定色譜柱C 18柱(4. 6 X 250mm);檢測波長228nm ;流動相甲醇7jC =30 :70 (體積t匕，含體積分數O. 1%的三氟乙酸)；流速lmL/min。將一定量的樣品溶于O. lmol/L、pH 8· O、含O. 3mol/L氯化鉀的硼酸鹽緩沖液(BBS)中，配置梯度濃度的樣品溶液。取40 μ L樣品溶液和20 μ L0. lU/mLACE的BBS溶液置于37°C恒溫水浴中保溫IOminJnA 100 μ L 5mmol/L HHL的BBS作為底物，37°C條件下反應Ih后加入50 μ L lmol/L鹽酸中止反應，冷卻至室溫，取20 μ L反應產物進樣，通過HPLC洗脫圖譜定量馬尿酸生成量，以生成馬尿酸的量判斷樣品的ACE抑制率。計算公式為JC五抑制率X100%
Ai其中Al為空白對照組中馬尿酸的峰面積/(mAU · s)。A2為加入樣品組組中馬尿酸的峰面積/(mAU · s)。5.第一凝膠色譜分離處理將具有高ACE抑制活性的凍干粉溶解在5mll0mMTris-HCl (pH 7. O)中，并經脫氣及O. 22 μ m膜過濾處理，然后經CXG-I電腦層析柜(上海滬西分析儀器廠有限公司)進行層析純化。流動相為10mMTris-HCl (pH 7.0)。色譜柱條件Sephadex G25 Medium 柱(I. 6cmX60cm ；Pharmacia, USA),流速為lml/min,整個設備系統在4°C下進行。洗脫峰在280nm波長處進行檢測并收集，將ACE抑制活性最高的組分(檢測方法如前所示)收集液迅速進行真空冷凍干燥。6.第二凝膠色譜分離處理將通過第一凝膠色譜處理所得到的高ACE抑制活性的凍干粉用20mM PBS (pH 7. O)緩沖液溶解到1ml，并經脫氣及過膜處理，然后經AKTA系統凝膠過濾純化。流動相為20mMPBS (pH 7.0)。色譜柱條件Superdex Peptide 10/300GL 柱(IOmmX 300mm)，流速為O. 5ml/min。洗脫峰在280nm波長處進行檢測并收集，將ACE抑制活性最高的收集液(檢測方法如前所示)迅速進行冷凍干燥。7.反相高效液相色譜分離將通過第二凝膠色譜處理所得到的具有最高ACE抑制活性的收集液的凍干粉，溶解于流動相樣品溶解于流動相A中，并經脫氣過膜處理，然后經反向高校液相色譜柱純化。流動相A :0. 06%TFA的水；流動相B :0. 05%TFA的乙腈色譜柱條件ZorbaxSB-C18 柱(4. 6_X 250mm, 5 u m),流速為 0. 8ml/min。洗脫峰在280nm出進行檢測并收集，其ACE抑制活性最高的收集液(即根據本發明實施例的高活性降血壓肽，其中ACE抑制活性檢測方法如前所示)迅速進行冷凍干燥。8.質譜分析在分離純化得到抑制劑(高活性降血壓肽)之后，通過基質輔助激光解析電離飛行時間質譜進行檢測其分子量。 9.氨基酸序列測定在純化抑制劑(高活性降血壓肽)后，通過PPSQ-31A全自動蛋白/多肽序列儀(Shimadzu Corporation,日本)測定,其氨基酸序列。實施例I :首先，將脫脂核桃粉與水按I :10比例溶解，在pH 8. 0，水解溫度65°C的條件下水解5h后，終止水解反應，離心取上清液，在等電點4. 5條件下進行酸沉，離心取沉淀，水洗沉淀至中性，然后將其迅速真空冷凍干燥保存，并通過考馬斯亮藍法測定其蛋白含量為86. 32%。接著，利用蛋白酶分別進行水解，水解條件I)木瓜蛋白酶料液比為25g/L，加酶量3% (m/v),pH 6，溫度50°C，水解時間4h。2)胃蛋白酶料液比為25g/L，加酶量4% (m/v), pH 2，溫度55°C，水解時間4h。3)堿性蛋白酶料液比為25g/L，加酶量7%(m/v)，pH 10，溫度60°C，水解時間2h。接下來，將水解產物在4°C下經過不同分子量大小的超濾膜(MWC030000、10000、5000)進行超濾，并將所得濾液迅速真空冷凍干燥。然后，將各組分凍干粉配置成lmg/ml濃度的溶液，以測定不同分子量范圍的各組分的ACE (血管緊張素轉化酶)抑制活性(ACE抑制活性檢測方法如一般方法中所述)，結果見下表I。表I超濾所得不同分子量范圍的各組分的ACE抑制活性
權利要求
1.ー種高活性降血壓肽，其具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。
