專利名稱：基于阿片肽Biphalin和神經肽FF的嵌合肽及其合成和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生化技術領域，涉及ー種基于阿片肽和神經肽FF而構建的嵌合肽及其合成方法；本發明同時還涉及該嵌合肽在高效、低副作用鎮痛藥物制備中的應用。
背景技術：
疼痛是人類所經受的最常見的病癥之一，每個人的一生都會經歷疼痛的困擾。據統計全球大約有1/3的人忍受著持續或周期性疼痛的折磨，美國在疼痛相關社會問題的花費約為 I 千億美元/年(/"roc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 2001，98: 11845)。在臨床上，嗎啡類的阿片藥物已被人們廣泛的應用于治療和緩解各種疼痛，但由于阿片類的鎮痛藥物能引起嚴重的耐受、成癮、便秘和呼吸抑制等不良反應，從而大大限制了其臨床應用范圍。
已有的研究結果表明，機體內的阿片肽同樣也能通過激活阿片受體而介導鎮痛作用。為了獲得選擇性高、高效、分子較為穩定的阿片類配體分子，在腦啡肽等阿片肽的結構基礎上通過化學修飾并篩選出了大量的高效配體。Lipkowski等人以腦啡肽為化學模板分子，通過2位氨基酸定點替換、肽鏈C末端肼鍵連接實現了分子ニ聚化，成功構建了ー個高效的阿片肽 Biphalin，其化學結構為(TyrjAla-Gly-Phe-NH)2 (.Peptides 1982，3:697 ；Life Sci 1987，40:2283)。進ー步的藥理學活性研究表明，Biphalin在中樞和腹腔注射時都能引起強鎮痛作用，特別是側腦室注射時其鎮痛強度為嗎啡的257倍，并且腹腔注射Biphalin 引起的成癮戒斷反應較小(プ Pharmacol. Exp. Ther. 1993, 265:1446)。因此，Biphalin在低副作用的阿片類鎮痛藥的研發中具有較好的應用前景。眾所周知，神經肽在機體內都能介導ー種或多種主要的生理和藥理學活性。但是，神經肽在發揮其主要活性的同時也伴隨著ー些次要活性，而大部分次要活性成為了它的副作用。例如，內源性阿片肽在緩解疼痛的同時，會伴隨著耐受、成癮和呼吸抑制等副作用。為了解決這ー矛盾問題，傳統的策略是以神經肽的母體為化學模板，進行了系統的化學修飾而篩選出受體選擇性較高且具有優勢構象的神經肽類似物，從而達到保持較高生物活性并降低其副作用的預期效果。近年來還發展了ー些新策略，即基于高效的肽類配體設計并合成了一系列嵌合肽，以期使嵌合肽在發揮主要活性的同時，能最大限度的降低其副作用。尤其是，Foran等人基于阿片肽EM-2和速激肽P物質(SP)而成功地設計構建了一種全新的雜合肽ESP7(Tyr-Pro-Phe-Phe-Gly-Leu-Met- NH2),并且發現脊髓水平注射ESP7能產生阿片受體依賴的鎮痛作用，但又不產生鎮痛耐受的阿片樣副作用O0Toa Nat. Acad. Sci. U.S.A. 2000，97:7621)。神經肽FF最早是作為ー種抗阿片肽從牛腦中被分離和鑒定的，并發現它具有抗嗎啡鎮痛的作用GdTOC. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 1985，82:7757)。神經肽FF系統涉及到兩種不同的受體前體(Pro-NPFFA和Pro_NPFFB受體)和兩種不同受體(NPFF1和NPFF2受體)(.FEBS Lett. 1997，409:426 -Mol. Pharmacol. 1999，55:804 -,Nat. Cell Biol. 2000，2: 703 J. Biol. Chem. 2001，276:36961 J. Biol. Chem. 2000，275:25965 J. Biol.Chem. 2000，275:39324等)。近年的藥理學活性鑒定表明，NPFF及其相關肽能介導多種生物學活性，NPFF不僅具有抗阿片的功能，還具有原阿片活性，從而被歸為ー類重要的阿片調節肽(β/rr. Top. Med. Chem. 2005, 5:341 )。NPFF自身對基礎痛閾值無影響，即在生理劑量水平對機體的生物學活性影響不大。但NPFF作為阿片調節肽，在維持機體的內源性阿片和抗阿片系統平衡過程中起著重要作用，它參與了鎮痛耐受的調節，井能減弱嗎啡等阿片物質所引起的條件位置偏愛作用(β/rr. Top. Med. Chem. 2005, 5:341 -,Peptides.2006，27:964 -,Peptides. 2007，28:2235 -,Peptides. 2010，31:1374 等)。因此，NPFF 的藥理學功能使其適合作為化學模板分子來發展ー類全新的阿片/NPFF系統的嵌合肽。中專利申請201110097843. 4公開了ー種基于內嗎啡肽2和神經肽FF的嵌合肽，其在保留內嗎啡肽2的N末端結構和神經肽FF的C末端結構基礎上，利用內嗎啡肽2的C末端和神經肽FF的N末端中都存在的苯丙氨酸殘基的特點而構建的一種全新的嵌合肽EN-Q0體內的藥理學研究發現EN-9表現出比內嗎啡肽2更強、更持續的鎮痛活性，并具有無耐受作用、低成癮性等優點。此外，化合物EN-9皮下EN-9能引起顯著的鎮痛作用，能克服內嗎啡肽外周注射無鎮痛活性的缺陷，從而具有用于臨床疼痛治療的潛在應用價值。但是，EN-9的鎮痛活性比臨床用鎮痛藥嗎啡低4-10倍，從而導致其有效鎮痛劑量高于嗎啡。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術中存在的問題，提供ー種鎮痛效果好、副作用低的基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽BN-9。本發明的另一目的是提供一種基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽BN-9的合成方法。本發明還有ー個目的，就是提供該基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽BN-9在制備鎮痛藥物中的應用。(一)基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽
