專利名稱：一種菝葜皂苷元單克隆抗體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，涉及菝葜皂苷元單克隆抗體及其應用。
背景技術：
菝葜皂苷元(sarsasapogenin)是中藥知母主要活性成分留體皂苷的主要留體母核，是知母等中藥的主要有效成分之一，廣泛用于煩熱消渴，熱性病高燒，肺熱咳嗽，結核病發熱，糖尿病，大便干燥等的治療，能增強老年動物大腦膽堿能系統功能，改善腦內自由基代謝，提高學習記憶能力，老年性癡呆癥及腦功能減退等癥狀，因此菝葜皂苷元具有廣泛的應用前景。菝葜皂苷元結構上不具有共軛的多烯或η鍵體系，使得其光譜吸收只有弱的紫外末端吸收，分析困難，現有的分析方法如TLC，HPLC-ELSD法和LC-MS，其中薄層色譜法雖·然要求不高，但是檢測的靈敏度太低，高效液相色譜法，質譜法雖然靈敏度高，能進行大規模檢測，但是其檢測時間長，分析樣品制備復雜，且由于菝葜皂苷元沒有紫外吸收、質譜響應低，難以進行藥物代謝研究的生物樣品中菝葜皂苷元的痕量檢測。酶聯免疫法(ELISA)具有靈敏度，操作簡單，成本低，檢測速度快等特點，之前已有專利敘述了以多抗為基礎的酶聯免疫法來檢測菝葜皂苷元，相比多抗來說，單克隆抗體單純針對某一抗原上的某一抗原決定簇的抗體，相對特異性更高，靈敏度高并且可大量制備，所以建立以單克隆抗體的酶聯免疫法不僅靈敏度高，操作簡單，成本低而且特異強，穩定性高，并且來源簡單，能快速檢測知母藥材中菝葜皂苷元將有十分廣泛的應用前景。為了制備檢測試劑盒，得到菝葜皂苷元細胞株，及針對菝葜阜苷元的單克隆抗體是關鍵。
發明內容
本發明的目的是獲得一種特異性識別菝葜皂苷元單克隆抗體，單克隆抗體的產生過程，由骨髓瘤細胞與產生抗菝葜皂苷元的脾細胞融合制備而成的雜交瘤分泌得到的。所述的脾細胞得自以菝葜皂苷元衍生物與牛血清白蛋白偶聯物(SAR-HS-BSA)免疫的動物所述的偶聯物制備過程將菝葜皂苷元琥珀酰酯衍生物(SAR-HS)9. 8mg、NHS13mg、DCC19mg混合于ImLDMF中，置磁力攪拌器上室溫攪拌反應4小時后加30mg BSA溶液，4°C攪拌反應過夜后將產物裝入透析袋中，雙蒸水透析72小時，凍干得白色粉末，_20°C保存。同方法制備包被原——菝葜皂苷元衍生物與雞卵清白蛋白(21mg)偶聯物(SAR-HS-OVA)。所述的融合制備過程采用SAR-HS-BSA免疫Balb/c小鼠后，將抗血清效價高特異性強的Balb/c小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞按5 I的比例混合，45秒內加入聚乙二醇，然后加入DMEM培養基水浴中靜置lOmin，離心，棄去上清，細胞加入含有HAT的DMEM培養液，混合均勻后每孔100 μ I滴加到96孔板內，培養于CO2濃度為5%和37°C恒溫箱中。所述的篩選陽性雜交瘤細胞過程如下用SAR-HS-OVA包被酶標板，用酶聯免疫間接法對細胞上清液進行鑒定；將陽性值大于陰性值2倍，且陽性值大于O. 5以上的細胞孔內細胞及時進行克隆。6.本發明的又一目的是利用菝葜皂苷元單克隆抗體檢測知母和大鼠血清中菝葜阜苷兀的含量本發明提供的菝葜皂苷元單克隆抗體及其應用，具有如下優點I.利用本發明提供的單克隆抗體對菝葜皂苷元的IC5tl為330. 79ng/mL，靈敏度較聞。2.利用本發明提供的單克隆抗體的特異性強，僅與魯斯可皂苷元，薯蕷皂苷元，短亨山麥冬皂苷C的交叉反應分別為33%，5. 7%，29 %，而與三七皂苷Rl，甘草酸二銨，齊墩果酸無交叉反應。3.利用本發明提供的單克隆抗體建立了酶聯免疫吸附法(ELISA)，線性范圍為·5ng/ml-5yg/ml，檢測不同產地知母藥材中菝葜皂苷元的含量，與HPLC法結果相關性良好；且ELISA分析方法較HPLC法具有快速、微量檢測的特點，可用于藥物代謝等研究中的痕量檢測。綜上所述，本發明提供的單克隆具有靈敏度高，特異性強的特性。本發明成功制備了單克隆抗體，為菝葜皂苷元在知母提取物中和血漿中的快速檢測提供了關鍵技術。
