專利名稱：表現出內皮細胞特異性的啟動子和使用其調節血管生成的方法
表現出內皮細胞特異性的啟動子和使用其調節血管生成的方法本申請是申請日為2010年7月30日，申請號為200580046412. 8的、發明名稱和本發明相同的發明專利申請的分案申請。發明領域和背景本發明涉及可用于在受試者的特定組織區域中調節血管 生成的核酸構建物、藥用組合物和方法。更具體地講，本發明涉及表現出內皮細胞特異性啟動子活性的分離多核苷酸序列及其使用方法，再更具體地講，涉及在內皮細胞中表現出增加的活性和特異性的修飾型前內皮素原-I(PPE-I)啟動子以及核酸構建物，它們可用于在特定細胞亞型中激活細胞毒性，由此能治療特征在于異常新血管形成或細胞生長的疾病，或者可用于誘導新血管生長，由此能治療局部缺血疾病。本發明進一步涉及PPE啟動子的修飾，所述修飾增強其響應于包括低氧和血管生成在內的生理條件的表達，并涉及新血管生成內皮特異性聯合療法。血管牛成血管生成指新血管的生長，這是一個主要依賴于毛細血管內皮細胞的移動、增殖和脈管形成的過程。在血管生成期間，內皮細胞從其靜息狀態蘇醒并迅速增殖。盡管尚不知曉負責將細胞轉變成血管生成表型的分子機制，但導致形成新血管的事件次序已有充分的文件記載[Hanahan，D. , Science 277，48-50，(1997)]。血管生長需要內皮出芽[Risau，ff.，Nature 386,671-674，(1997)]或套疊[Patan，S.等；Microvasc. Res. 51，260-272，(1996)]。在第一條途徑中，可發生以下順序的事件(a)血管基底(通常是毛細血管后微靜脈)和間質基質溶解；(b)內皮細胞向刺激物遷移；(c)尾隨前導內皮細胞之后的內皮細胞增殖；(d)在內皮索(array)/芽中形成管腔(管道化)；(e)通過芽的匯合性吻合形成分支和回路，以允許血液流動；(f)周細胞(即內皮周細胞和平滑肌細胞)包被血管；和(g)在不成熟血管周圍形成基底膜。新血管還可經第二條途徑形成將間質組織柱插入既有血管的管腔中。這些柱隨后的生長及其穩定化導致血管管腔分隔和局部血管網絡重建。血管生成在低氧濃度(局部缺血和腫瘤轉移等)條件下發生，因此在新血管生成中可能是一個重要的環境因素。包括紅細胞生成素、轉鐵蛋白及其受體、大多數葡萄糖轉運和糖酵解途徑基因、LDH、TOGF-BB、內皮素-I (ET-I) ,VEGF和VEGF受體在內的若干種基因的表達在低氧條件下被低氧誘導型因子(HIF-I)與調節這些基因轉錄的低氧效應元件(HRE)的特異性結合所誘導。這些基因響應低氧條件而表達，使細胞能夠在低氧條件下發揮作用。血管生成過程受到由腫瘤細胞或正常細胞分泌的血管生成生長因子以及胞外基質成分和內皮酶活性的調節(Nicosia和Ottinetti, 1990, Lab. Invest.，63,115)。在血管生成初期，內皮細胞芽通過現有血管基底膜中的間隙露出(Nicosia和Ottinetti，1990，參見上文；Schoefl, 1963, Virehous Arch, Pathol. Anat. 337,97-141 ;Ausprunk 和 Folkman,1977, Microvasc. Res. 14, 53-65 ；Paku 和 Paweletz, 1991, Lab. Invest. 63, 334-346)。當新血管形成時，它們的基底膜經歷復雜的結構和組成變化，這些變化被認為會影響血管生成反應(Nicosia 等，1994，ExpBiology. 164，197-206)。
