專利名稱：楊梅葉原花色素低聚體的超聲波制備方法
技術領域：
本發明涉及功能食品領域，特別涉及食品植物化學組分領域。
背景技術：
原花色素是一類黃烷-3-醇類單體及其C4-C8或C4-C6鍵連接而成聚合體的多羥基酚類化合物，分子骨架為C6-C3-C6，是植物生長過程中的次生代謝產物，因在酸性介質中加熱能產生花色素而得名，原花色素具有良好的抗氧化(Kim Y. J.，Yokozawa T. Modulation of oxidative stress and melanogenesis by proanthocyanidins.Biological & Pharmaceutical Bulletin. 2009，32(7)，1155-1159.)、抗癌(Lu J. M.，Zhang K. Q.，Chen S.A.，Wen W. Grape seed extract inhibits VEGF expression viareducing HIF-Ialpha protein expression. Carcinogenesis. 2009，30 (4)，636-644.)、預防和治療心血管疾病(Karthikeyan K.，Bai B. R. S.，Devaraj S. N. Cardioprotectiveeffect of grape seed proanthocyanidins on isoproterenol-induced myocardialinjury in rats. International Journal of Cardiology.2007，115，(3)，326-333.)和抗糖尿病及其并發癥(Lee Y. A.，Kim Y. J.，Cho E. J. , Yokozawa T. AmeliorativeEffects of Proanthocyanidin on Oxidative Stress and Infl animation inStreptozotocin-Induced Diabetic Rats. Journal of Agricultural and FoodChemistry 2007，55，9395-9400.)等生物活性，已廣泛的應用于食品、化妝品和醫藥等領域。原花色素的生物活性跟其聚合度密切相關，聚合度大于5視為多聚原花色素。因其分子量較大和位阻效應影響了酚羥基的活性，導致其生物活性降低，而天然植物中的原花色素多以多聚體形式存在，因此，原花色素的降解研究受到廣泛關注。目前，研究較多的原花色素的降解方法有催化氫、解亞硫酸降解的化學方法(杜曉，唐偉，廖學品.落葉松多聚原花色素的Pd/C催化氫解反應研究.化學研究與應用，2005，17 (4) :456;田亞新，王運來，韓曉云，劉繼偉，康傳紅.亞硫酸法降解沙棘籽原花色素的條件優化，東北林業大學學報，2012，40 (I) =108-113)和微生物降解的方法(王恒永，真菌降解沙棘原花色素的初步研究，黑龍江大學[碩士論文]，哈爾濱2010，5. 7)。經研究發現楊梅葉原花色素含量非常高(約110mg/g Dff)，結構鑒定發現主要為原飛燕草素；沒有發現用超聲波來制備楊梅葉原花色素低聚體的研究和報導。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種楊梅葉原花色素低聚體的制備方法，采用本發明的方法能獲得大含量的聚合度< 4的楊梅葉原花色素低聚體。為了解決上述技術問題，本發明提供一種楊梅葉原花色素低聚體的制備方法，包括以下步驟I)、在容器中加入純度(即質量含量)> 50%的楊梅葉原花色素提取物和作為溶劑的乙醇，得混合料液；將所述混合料液于-5 50°C的溫度、20khz超聲頻率下超聲處理30 80分鐘； 純度> 50%的楊梅葉原花色素提取物與乙醇的用量比為10g純度> 50%的楊梅葉原花色素提取物/20 40ml乙醇；2)、將步驟I)所得產物經過濾，所得的濾液進行色譜分離，得楊梅葉原花色素低聚體。