圖I為免疫原(SAR-HS-BSA)的紅外光譜2為及包被原(SAR-HS-OVA)的紅外光譜3為單克隆抗體亞型結構4為SAR抗體的競爭抑制曲線測定
圖5為SAR抗體檢測血漿中SAR濃度隨時間變化的曲線
具體實施例方式(I)本發明所用試劑菝葜皂苷元是本實驗室從知母中分離純化得到，純度大于99% ；N, N’ -二環乙基碳化亞胺(DCC)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，TMB，單抗亞型試劑盒均購自美國Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白OVA購自美國Roche公司；其他化學試劑均符合分析標準(2)Balb/c小鼠，購自揚州大學實驗動物中心；(3)酶標儀(奧地利Tecan公司);Shimadzu LC-10A型高效液相色譜儀；Alltech2000ES型蒸發光檢測器。實施例I單克隆抗體的制備和純化I.免疫原-菝葜皂苷元衍生物與牛血清白蛋白偶聯物(SAR-HS-BSA)的制備(I)稱取50mg的菝葜皂苷元，Ig琥珀酸酐，Iml吡啶沸水浴回流反應9小時。反應后產物用氯仿萃取3次后，收集氯仿層濃縮，以氯仿甲醇(I I)為流動相，采用Sephadex LH-20凝膠柱分離純化，即得到菝葜皂苷元琥珀酰酯衍生物(SAR-HS)。(2)稱取 SAR-HS 9. 8mg、NHS 13mg、DCC 19mg 混合于 ImL DMF 中，置磁力攪拌器上室溫攪拌反應4小時后加入IOmL含30mg BSA的PBS，4°C攪拌反應過夜。(3)反應產物裝入透析袋中，雙蒸水透析72小時，冷凍干燥得白色粉末，-20°C保存。(4)同方法制備SAR-HS與卵清蛋白(21mg)偶聯物(SAR-HS-OVA)2.免疫動物將免疫原SAR-HS-BSA溶解于生理鹽水中(2mg/mL)，加入等體積的弗氏完全佐劑，充分混合均勻，采用Balb/c雌性小鼠(4-6周)進行皮下免疫。加強免疫時，藥物配置方法同上，只是采用弗氏不完全佐劑與溶解于生理鹽水的藥物混合均勻。通常首次免疫與加強免疫，以及加強免疫之間的時間間隔為14-21天。最后一次免疫時不加弗氏佐劑，直接免疫原溶解于生理鹽水中腹腔注射。3.細胞融合(I)骨髓瘤細胞的培養用含有10%胎牛血清的DMEM培養基培養Sp2/0_Agl4細胞。在IO4-IO5個/mL時，一般呈對數生長，只有當細胞處于對數生長期時，生長旺盛，形態良好的細胞才可供融合用。·(2)準備飼養細胞融合前一天準備飼養細胞，將Balb/c小鼠脫頸椎處死，采用無菌剪刀剪開腹部皮膚；用注射器將含有HAT的完全培養基打入小鼠腹腔，吸出沖洗液用HAT完全培養基稀釋，將飼養細胞加到96孔細胞培養板中，每孔100 μ L，置37°C培養箱中培養。(3)細胞融合采用間接ELISA方法和間接競爭ELISA法測檢測血清抗體效價和特異性，選出效價高，特異性強的Balb/c小鼠，在Balb/c小鼠最后一次免疫的第三天，無菌取其脾臟過100目網篩，用DMEM吹下形成單細胞懸液，用于細胞融合；將處于生長對數期的骨髓瘤細胞sp2/0-Agl4和脾細胞進行充分混合IOOOrpm離心lOmin，棄去上清。在45秒內加入預熱至40°C的PEG，先慢后快，邊加邊在水浴中輕搖融合管。加入不完全DMEM培養基20-30mL，水浴中靜置5min后IOOOrpm離心lOmin，棄去上清；加入HAT培養基后將細胞加入預先鋪好飼養細胞的96孔板中，每孔100 μ L，37°C培養箱中培養。