2.ー種制備權利要求I所述的高活性降血壓肽的方法，其特征在于，包括 利用堿提酸沉法從脫脂核桃粉中提取核桃蛋白； 利用蛋白酶對所述核桃蛋白進行水解，以便獲得水解產物；以及對所述水解產物依次進行超濾處理、第一凝膠色譜處理、第二凝膠色譜處理和反相高效液相色譜處理，以便獲得所述高活性降血壓肽。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在干，利用堿提酸沉法從脫脂核桃粉中提取核桃蛋白進一步包括 將所述脫脂核桃粉與水按照重量比I :10的比例進行混合，并使所得到的混合物在pH8.O、溫度65攝氏度下進行水解5小吋，以便獲得堿提產物； 將所述堿提產物進行第一離心，并收集第一離心上清液； 將所述第一離心上清液在PH 4. 5下進行酸沉，以便獲得酸沉產物； 將所述酸沉產物進行第二離心，并收集第二離心沉淀物；以及 將所述第二離心沉淀物進行水洗至中性，以便獲得所述核桃蛋白。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在干，利用堿提酸沉法從脫脂核桃粉中提取核桃蛋白進ー步包括將所述核桃蛋白進行真空冷凍干燥。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶為選自木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和堿性蛋白酶的至少ー種。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述蛋白酶為木瓜蛋白酶，其中，利用所述木瓜蛋白酶對所述核桃蛋白進行水解的料液比為25g/L，加酶量為3(質量/體積)％，PH值為6，水解溫度為50°C，水解時間為4h。
7.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述蛋白酶為胃蛋白酶，利用所述胃蛋白酶對所述核桃蛋白進行水解的料液比為25g/L，加酶量為4 (質量/體積)％，pH值為2，水解溫度為55 °C，水解時間為4h。
8.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述蛋白酶為堿性蛋白酶，利用所述堿性蛋白酶對所述核桃蛋白進行水解的料液比為25g/L，加酶量為7 (質量/體積)％，pH值為IO,水解溫度為60 °C,水解時間為2h。
9.根據權利要求2所述的方法，其特征在干，對所述水解產物依次進行超濾處理、第一凝膠色譜處理、第二凝膠色譜處理和反相高效液相色譜處理進ー步包括 利用截留分子量不超過30000的超濾膜對所述水解產物進行超濾處理，以便得到濾液； 將所述濾液進行第一凝膠色譜處理并對所得到的各組分進行血管緊張素轉化酶抑制活性檢測，以便得到血管緊張素轉化酶抑制活性最高的組分作為第一凝膠色譜產物； 將所述第一凝膠色譜產物進行第二凝膠色譜處理并對所得到的各組分進行血管緊張素轉化酶抑制活性檢測，以便得到血管緊張素轉化酶抑制活性最高的組分作為第二凝膠色譜產物；以及 將所述第二凝膠色譜產物進行反相高效液相色譜處理并對所得到的各組分進行血管緊張素轉化酶抑制活性檢測，以便得到血管緊張素轉化酶抑制活性最高的組分作為所述高活性降血壓肽。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一凝膠色譜處理采用SephadexG-25 Medium 柱,流動相為 IOmM pH 7. 0 的 Tris-HCl,流速為 lml/min, 所述第二凝膠色譜處理采用Superdex Peptide 10/300 GL柱，流動相為20mM pH 7.0的 PBS，流速為 0. 5ml/min， 所述反相高效液相色譜處理采用Zorbax SB-C18柱，流動相A為0. 06% TFA的水，流動相B為0. 05% TFA的こ腈，流速為0. 8ml/min。
全文摘要
本發明涉及高活性降血壓肽及其制備方法。其中，該高活性降血壓肽具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。本發明的高活性降血壓肽，成本低，血管緊張素轉化酶抑制活性高，能夠有效地抑制血管緊張素轉化酶的活性，從而能夠有效地應用于治療高血壓藥物的制備。
文檔編號C07K1/36GK102757479SQ201210142379
公開日2012年10月31日 申請日期2012年5月9日 優先權日2012年5月9日
發明者侯雅坤, 王豐俊, 王建中, 顧欣 申請人:北京林業大學