專利名稱：大豆衰老誘導的磷轉運蛋白的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程領域，特別涉及一種大豆轉運蛋白及應用。
背景技術：
磷是植物生長發育需求量僅次于氮的大量元素，是細胞基本成分(如核酸、膜脂等)的組成元素之一，信號傳導(如蛋白的磷酸化)的重要元件，物質運輸(如糖的運輸)的調節物質以及能量代謝(如ATP)的關鍵物質。但是，植物可利用的磷又是自然界和農業生產上極其缺乏的元素。因為自然磷礦資源有限，按照目前磷的使用量計算，磷礦只能維持70年左右；而且游離磷容易被結合到有機物上，形成植物和大多數動物(包括人類)所不能直接利用的化合物(如植酸)。在農業生產上，土壤中可利用的磷含量已成為作物產量的主要限制因子之一，因而，大量施用磷肥成為農業增產的重要途徑；如在我國的小麥生產區，農民施用兩倍于必須量的磷肥以獲得高產。這種耕作方式的巨大代價是造成磷資源的巨大浪費和嚴重的環境污染。因而提高作物對磷的利用率、減少磷肥施用量已成為我們面臨的嚴峻挑戰。提高作物對磷的利用率和減少磷肥施用量，除了可以提高作物對土壤磷的吸收利用效率外，另一條重要途徑就是充分利用植株體內的磷，即從老葉等器官中再分配利用(relocalization)磷用于新生器官的生長發育，提高作物的產量。這條途徑既經濟又環保，具有明顯的戰略意義。衰老葉片中磷的循環再利用是磷元素高效利用的新途徑。植物衰老是器官發育的最終事件，其重要功能之一就是將衰老器官中的物質進行重新分配利用。葉片衰老包括正常發育的老葉衰老以及受病蟲害侵染或干旱等逆境導致的葉片衰老。衰老葉片中各類物質的輸出并再循環利用，使得植物體內的元素利用效率得以充分發揮，并使植物新器官的發育在一定程度上不受環境中營養元素供應的限制，在作物的產量形成過程中至關重要。老葉中的礦質元素(包括N、P、K、S、Zn等)被廣泛循環再利用于新器官(新葉、花、果實等)的發育；在生殖生長階段，葉中的磷被再分配，這對大豆等作物的產量形成具有重要作用。衰老器官中礦質元素循環再利用過程受多個環節的制約，其重要的調控環節之一是對各元素轉運載體的調節，衰老過程轉運載體的轉運效率是礦質元素循環再利用效率的關鍵。大豆是重要的農作物之一，是植物蛋白質、食用油、生物柴油以及異黃酮和卵磷脂等次生代謝產物的重要來源，其產量與土壤磷的供應量和植株對磷的吸收能力直接相關。
發明內容
本發明的目的是提供一種大豆衰老誘導的磷轉運蛋白GmPHT07。本發明的另一目的是提供編碼上述大豆衰老誘導的磷轉運蛋白GmPHT07的基因。本發明的再一目的是提供上述編碼大豆衰老誘導的磷轉運蛋白GmPHT07的基因在提高植物對磷的循環再利用率以及提高植物在磷脅迫下的抗逆能力中的應用。為了實現本發明目的，本發明提供的一種大豆衰老誘導的磷轉運蛋白GmPHT07，其具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列或該序列經替換、缺失和/或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本發明還提供編碼上述蛋白的基因，其具有SEQ ID No. I所示的核苷酸序列。本發明還提供含有編碼大豆衰老誘導的磷轉運蛋白GmPHT07基因的載體及含有該載體的宿主細胞。本發明還提供含有編碼大豆衰老 誘導的磷轉運蛋白GmPHT07基因的轉化植物細胞及轉基因植物。本發明進一步提供編碼大豆衰老誘導的磷轉運蛋白GmPHT07的基因在提高植物對磷的循環再利用率以及提高植物在磷脅迫下的抗逆能力中的應用。優選地，所述植物為擬南芥、大豆等。本發明提供的GmPHT07 基因(全稱為 Glycine max phosphate transporter 07)是從大豆墾農18(由東北農業大學提供)中克隆到的基因，基因的開發閱讀框為ieiibp,它編碼537個氨基酸；大豆衰老誘導的磷轉運蛋白GmPHT07具有12個跨膜域(圖I)和植物 PHTl 特征域 GGDYPLSATIxSE (圖 2);用實時定量 PCR(quantitative real-time RT-PCR，qRT-PCR)方法檢測到GmPHT07基因在器官的各個時期都表達，但在較老的器官(開花期的單葉和第一復葉，單葉期的子葉)中表達量較高(圖3) ;GmPHT07在脅迫條件下的各葉片(尤其是子葉和第一復葉中)和節間中表達較高(圖3) ；GmPHT07蛋白在細胞中定位于細胞膜(圖4) ;GmPHT07基因能恢復酵母的磷轉運蛋白雙突變體PAM2(即Λ Pho84/Λ Pho89)的表現型，可以在磷脅迫的條件下正常生長(圖5);動力學分析顯示GmPHT07蛋白具有對磷高親和力的特點(圖5) ;GmPHT07基因在衰老的葉片中表達量和高(圖6和圖7);黑暗誘導葉片衰老的同時也誘導GmPHT07基因的表達(圖8)。