(4)陽性細胞株的篩選與克隆陽性細胞株的篩選當克隆團長到孔底面積的1/4-1/5時就可用間接ELISA方法檢測陽性細胞株，同時用間接競爭ELISA對陽性細胞進一步篩選。采用間接ELISA方法初篩I)將濃度為5 μ g/ml的包被抗原(SAR-HS-OVA)包被酶標板，4°C過夜；2)采用洗液(含有5%吐溫-20的O. Olmol/L PBS)洗板后用封閉液(含O. 5%明膠的PBS-T)進行封閉，150 μ L/孔，37°C孵育Ih ；3)洗液洗板后，加入克隆細胞的細胞上清液，另用空白培養基作陰性對照，陽性血清稀釋1000倍作陽性對照，各100 μ L，37°C溫箱孵育2h ；4)洗液洗板，每孔加入稀釋10000的HRP標記山羊抗鼠酶標二抗100 μ L，37°C孵育Ih;5)洗液洗板，每孔加入顯色液100 μ L，37°C溫箱孵育20min后每孔加入50 μ L終
止液后在酶標儀上測定各孔OD45tlnm值。以OD45tlnm值大于陰性對照2倍以上且OD值大于O. 5以上為陽性，選陽性孔進行二次篩選。將初次篩選出的陽性雜交瘤進行間接競爭ELISA實驗，一方面除去假陽性雜交瘤，另一方面選擇特異性強的雜交瘤。具體步驟為I)將濃度為5 μ g/ml的包被抗原(SAR-HS-OVA)包被酶標板，4°C過夜；2)洗液洗板后用封閉液進行封閉，150 μ L/孔，37°C孵育Ih ；
3)洗液洗板后，初次篩選出的陽性孔細胞培養上清與等體積的菝葜皂苷元溶液混合，同時做標準品(Oyg/mL)的空白對照孔，37°C溫箱孵育2h，并且做陰性和陽性對照；4)同上洗板，加入稀釋10000倍的HRP標記山羊抗鼠酶標二抗，100 μ L/孔，37°C孵育Ih ；5)同上洗板，加入顯色底物液100 μ L/孔，37°C溫箱孵育20min ;每孔加入50 μ L
終止液后酶標儀測定各孔OD45tol值；選擇標準品空白對照OD45tol值高、阻斷抑制后OD45tol值低的融合細胞孔的細胞進行克隆化。4.克隆采用有限稀釋法對檢測出的陽性雜交瘤細胞進行亞克隆(I)將待克隆化的雜交瘤細胞用血球計數板計數，調整細胞數是lxlO5，在離心管·中加入ImL DMEM完全培養基，取100 μ L細胞懸液至離心管中補加DMffl到4ml，吹勻，留100 μ L在管底；(2)在離心管中加含有HT的完全培養基至5mL，混勻后滴加至96孔板的前三行，100 μ L/孔，管底留I. 8-2mL左右；(3)補加含有HT的完全培養基至5mL，吹勻后滴加至96孔板的D、E、F三行，每孔一滴，管底留I. 5-1. 8mL左右；(4)補加含有HT的完全培養基至2. 8-3mL左右，吹勻后滴加至96孔板的G、H行；(5)當多克隆細胞孔和單克隆細胞孔都為陽性時，盡可能取單克隆細胞進行再次克隆化，即亞克隆，同時轉入24孔板，繼而轉入培養瓶中進行擴大培養，直至所有細胞孔的培養上清液抗體檢測均為陽性；(6)通過幾輪亞克隆，檢測至100%陽性后，挑出單克隆孔定株。5.單克隆抗體的產生與純化單克隆抗體的大量制備采用常規動物體內誘生腹水的方法，具體步驟為經產的Balb/c小鼠腹腔注射降植烷O. 5mL ;注射后的第10天接種無血清培養基稀釋處于對數生長期的雜交瘤細胞。每只小鼠按0.5-1X106個細胞的量注射；觀察小鼠的腹部，當發現小鼠異常煩躁、腹腔明顯脹大時取腹水，離心管收集腹水；3000r/min離心lOmin，棄脂肪層和細胞層，收集中間澄清層，_20°C分裝保存。用硫酸銨沉淀法進行純化，得到菝葜皂苷元單克隆抗體。實施例2菝葜皂苷元單克隆抗體特性鑒定為了驗證本發明的有效性，進行了以下測定。I.免疫原，包被原的偶聯鑒定通過紅外光譜法對免疫原(SAR-HS-BSA)見圖I及包被原(SAR-HS-OVA)見圖2進行鑒定。其紅外光譜除了在985. 91，926. 51，898. 14，866. 29cm_1具有螺留烷型留體皂苷的特征吸收峰外，在3600-32000^1和ΠΟΟ-ΙΘΟΟαιΓ1區域增加了氨基酸特征吸收峰2.陽性克隆細胞株及其產生抗體的鑒定經過三次的亞克隆，獲得了能識別SAR的單克隆抗體(I)單克隆抗體亞型結構鑒定采用單克隆抗體亞型檢測試劑盒鑒定抗體的亞型結構為IgG2a，見圖3