作為本發明的楊梅葉原花色素低聚體的制備方法的改進，步驟I)中的超聲處理為裝有混合料液的容器被置于低溫恒溫槽中，選用探頭式脈沖超聲波儀器，探頭插入混合料液的液下I L 5cm,混合料液的深度(即液面高度)保持4 8cm，脈沖時間為I 4s，占空比為30% 90%，低溫恒溫槽中控制溫度為-5 50°C，聲強為60. 55 544. 59W/cm2，處理時間為30 80分鐘。作為本發明的楊梅葉原花色素低聚體的制備方法的進一步改進，步驟2)中的色譜分離為液相色譜儀為Agilent llOOSeries，檢測器為UV檢測器，檢測波長為280nm，色譜柱為 Luna Silica(250X4. 6mm, i. d. 5- u m, Phenomenex Inc. , Darmstadt, Germany),進樣量為lOiiL，流速(梯度洗脫的流速)為lmL/min，柱溫為37°C ；流動相由流動相A、流動相B和流動相C組成，流動相A為二氯甲烷，流動相B為甲醇，流動相C為乙酸與水按I : I的體積比混合而得；梯度洗脫中流動相C的體積濃度恒定為4% ；0 20min時，流動相B的體積濃度為14 23. 6% ；20 50min時，流動相B的體積濃度為23. 6 40% ;50 55min時，流動相B的體積濃度為40 86% ；55 60min時,流動相B的體積濃度為86% ；60 65min時，流動相B的體積濃度為86 14% ；收集30 60min時間段內的洗脫液冷凍干燥至恒重后，得楊梅葉原花色素低聚體。作為本發明的楊梅葉原花色素低聚體的制備方法的進一步改進探頭的直徑為10_，容器為深色不透明容器(目的是避免光照引起的氧化)。作為本發明的楊梅葉原花色素低聚體的制備方法的進一步改進當低溫恒溫槽中控制溫度為-5V、聲強為200W/cm2、處理時間為60分鐘時，所得的楊梅葉原花色素低聚體以聚合度為2的為主；當低溫恒溫槽中控制溫度為40°C、聲強為lOOW/cm2、處理時間為70分鐘時，所得的楊梅葉原花色素低聚體以聚合度為4的為主。在本發明中，洗脫液冷凍干燥的條件為-45 -55 °C,時間一般為20 28小時。本發明的楊梅葉原花色素低聚體的制備方法，不同低聚體含量可以通過溫度、聲強、作用時間得到有效控制。在本發明中，聚合度采用NP-HPLC-DAD的方法進行檢測。
在本發明中，探頭式脈沖超聲波儀器的功率變化范圍為0-950W。本發明所用的純度(質量含量)> 50%的楊梅葉原花色素提取物，例如可按照已經公開發表的 Yang, HH ；Ye, XQ ；Liu, DH ；Chen, JC ；Zhang, JJ ；Shen, Y ；Yu, DCharacterization of Unusual Proanthocyanidins in Leaves of Bayberry (Myricarubra, Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2011, 59 (5) : 1622-1629 進行制備。
本發明具有如下優點及效果I、可用于不同品種楊梅葉子中的原飛燕草素(即不同品種的楊梅所得的楊梅葉原花色素提取物)的低聚體的制備；2、具有環保、方便、易控制降解比率的優點。3、所得低聚體可用于不同聚合度原飛燕草素的生物活性功效的評價。