本發明基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽(BN-9)，是以高效阿片肽Biphalin和神經肽FF為化學模板，構建的嵌合肽，其N末端為阿片肽“藥效團”(即半個分子的Biphalin)，C末端為NPFF “藥效團”(即NPFF的C端五肽結構，NPFF (3_8))，其結構式如下
權利要求
1.一種基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽，其結構式如下
2.如權利要求I所述基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽的合成方法，包括以下エ藝步驟 (1)樹脂預處理將Rink-Amide-MBHA樹脂在ニ氯甲烷中攪拌30-40min,使樹脂充分溶脹后減壓抽干溶劑； (2)脫除Fmoc保護將溶脹、抽干溶劑后的樹脂在體積濃度18-25%的六氫吡啶/DMF溶液中，攪拌3-10min后抽干，重復2_3次；再加入體積濃度18-25%的六氫吡啶/DMF溶液，攪拌10-15min，使Fmoc基團脫除完全，然后抽干溶劑；最后用DMF洗滌除凈六氫吡啶，得到脫除Fmoc基團保護的樹脂； (3)縮合依次將#-a-Fmoc保護基團氨基酸、#-羥基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N，N，N，，N，-四甲基脲-六氟磷酸鹽完全溶解于DMF中，再加入ニ異丙基こ胺后混勻得混合溶液；然后在氬氣保護下，將脫除Fmoc基團保護的樹脂加入所述混合溶液中攪拌反應40-60min,抽干溶劑；用DMF重復洗滌除去未反應的#- a -Fmoc保護基團氨基酸、#-羥基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N, N，N’，が-四甲基脲-六氟磷酸鹽； 所述N- a -Fmoc保護基團氨基酸、#-羥基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N, N, N、が-四甲基脲-六氟磷酸鹽的用量分別為脫除Fmoc基團保護的樹脂摩爾量的2-5倍； 所述ニ異丙基こ胺的用量為脫除Fmoc基團保護的樹脂摩爾量的4-10倍； (4)肽鏈的延長重復步驟(2)、(3)8次，按照嵌合肽結構由C-末端向N-末端的順序，依次將帶有#-a -Fmoc保護基團氨基酸逐個縮合至樹脂上，直至完成所有氨基酸殘基的縮合，得到肽樹脂； (5)肽鏈從樹脂上的切割按照步驟(2)的方法將肽樹脂最后ー個氨基酸的Fmoc基團完全脫除；用DCM、MeOH交替洗滌樹脂，充分抽干溶劑后，按每克肽樹脂加入10_25ml的切割齊U，于室溫下切割反應I. 5-5小時；過濾，濾液在不高于37°C的條件下充分減壓旋干，然后用不高于-10°C的こ醚中析出沉淀；靜置后先去除上清的こ醚，再用水充分溶解后用分液漏斗除去こ醚相，水相經冷凍干燥，得白色粗肽固體粉末； (6)粗肽的脫鹽和純化以體積濃度10-20%的こ酸溶液為流動相，將粗肽通過Sephadex G25交聯葡聚糖凝膠柱脫鹽，利用紫外檢測儀收集主峰后冷凍干燥，得到脫鹽的肽化合物；再利用反向高效液相色譜柱進行分離純化，收集主峰，冷凍干燥后得到白色的純肽固體粉末。
3.如權利要求I所述基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽的合成方法，其特征在于步驟(5)所述切割劑是由三氟こ酸、三異丙基硅烷、水以95:2. 5:2. 5的體積比混合形成的溶剤。
4.如權利要求I所述基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽在制備鎮痛藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽，該嵌合肽是以高效的阿片肽Biphalin和神經肽FF為化學模板，在保留阿片高效激動劑和神經肽FF“關鍵藥效團”的基礎上構建而成。體內痛覺調節、耐受和胃腸運動等一系列的藥理學實驗表明本發明基于阿片肽Biphalin和NPFF的嵌合肽BN-9表現出比嗎啡更強的中樞鎮痛活性，并具有無鎮痛耐受、對胃腸運動影響小等優點，有效克服了阿片類鎮痛藥物普遍存在的耐受和便秘等副作用問題。此外，側腦室注射BN-9能顯著地抑制福爾馬林所引起的急性痛和炎癥痛，且鎮痛作用稍強于嗎啡，因此該嵌合肽BN-9制備臨床鎮痛藥物方面具有潛在的應用價值。
文檔編號C07K1/06GK102850431SQ20121009883
公開日2013年1月2日 申請日期2012年4月6日 優先權日2012年4月6日
發明者王銳, 方泉, 韓政嵐, 王子龍, 李寧 申請人:蘭州大學