(2) SAR抗體的特異性鑒定系列稀釋魯斯可皂苷元，薯蕷皂苷元，短亭山麥冬皂苷C，三七皂苷Rl，甘草酸二銨，用間接競爭ELISA方法檢測SAR抗體與其的交叉反應取出5 μ g/ml的包被抗原包被好的酶標板，洗液洗板后，加入封閉劑37°C封閉I小時；洗液洗板后，每孔加入50 μ L的競爭藥物和50 μ L稀釋到最適濃度的抗體溶液進行競爭反應，37°C孵育2小時；洗液洗板后,加入HRP標記羊抗鼠酶標二抗,100 μ L/孔，37°C孵育；洗液洗板后，加底物顯色，100 μ L/孔，37°C顯色后直接加入2M H2SO4, 50 μ I/孔；用酶標儀測定終止反應后的酶標板在450nm處的吸光值。交叉反應計算公式如下Cross-reactivity (% ) = [IC50(半抗原)/IC50(競爭藥物)]X 100%結果表明菝葜皂苷元與魯斯可皂苷元，薯蕷皂苷元，短亭山麥冬皂苷C的交叉反應分別為33 %，5. 7 %，29 %，而與三七皂苷Rl，甘草酸二銨，齊墩果酸無交叉反應表I菝葜皂苷元單克隆抗體與其他藥物的交叉反應
·
化合物IC5G (ng/ml)交叉反應(％)
菝葜皂苷元330.79100
I薯蕷皂苷元5803.365.7
I
短亭山麥冬皂苷C1140·6629
魯斯可鋪元_·4033
甘草酸二銨>300000<1
丨三七皂苷Rl>300000<1
齊繳果酸>300_<1
I___________________—-(3)菝葜皂苷元單克隆抗體的競爭抑制曲線測定取5 μ g/ml的包被抗原SAR-HS-OVA包被酶標板，4°C過夜，加入5%明膠的PBS-T，37°C封閉I小時。同時加入倍比稀釋的菝葜阜苷元標準品(5ng/ml, 10ng/ml, 50ng/ml,100ng/ml，500ng/ml，lOOOng/ml，5000ng/ml，lOOOOng/ml)和 SAR 抗體(稀釋 I 10000)各50yL，37°C，2小時，洗板三次。加入酶標二抗100 μ L，37°C孵育I小時，洗板三次。加入顯色液TMB，顯色20分鐘，酶標儀OD45tlnm.結果見圖4，為IC5tl的測定曲線，表明IC5tl的測定曲線，表明IC5Q為330. 79ng/ml ;線性方程為Y = -0. 9512X 2. 3966，R2 = 0. 9904，為下一步試劑盒組裝奠定了良好的基礎。實施例3菝葜皂苷元單克隆抗體的應用I.樣品制備方法(I)對照品溶液制備精密稱取SAR對照品Img,用甲醇配成lmg/mL的溶液。(2)供試品溶液制備取知母藥材，粉碎，過60目篩，精密稱取藥材粉末0. 5g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇25mL，稱重，靜置過夜，超聲處理40min，補重，過濾，精密量取續濾液IOmL,蒸干，加入10%鹽酸IlmL沸水浴加熱回流2小時，提取液加入40% NaOH中和。氯仿萃取兩次，每次30mL。合并氯仿層，回收溶劑，殘渣用甲醇溶解定容至2mL。HPLC檢測上樣前，SAR提取液用O. 45 μ m的濾膜過濾(3)HPLC標準曲溶液的配制用甲醇配置SAR溶液，濃度為lmg/mL。再分別稀釋成 100 μ g/mL, 150 μ g/mL, 200 μ g/mL, 250 μ g/mL, 300 μ g/mL, 350 μ g/mL 的溶液，用于HPLC-ELSD標曲建立。2.方法學考察2. I重復性試驗精密稱取知母藥材粉末O. 5g，平行6份，按樣品制備方法制備供試品溶液，間接競爭ELISA法測得SAR含量為O. 598%, RSD值為8. 7%0·