具體實施例方式實施例I、一種楊梅葉原花色素低聚體的制備方法，依次進行以下步驟I)、稱取IOmg純度(質量含量)彡50%的楊梅葉原花色素提取物；加入到裝有30ml乙醇的棕色樣品玻璃管中；得混合料液。上述楊梅葉原花色素提取物是從荸薺品種的楊梅葉中獲取的，經酸催化降解后采用HPLC法事先檢測平均聚合度為8.0，主要為聚合度為2的占22%，聚合度為3的占21%，聚合度為4的18%，聚合度大于4的占39%。裝有混合料液的棕色樣品玻璃管置于低溫恒溫槽中，選用探頭式脈沖超聲波儀器(超聲頻率為20khz)，探頭(探頭的直徑為IOmm)插入混合料液的液下lcm(即探頭的頂端距液面為Icm)，混合料液的深度保持4cm，脈沖時間為2s，占空比為66. 7%，低溫恒溫槽中控制溫度為_5°C，處理時間為60分鐘，聲強為180W/cm2 (即超聲波儀器的功率為180W)。2)、將步驟I)所得產物經過濾，所得的濾液進行色譜分離，色譜分離條件具體為液相色譜儀為Agilent llOOSeries，檢測器為UV檢測器，檢測波長為280nm，色譜柱為 Luna Silica(250X4. 6mm, i. d. 5- u m, Phenomenex Inc. , Darmstadt, Germany),進樣量為10iiL，流速(梯度洗脫的流速)為lmL/min，柱溫為37°C，流動相由流動相A、流動相B和流動相C組成，流動相A為二氯甲烷，流動相B為甲醇，流動相C為乙酸與水按I : I的體積比混合而得；梯度洗脫中流動相C的體積濃度恒定為4% ；0 20min時，流動相B的體積濃度為14 23. 6% ;其余為流動相A ；20 50min時，流動相B的體積濃度為23. 6 40% ;其余為流動相A ；50 55min時，流動相B的體積濃度為40 86% ;其余為流動相A ；55 60min時，流動相B的體積濃度為86% ;其余為流動相A ；60 65min時，流動相B的體積濃度為86 14% ;其余為流動相A ；收集30 60min時間段內的洗脫液冷凍干燥(_51°C冷凍干燥約24小時)至恒重后，得楊梅葉原花色素低聚體4mg。經HPLC法檢測，上述楊梅葉原花色素低聚體中，90%為聚合度< 4的低聚體。
實施例2、將實施例I中的低溫恒溫槽中控制溫度由_5°C改成15，聲強由180W/cm2改成300W/cm2，處理時間由60分鐘改成50 ;其余同實施例I。最終得楊梅葉原花色素低聚體3mg。
經HPLC法檢測，上述楊梅葉原花色素低聚體中，67%為聚合度< 4的低聚體。實施例3、將實施例I中的低溫恒溫槽中控制溫度由_5°C改成45°C，聲強由180W改成400W，處理時間由60分鐘改成70分鐘；其余同實施例I。最終得楊梅葉原花色素低聚體3. 5mg0經HPLC法檢測，上述楊梅葉原花色素低聚體中，79%為聚合度< 4的低聚體。實施例4、將實施例I中的液面高度(即混合料液的深度)由4cm改為6cm，脈沖時間為2s改為4s，占空比由66. 7%改成90%，其余完全同實施例I。最終得楊梅葉原花色素低聚體2. 8mg0經HPLC法檢測，上述楊梅葉原花色素低聚體中，63%為聚合度< 4的低聚體。實施例5、將實施例I中的液面高度(即混合料液的深度)由4cm改為8cm，脈沖時間為2s改為5s，占空比由66. 7%改成30%，其余完全同實施例I。最終得楊梅葉原花色素低聚體2. 75mg0經HPLC法檢測，上述楊梅葉原花色素低聚體中，62%為聚合度< 4的低聚體。實施例6、將實施例I中的楊梅葉原花色素提取物改成是從炭梅品種的楊梅葉中獲取的，該楊梅葉原花色素提取物經酸催化降解后采用HPLC法事先檢測平均聚合度為
9.6，主要為聚合度為2的占22%，聚合度為3的占17%，聚合度為4的占19%，聚合度大于4的占42%。其余完全同實施例I。最終得楊梅葉原花色素低聚體3. 8mg0經HPLC法檢測，上述楊梅葉原花色素低聚體中，85%為聚合度< 4的低聚體。實施例7、將實施例I中的楊梅葉原花色素提取物改成是從烏紫品種的楊梅葉中獲取的，該楊梅葉原花色素提取物經酸催化降解后采用HPLC法事先檢測平均聚合度為