血管牛成和病理學:有多種血管生成因子掌控血管生成過程。當然，在病變期間，促血管生成因子和抗血管生成因子之間的精密平衡被破壞，由此激發非自限性的內皮細胞和內皮周細胞增殖。盡管在正常條件下血管生成是高度受調節的過程，但許多疾病(特征為“血管生成性疾病”)由持續不受調節的血管生成引起。在這樣的病狀中，不受調節的血管生成或者可直接引起特定疾病，或者可使現有的病理狀況惡化。例如，眼部新血管生成已被指是失明的最主要病因，是大約20種眼病的病理學基礎。在某些先有病癥如關節炎中，新形成的毛細血管侵入關節并破壞軟骨。在糖尿病中，在視網膜中形成的新毛細血管侵入玻璃體液，引起出血和失明。直到最近，對在眼部新血管生成疾病、關節炎、皮膚病和腫瘤中出現的血管生成仍難以在治療上進行抑制。不平衡的血管生成以各種病理病癥為典型特征，通常支持病理狀態的演進。例如，在實體瘤中，血管內皮細胞以快達正常組織中的那些細胞約35倍的速度分裂(Denekamp和Hobson，1982 Br. J. Cancer 46:711-20)。這樣的異常增殖是腫瘤生長和轉移所必需的(Folkman,1986Cancer Res. 46 :467-73)。 血管內皮細胞增殖在慢性炎癥疾病例如類風濕性關節炎、牛皮癬和滑膜炎中也是重要的，其中這些細胞在炎癥部位中釋放的生長因子作用下增殖(Brown和Weiss，1988，Ann. Rheum. Dis. 47 :881-5)。在動脈粥樣硬化中，血管中內皮細胞的單克隆擴增觸發動脈粥樣硬化病斑的形成(Alpern-Elran 1989, J. Neurosurg. 70 :942-5)。此外,在糖尿病性視網膜病中，失明被認為是由眼內基底膜變化所引起的，眼內基底膜的變化刺激不受控的血管生成和視網膜消耗(West 和 Kumar, 1988, Lancet I :715-6)。內皮細胞還參與移植排斥。在同種異體移植排斥發作時，內皮細胞表達促粘附決定簇，其引導白細胞運輸到移植部位。據認為，白細胞粘附分子對移植物中的內皮細胞的誘導可以被局部釋放的細胞因子所誘導，正如已知在炎性損害中所發生的。另一方面，消除的血管生成在疾病發生例如動脈粥樣硬化誘發的冠狀動脈阻塞(如心紋痛)、意外損傷或手術后的壞死損害、年齡相關性黃斑變性或胃腸損害如潰瘍中也是一個主要因素。因此，調節或改變血管生成過程在限制該過程促成潛在病狀的病理演進方面以及提供研究其病因學的有價值方法方面可具有重要的治療作用。最近，在開發內皮調節劑(無論是設計為抑制性的還是刺激性的)方面已取得顯著進步。例如，給予在置于成年大鼠腹腔中的、膠原蛋白包被基質內的PFGF蛋白，產生完全血管形成并正常灌注的結構(Thompson等，PNAS 86 :7928_7932，1989)。據報道，將β FGF蛋白注射到冠狀閉塞期間的成年狗冠狀動脈中，導致心肌功能障礙減輕、心肌梗塞縮小和血管分布增加(Yanagisawa-Miwa等，Science 257:1401-1403,1992)。業已報道在心肌局部缺血動物模型中使用β FGF蛋白獲得了相似結果(Harada等，J Clin Invest 94:623-630，1994，Unger 等，Am J Physiol 266 :H1588_H1595，1994)。然而，對于長期功能性血管的大量形成，需要重復或長期遞送上述蛋白因子，從而限制了它們在臨床中的應用。此外，除與血管生成調節因子生產相關的高成本之外，這些因子的有效傳遞需要使用待植入冠狀動脈內的導管，從而進一步增加了治療的費用和難度。
因此，所有抗血管生成治療的基本目標都是使增殖微血管的病灶回復到其正常靜息狀態，并阻止其再生長[Cancer :Principles & Practice of Oncology,第五版,Vincent T. DeVita, Jr. , Samuel Heilman, Steven A. Rosenberg 編輯，Lippincott-RavenPublishers,Philadelphia. (1997)]。同樣,促血管生成治療不僅涉及恢復所需要的血管生成因子，而且涉及重建它們之間的 正確平衡(Dor等，Ann NY Acad Sci 2003 ；995 :208-16)(關于促血管生成治療和抗血管生成治療的詳盡綜述參見Zhang等，Acta Bioch andBiophys Cinica, 2003 :35 :873-880,和 Mariani 等，MedGenMed 2003,5 22 ;和 Folkman,Semin. Onc 2002,29:15-18)。