借由上述技術方案，本發明至少具有下列優點及有益效果(I)本發明提供了大豆衰老誘導的磷轉運蛋白GmPHT07(氨基酸序列如SEQ IDNo. 2所示)及編碼該蛋白的基因(核苷酸序列如SEQID No. I所示)。(2)過表達GmPHT07基因可以提高酵母對磷的循環再利用率。(3)本發明提供的大豆衰老誘導的磷轉運蛋白GmPHT07可用于提高各種植物對磷的循環再利用率，提高植物在磷脅迫下的抗逆能力，從而提高植物的產量。
圖I為本發明用TMHMM2.0軟件分析的結果顯示大豆衰老誘導的磷轉運蛋白GmPHT07具有12個跨膜域(上圖，詳細位置與下圖的氨基酸位置對應)以及各個跨膜域的具體位置(下圖)。圖2為本發明大豆衰老誘導的磷轉運蛋白GmPHT07與擬南芥AtPHTl ；4高度同源，PHTl特征域以箭頭指示的方框標示。圖3為本發明大豆衰老誘導的磷轉運蛋白GmPHT07在不同組織中和磷脅迫條件下的表達水平，其中，R -M ；u :單葉；T1 :第一復葉；T2 :第二復葉；Τ3 :第三復葉；Τ4 :第四復葉；N1 :莖從下往上的第一節間；S :莖；F :花；S-S1 :開花后7天的莢；S-S2 :開花后14天的莢；S-S3 :開花后21天的莢；S1 :開花后第7天的種子；S2 :開花后第14天的種子；S3 :開花后第21天的種子；S4 :成熟種子。短線后的字母標示器官名稱，短線前的字母標示發育時期(即相應字母標示器官成熟的時期)。圖4為本發明大豆衰老誘導的磷轉運蛋白GmPHT07定位于細胞膜上(左圖為熒光信號圖，中圖為明場圖，右圖為左圖和中圖的疊加效果圖。熒光信號用箭頭指示)。洋蔥表皮細胞經轉化GFP標記的GmPHT07基因后，再經質壁分離后，用激光共聚焦顯微鏡觀察。圖5為本發明GmPHT07基因在酵母磷轉運蛋白雙突變體PAM2(即Apho84/Apho89)中的異源表達的互補結果，其中，左圖空載體轉化的效果(對照)，中圖為轉化GmPHT07基因的結果圖(縱坐標為培養基的磷濃度，橫坐標為菌液的稀釋倍數)。彩圖中紅褐色表示沒有活性，黃色表示有活性，黃色越淺，活性越強(在黑白圖中，顏色越淺表示活性越強)；右圖為轉化GmPHT07基因的酵母的動力學生長曲線，顯示米氏常數為68. 94 μ M，表明為GmPHT07高親和磷轉運載體。 圖6為本發明中各個發育時期(LI L5為幼葉至衰老葉片)葉片中GmPHT07基因的表達情況，表示老葉比幼葉表達量高。圖7為本發明中自然生長至開花期的大豆各個葉片中的GmPHT07基因表達，表示老葉比幼葉表達量高。U表示單葉，Tl T8為第一至第八復葉，表示老葉中比幼葉表達量高，即的GmPHT07基因的表達受葉齡誘導。左柱形圖為各葉片中的表達，右柱形圖為相應復葉之葉柄中的表達情況。各個葉片圖中的黃色比例尺為1cm。圖8顯示為本發明中黑暗誘導大豆葉片衰老并促進GmPHT07基因的表達。完全展開的單葉經黑暗誘導，導致衰老。小柱形圖為相應樣品的放大圖。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的保護范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例I GmPHT07基因的克隆以大豆品種墾農18(KN18)為試驗材料，在低磷脅迫(Η2Ρ04，100 μ M)下的液體培養基中培養至真葉張開，取根、莖和葉，利用Trizol試劑盒提取總mRNA(Invitrogen公司)，并利用反轉錄試劑盒(Takara公司)對總mRNA進行反轉錄,得到cDNA。液體培養基成份
H3BO350xl0'3mM
MnSO4^H2OIOxlO'3 mM
ZnS04*7H202xl0'3 mM
CuS04*5H201.5χ10'3 mM
Na2Mo04.2H20 0.58xl0'3 mMFeS04.7H200.1 mM
Na2EDTAGH2O0.1 mM
KH2PO4IOmM
KNO32.5 mM
MgS04.7H20IOmM