10.1，主要為聚合度為2的占21%，聚合度為3的占17%，聚合度為4的占17%，聚合度大于4的占45%。其余完全同實施例I。最終得楊梅葉原花色素低聚體3. 6mg0經HPLC法檢測法檢測，上述楊梅葉原花色素低聚體中，81%為聚合度< 4的低聚體。對比例I、將實施例I中的溶劑由乙醇改成甲醇，其余同實施例I。最終得楊梅葉原花色素低聚體2. 8mg。經HPLC法檢測，上述楊梅葉原花色素低聚體中，63%為聚合度< 4的低聚體。對比例2、將實施例I中的溶劑由乙醇改成丙醇，其余同實施例I。最終得楊梅葉原花色素低聚體3. 2mg0經HPLC法檢測，上述楊梅葉原花色素低聚體中，72%為聚合度< 4的低聚體。對比例3、將實施例I中的脈沖時間由2s改成500ms，其余同實施例I。最終得楊梅葉原花色素低聚體2. 7mg0
經HPLC法檢測，上述楊梅葉原花色素低聚體中，61%為聚合度< 4的低聚體。對比例4、將實施例I中的脈沖時間由2s改成6s，其余同實施例I。最終得楊梅葉原花色素低聚體3. 9mg0經HPLC法檢測，上述楊梅葉原花色素低聚體中，76%為聚合度< 4的低聚體。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認 為是本發明的保護范圍。
權利要求
1.楊梅葉原花色素低聚體的制備方法，其特征是包括以下步驟 1)、在容器中加入純度>50%的楊梅葉原花色素提取物和作為溶劑的乙醇，得混合料液；將所述混合料液于-5 50°C的溫度、20khz超聲頻率下超聲處理30 80分鐘； 所述純度> 50%的楊梅葉原花色素提取物與乙醇的用量比為10g純度> 50%的楊梅葉原花色素提取物/20 40ml乙醇； 2)、將步驟I)所得產物經過濾，所得的濾液進行色譜分離，得楊梅葉原花色素低聚體。
2.根據權利要求I所述的楊梅葉原花色素低聚體的制備方法，其特征是，所述步驟I)中的超聲處理為 裝有混合料液的容器被置于低溫恒溫槽中，選用探頭式脈沖超聲波儀器，探頭插入混合料液的液下I I. 5cm,混合料液的深度保持4 8cm,脈沖時間為I 4s,占空比為30% 90%，低溫恒溫槽中控制溫度為-5 50°C，聲強為60. 55 544. 59W/cm2，處理時間為30 80分鐘。
3.根據權利要求2所述的楊梅葉原花色素低聚體的制備方法，其特征是所述步驟2)中的色譜分離為 液相色譜儀為Agilent 1100 Series，檢測器為UV檢測器，檢測波長為280nm，色譜柱為Luna Silica，進樣量為lOyL，流速為lmL/min，柱溫為37°C ； 流動相由流動相A、流動相B和流動相C組成，流動相A為二氯甲烷，流動相B為甲醇，流動相C為乙酸與水按I:I的體積比混合而得； 梯度洗脫中 流動相C的體積濃度恒定為4% ； 0 20min時，流動相B的體積濃度為14 23. 6% ； 20 50min時，流動相B的體積濃度為23. 6 40% ; 50 55min時，流動相B的體積濃度為40 86% ； 55 60min時，流動相B的體積濃度為86% ； 60 65min時，流動相B的體積濃度為86 14% ； 收集30 60min時間段內的洗脫液冷凍干燥至恒重后，得楊梅葉原花色素低聚體。
4.根據權利要求3所述的楊梅葉原花色素低聚體的制備方法，其特征是所述探頭的直徑為10_，所述容器為深色不透明容器。
全文摘要
本發明公開了一種楊梅葉原花色素低聚體的制備方法，包括以下步驟1)、在容器中加入純度≥50％的楊梅葉原花色素提取物和作為溶劑的乙醇，得混合料液；將混合料液于-5～50℃的溫度、20khz超聲頻率下超聲處理30～80分鐘；純度≥50％的楊梅葉原花色素提取物與乙醇的用量比為10g純度≥50％的楊梅葉原花色素提取物/20～40ml乙醇；2)、將步驟1)所得產物經過濾，所得的濾液進行色譜分離，得楊梅葉原花色素低聚體。采用本發明的方法能獲得大含量的聚合度≤4的楊梅葉原花色素低聚體。
文檔編號C07D311/62GK102643259SQ20121010552
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月11日 優先權日2012年4月11日
發明者劉東紅, 葉興乾, 吳丹, 孫玉敬, 楊海花, 鐘烈洲, 陳健初 申請人:浙江大學