抗血管生成治療:鑒于抗血管生成治療可延緩腫瘤生長演進(例如視網膜病、良性的和惡性的血管生成性腫瘤)，其是強有力的臨床方法。一般來說，每一種由不受控毛細血管生長引起的疾病，如糖尿病性視網膜病、牛皮癬、關節炎、血管瘤、腫瘤生長和轉移，都是抗血管生長治療的標靶。例如，超過臨床上潛伏大小(例如幾mm3)的實體瘤的進行性生長需要連續的新血管形成，即已知為腫瘤血管生成的過程。腫瘤生長和轉移是血管生成依賴性的。腫瘤必須連續地刺激新毛細血管的生長，以傳遞營養和氧供腫瘤自身生長。因此，抗血管生成腫瘤治療的基礎在于阻止腫瘤血管生成或者選擇性地破壞腫瘤中已存在的血管(血管靶向療法)。最近，已開發出許多抗血管生成藥劑來治療惡性疾病，其中一些藥劑已處于臨床試驗中(關于綜述，參見 Herbst 等(2002) Semin. Oncol. 29 :66-77,和 Mariani 等，MedGenMed 2003；5 22)。研究的大部分腫瘤抗血管生成治療標靶是在人體中調節血管生成的主導過程，即血管內皮生長因子(VEGF)與其受體(VEGFR)的相互作用。調節VEGFR的促血管生成作用的藥劑包括(i)針對VEGF蛋白本身或其受體的抗體(例如rhuMAb VEGF，阿代司汀(Avastin)) ；(ii)針對VEGFR酪氨酸激酶的小分子化合物(例如，ZD6474和SU5416) ；(iii)靶向VEGFR的核酶。其它新的血管生成抑制劑包括具有獨特的抗腫瘤和抗血管生成特性的雌二醇的天然代謝物2-甲氧雌二醇(2-ME2)，以及分別為纖溶酶原和膠原蛋白XVIII的蛋白水解切割片段的血管抑制素(angiostatin)和內皮抑制素(endostatin)。盡管在臨床前模型中有前景，但迄今為止在臨床試驗測試的所有抗血管生成藥劑的系統施用都顯示出有限的成功率和相當大的毒性,包括血小板減少癥、白血球減少和咯血。這些結果提示，目前的腫瘤抗血管生成藥劑作為晚期惡性腫瘤療法的用途可能有限。O' Reilly等已經表明，在抗血管生成治療開始至抗腫瘤作用出現之間的潛伏期可能導致在對治療起反應之前的初期腫瘤演進[O' Reilly S等，(1998)Proc Am Soc Clin Oncol17 :217a]。而且，最近的研究提示，毛細血管床之間的血管生成調節可能不同，提示抗血管生成治療可能需要基于器官/組織特異性來優化[Arap等(1998) Science 279 :377-380]。有趣的是，當對冠狀動脈病患者的心肌局部缺血實施針對平滑肌細胞增殖的抗血管生成療法(例如肝素、肝素-肽治療)時，獲得的效果也不理想[Liu等，Circulation，79 1374-1387(1989) ；GoIdman 等 Atherosclerosis,65 :215-225(1987) ；ffolinsky 等，JACC,15(2) :475-481 (1990)]。與利用這些藥劑治療心血管疾病有關的各種限制包括(i)對心血管疾病患者產生不可耐受的風險水平的系統毒性；(ii)妨礙手術后的血管傷口愈合；
(iii)可能破壞周圍的內皮和/或其它中間平滑肌細胞。因此，這些以及其它與系統施用抗血管生成因子相關的固有障礙(即基于體外不穩定性和高劑量需求的制造限制；和歸咎于次最佳效應的快速濃注施用的峰動力學)限制了血管生成因子在新血管生成相關疾病治療中的有效使用。用于癌癥的抗血管生成治療在原發性腫瘤以及轉移性腫瘤中的腫瘤細胞增殖由于營養供應受限導致凋亡速率增加而被抵消。只要發生“血管生成轉變”和營養供應對腫瘤大小足夠，休眠的原發性或轉移性腫瘤就開始發展成轉移瘤。血管生成轉變可經幾種機制發生I.通過癌基因上調促血管生成基因，例如VEGF和bFGF，或下調血管生成抑制物， 例如血小板反應蛋白。2.通過腫瘤相關的低氧條件活化低氧誘導因子-I (HIF-I)。3.腫瘤細胞誘導的腫瘤床成纖維細胞的促血管生成蛋白分泌。4.骨髓內皮祖細胞運輸入腫瘤。表I :腫瘤血管生成的內源性調節物