2. 2加樣回收率精密稱取知母藥材粉末O. 25g，平行9份，置具塞錐形瓶中，添加3. 6mg · g'6mg · g_\8. 4mg mg · g—1菝葜阜苷元標準品，間接競爭ELISA測得樣品的加樣回收率分別為92. 8%，96. 3%，97. 4%。此分析方法在添加菝葜皂苷元標準品3. 6mg · g^\6mg · g'8. 4mg · g_1 時的 RSD 為 8. 6%,9. 3%,3. 4%0 具體數據見 Table2表2. ELISA法檢測菝葜皂苷元的加樣回收率(η = 3)
權利要求
1.一種菝葜皂苷元單克隆抗體制備方法及基于單克隆抗體的分析方法，其單克隆抗體由按常規雜交瘤技術進行骨髓瘤細胞與產生抗菝葜皂苷元抗體的脾細胞融合制備而成的雜交瘤分泌而來。
2.如權利要求I所述的單克隆抗體，特征在于其制備方法采用的脾細胞得自以菝葜皂苷元與牛血清白蛋白偶聯物免疫的動物。
3.如權利要求2所述的單克隆抗體，其特征在于，所述的偶聯物制備過程如下 (1)先將菝葜皂苷元琥珀酰酯衍生物(SAR-HS)9. 8mg、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 13mg、N，N' -二環乙基碳化亞胺(DCC) 19mg混合于ImL DMF中，置磁力攪拌器上室溫攪拌反應4小時后加入30mg牛血清白蛋白(BSA)溶液，4°C攪拌反應過夜。反應產物裝入透析袋中，雙蒸水透析72小時，冷凍干燥得白色粉末，_20°C保存。
(2)用相同方法制備菝葜皂苷元琥珀酰酯衍生物與卵清蛋白(0VA，21mg)的偶聯物(SAR-HS-OVA)。
4.如權利要求I所述的單克隆抗體，其特征在于，所述的融合制備過程如下 (1)菝葜皂苷元琥珀酯衍生物與牛血清白蛋，白偶聯物免疫Balb/c小鼠。
(2)將脾細胞與骨髓瘤細胞按5 I的比例混合，45秒內加入聚乙二醇促進細胞融合，然后加入DMEM培養基水浴中靜置lOmin，離心，棄去上清，細胞加入含有HAT的DMEM培養液，混合均勻后滴加到96孔板內，于CO2濃度為5%和37°C恒溫箱中進行融合細胞培養。
(3)SAR-HS-OVA包被酶標板，篩選陽性雜交瘤細胞。用酶聯免疫間接法對細胞上清液進行鑒定陽性值大于陰性值2倍，且陽性值大于O. 5以上的細胞孔內為陽性細胞，純化、培養并凍存陽性細胞。
(4)陽性克隆的雜交瘤細胞注入石蠟處理的Balb/c小鼠腹腔，進行單克隆抗體的制備。
5.一種菝葜皂苷元單克隆抗體，其特征在于，所述的抗體對菝葜皂苷元具有特異性，與魯斯可皂苷元，薯蕷皂苷元，短亭山麥冬皂苷C的交叉反應分別為33 %，5. 7 %，29 %，而與三七皂苷Rl，甘草酸二銨，齊墩果酸無交叉反應，適用于藥材及生物樣品中菝葜皂苷元快速痕量檢測。
全文摘要
本發明公開了一種菝葜皂苷元(Sarsasapogenin，SAR)單克隆抗體的制備及其應用。本發明在制備菝葜皂苷元人工抗原的基礎上，通過雜交瘤技術制備抗菝葜皂苷元的單克隆抗體，測得此單克隆抗體與短亭山麥冬皂苷C，薯蕷皂苷元，魯斯可皂苷元的交叉反應率分別為為29％，5.7％，33％，而與甘草酸二銨、三七皂苷R1、齊墩果酸無明顯交叉反應。本發明建立了基于菝葜皂苷元單克隆抗體的ELISA分析方法，該ELISA方法與HPLC法檢測結果相關性良好，且ELISA分析方法較HPLC法具有快速、微量檢測的特點。適用于含菝葜皂苷元的中藥材及血漿等生物樣品中菝葜皂苷元微量檢測，可用于含有該類活性成分的藥物質量控制及藥物代謝動力學研究。
文檔編號C07K16/16GK102786594SQ20121014053
公開日2012年11月21日 申請日期2012年5月9日 優先權日2012年5月9日
發明者余伯陽, 劉吉華, 許玉 申請人:中國藥科大學