權利要求
1.下述核酸構建體在制備用于在有需要的受試者中抑制血管生成的藥物中的用途，其中所述的受試者正進行另外的放療治療，所述核酸構建體包含 (a)包含具有SEQID NO :8所示序列的多核苷酸和至少ー個拷貝的SEQ ID NO :6所示的序列的順式調節元件； (b)前內皮素原-I啟動子；和 (c)編碼細胞毒性多肽的多核苷酸序列，所述細胞毒性多肽包含TNFRl的胞外區，以及Fas細胞毒性多肽的跨膜和胞內區。
2.權利要求I的用途，其中所述的化療治療是應用多柔比星的治療。
3.權利要求I或2的用途，其中，所述的前內皮素原-I啟動子是PPE-1-3X啟動子，所述的PPE-1-3X啟動子與所述編碼細胞毒性多肽的多核苷酸序列轉錄連接，所述細胞毒性多肽包含TNFRl的胞外區，以及Fas細胞毒性多肽的跨膜和胞內區。
4.試劑盒，其包含包裝材料，藥物組合物，單位劑量的化療劑和使用說明頁，所述試劑盒用于在有需要的受試者中抑制血管生成，所述的藥物組合物包含藥學上可接受的載體和作為活性成分的下述核酸構建體，所述核酸構建體包含 (a)包含具有SEQID NO :8所示序列的多核苷酸和至少ー個拷貝的如SEQ ID N0:6所示的序列的順式調節元件； (b)前內皮素原-I啟動子；和 (c)編碼細胞毒性多肽的多核苷酸，所述細胞毒性多肽包含TNFRl的胞外區，以及Fas細胞毒性多肽的跨膜和胞內區； 其中的使用說明頁包括指導施用者所述化療劑先于、或與所述藥物組合物同時施用的說明。
5.權利要求4的試劑盒，其中所述的化療劑是多柔比星。
6.下述核酸構建體在制備用于在有需要的受試者中抑制血管生成的藥物中的用途，其中所述的受試者正接受伴隨施用的治療有效量的前藥和另外的放療治療，所述核酸構建體包含 (a)包含具有SEQID NO :8所示序列的多核苷酸和至少ー個拷貝的如SEQ ID N0:6所示的序列的順式調節元件； (b)前內皮素原-I啟動子；和 (c)編碼自殺基因的多核苷酸，所示自殺基因能將前藥轉化成毒性化合物。
7.權利要求6的用途，其中，所述自殺基因選自單純皰疹病毒胸苷激酶、水痘帯狀皰疹病毒胸苷激酶和細菌胞嘧啶脫氨酶。
8.權利要求6的用途，其中，所述前藥選自更昔洛韋、阿昔洛韋、1-5-碘尿嘧啶FIAU、5-氟胞嘧啶、6-甲氧基嘌呤阿糖苷。
9.權利要求6的用途，其中，所述的自殺基因是單純皰疹病毒胸苷激酶，所述的前藥是更昔洛,、阿昔洛,或FIAU。
10.試劑盒，其包含包裝材料，藥物組合物，單位劑量的化療劑和使用說明頁，所述試劑盒用于在有需要的受試者中抑制血管生成，所述的藥物組合物包含藥學上可接受的載體和作為活性成分的下述核酸構建體，所述核酸構建體包含 (a)包含具有SEQ ID NO :8所示序列的多核苷酸和至少ー個拷貝的如SEQ ID NO :6所示的序列的順式調節元件； (b)前內皮素原-I啟動子；和 (C)編碼自殺基因的多核苷酸，所示自殺基因能將前藥轉化成毒性化合物； 其中的使用說明頁包括指導施用者所述化療劑先于、或與所述藥物組合物同時施用的說明。
11.權利要求10的試劑盒，其中所述的自殺基因是胸苷激酶，并且所述的化療劑是更昔洛,。
12.下述核酸構建體在制備用于抑制有需要的受試者中的血管生成的藥物中的用途，其中所述受試者是進行更昔洛韋和放療治療的受試者，所述的核酸構建體包含與編碼單純皰疹病毒胸苷激酶的多核苷酸轉錄連接的PPE-1-3X啟動子，所述的胸苷激酶能將更昔洛韋轉化成毒性化合物。
13.權利要求12的用途，其中，所述的放療是亞治療放療。
14.權利要求I或6的用途，其中，所述的順式調節元件還包含至少兩個拷貝如SEQIDNO 6所示的序列。
15.權利要求I或6的用途，其中，所述的內皮特異性啟動子是PPE-I啟動子。
16.權利要求I或6的用途，其中，所述的內皮特異性啟動子是PPE-1-3X啟動子。
17.權利要求I或6的用途，其中，所述的核酸構建體還包含如SEQID NO :5所示的低氧應答元件。
18.權利要求I或6的用途，其中，所述的順式調節元件如SEQIDNO 7所示。
19.權利要求I或6的用途，其中，所述的核酸構建體包含腺病毒基因組。
20.權利要求I或6的用途，其中，所述的受試者患癌癥。
21.權利要求4或10的試劑盒，其中，所述的順式調節元件還包含至少兩個拷貝如SEQID NO 6所示的序列。
22.權利要求4或10的試劑盒，其中所述的內皮特異性啟動子是PPE-1-3X啟動子。
23.權利要求4或10的試劑盒，其中，所述的核酸構建體還包含如SEQID NO 5所示的低氧應答元件。
24.權利要求4或10的試劑盒，其中，所述的順式調節元件如SEQID NO 7所示。
25.權利要求4或10的試劑盒，其中，所述的核酸構建體包含腺病毒基因組。
26.權利要求I的用途，或者權利要求4或10任ー項的試劑盒，其中所述的前-內皮素原-I啟動子包含SEQ ID NO 1所示的核酸序列。
27.權利要求4，510，11和21-26任一項所述的試劑盒，其中所述的受試者患癌癥。
28.核酸構建體，其包含條件復制型腺病毒載體基因組，所述條件復制型腺病毒載體基因組包含與內皮細胞啟動子轉錄連接的腺病毒El區，所述內皮細胞啟動子包括含至少ー個拷貝的如SEQ IDNO 6所示序列的順式調節元件，并且，其中所述的啟動子選擇性引導所述腺病毒在血管內皮細胞中的轉錄。
29.權利要求28的核酸構建體，其中，所述的順式調節元件還包含至少ー個拷貝的如SEQ ID NO :8所示的序列。
30.權利要求28的核酸構建體，其中，所述的順式調節元件如SEQID NO 7所示。
31.權利要求28的核酸構建體，其中所述的內皮細胞啟動子包含至少ー個拷貝的如SEQ ID NO :1所示的序列。
32.權利要求28的核酸構建體，其中，所述的內皮細胞啟動子是PPE-1-3X。
33.權利要求28的核酸構建體，其中所述的條件復制型腺病毒載體是5型腺病毒載體。
34.權利要求28的核酸構建體，其中，所述的構建體還包含至少ー個具有SEQID NO:5所示的序列的低氧效應元件。
35.權利要求28的核酸構建體，所述的核酸構建體還包含編碼細胞毒性分子的多核苷酸序列。
36.權利要求28的核酸構建體，其中，所述的核酸構建體無報告基因序列。
37.權利要求28所述的核酸構建體，其中，所述的順式調節元件如SEQID N0:7所示，其中，所述內皮細胞啟動子包含至少ー個拷貝的如SEQ ID NO :1所示的序列，其中所述的條件復制型腺病毒載體是5型腺病毒載體，所述的構建體還包含至少ー個具有SEQ ID N05所示的序列的低氧效應元件，并且，其中所述的核酸構建體無報告基因序列。
38.真核細胞，其是經權利要求28-37中任ー項的核酸構建體轉化的真核細胞。
39.用于下調組織中的血管生成的藥物組合物，所述的藥物組合物包含作為活性成分的權利要求28-37中任ー項的核酸構建體，以及藥學上可接受的載體。
40.用于治療受試者中與過度新血管生成相關的疾病或病癥的藥物組合物，所述藥物組合物包含權利要求28-37中任ー項的核酸構建體。
41.權利要求40所述的藥物組合物，其中所述的疾病或病癥選自糖尿病性視網膜病、牛皮癬、關節炎、血管瘤、腫瘤生長和轉移。
全文摘要
公開了表現出內皮細胞特異性啟動子活性的分離多核苷酸序列、新順式調節元件及其使用方法，所述方法能夠治療特征為異常新血管生成或細胞生長的疾病。
文檔編號C07K14/575GK102698287SQ201210086460
公開日2012年10月3日 申請日期2005年11月14日 優先權日2004年11月14日
發明者D·哈拉茨, E·布萊特巴特, L·班吉奧, M·佩雷德, S·格林伯格 申請人:脈管生物生長有限公司