Ca(N03)2*4H202.5 mM以大豆品種墾農18(KN18)為試驗材料，通過RT-PCR(其程序為95°C預變性3min ；94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 2min, 26 循環；72 °C 5min。反應體系0. 3 μ L LA TaqDNA 聚合酶，I μ L 引物 F，I μ L 引物 R，5 μ L IOX 緩沖液，4 μ L dNTP mix, 2 μ L cDNA,36. 7 μ L H2O ;總體系為 50 μ L。其中，引物 F :5’ -ATGGCGGGAGGACAACTAGGAG-3’ ；引物 R :5’ -GGAACTGGAACCGTCCTAGCAGA-3’。擴增得到 GmPHT07。將其重組到 Gateway 克隆體系的入門載體PGWC上。并送三博遠志生物公司測序，檢測GmPHT07的正確性。分析檢測正確的GmPHT07基因，該基因的開發閱讀框為1611bp，它編碼537個氨基酸；大豆衰老誘導的磷轉運蛋白GmPHT07具有12個跨膜域(圖I)和植物PHTl特征域GGDYPLSATIxSE(圖 2)。
實施例2 GmPHT07基因在酵母中的表達通過Gateway克隆體系將GmPHT07重組到pYES_DEST52載體(購自Invitrogen公司)上，并將重組質粒轉化到缺失兩個高親和磷轉運基因(PH089和PH084)的酵母突變體 PAM2 ( Δ pho89: : TRPl Δ pho84: :HIS3 ade2 leu2 his3 trpl ura3。Martinez,P. , Zvyagilskaya, R. , Allard, P 和 Persson, B. 1998.Physiological regulationof the derepressible phosphate transporter in Saccharomyces cerevisiae.J. Bacteriol. 180, 2253-2256.)中。在GAL(半乳糖)啟動子的作用下，GmPHT07可以互補PH084和PH089的功能，即PAM2可以在低磷(< 50 μ M)條件下正常生長(如圖6所示)。實施例3 GmPHT07基因在大豆中的表達及其在提高大豆對磷的利用率中的應用選用籽粒飽滿且一致的大豆KN18作為測試材料。將其播種于新的蛭石中保濕催芽，于各個生長時期對各器官取樣分析；磷脅迫實驗是將大豆萌發出土 2-3天后，移入H2PO4S 500μΜ的液體培養基中，培養至真葉張開。移至H2PO4的濃度梯度為5μ M的培養基中培養。培養7天后取樣，同實施例I中的操作。黑暗誘導的實驗是取完全展開單葉片，置于潮濕培養皿中黑暗處理，每2天定時取樣分析GmPHT07基因的表達。利用qRT-PCR檢測GmPHT07受磷脅迫的調控影響。引物F:5，-GTGAGTGATGGCGGGAGGAC-3，；引物 R:5，-GATCATAGGCATCGGTGAAGAAT-3，。PCR 程序ABI St印One進行，用SYBR Green I檢測熒光信號。采用15 μ I反應體系，體系配
制如下
SYBR Primix Ex Taq ( 2χ ) 7.5 ul
上游引物(10UM)0.3 ul
下游引物(10UM)0.3 ul
ROX Reference Dye ( 50x )0.3 ul
cDNA1.0 ul
ddH,0 (滅菌雙蒸水)4.6 ul
共計15 ul
qRT-PCR 參數如下
兩步法95°C10S，熱啟動；95°C 5S，60°C lmin,40 個循環。從檢查結果來看，GmPHT07在根中特異表達，并受低磷的強調控。磷濃度為5 μ M時基因的表達量超過對照500 μ M的5倍。但在有磷的條件下，GmPHT07的表達與磷的供給濃度成正相關。用實時定量PCR(quantitativereal-time RT-PCR，qRT-PCR)方法檢測到GmPHT07基因在器官的各個時期都表達，但在較老的器官(開花期的單葉和第一復葉，單葉期的子葉)中表達量較高(圖3。圖中橫坐標器官縮寫為短橫線前的字母U表示單葉期大豆，F表示開花期大豆，S表示莢，seed表示種子；短橫線后的字母表示相應的器官，R，根;A，地上部；H，下胚軸；C，子葉；E，上胚軸；U，單葉；Tl T4，第一至第四復葉，F，花;S，莢;SI S3，不同時期的莢；N1，第一節間)；GmPHT07在脅迫條件下的各葉片(尤其是子葉和第一復葉中)和節間中表達較高(圖3);洋蔥表皮瞬時表達分析表明，GmPHT07蛋白在細胞中定位于細胞膜(圖4，左圖為YFP熒光信號圖，中間為白光圖，右圖為前二者的重疊圖)；GmPHT07基因能恢復酵母的磷轉運蛋白雙突變體PAM2(即APho84/APho89)的表現型，可以在磷脅迫的條件下正常生長(圖5，左和中間圖)；動力學分析顯示GmPHT07蛋白具有對磷高親和力的特點，Km值為68. 94 μ M，稀釋1000倍的菌液在10 μ M低濃度磷條件下可以正常生長(圖5，右圖)；GmPHT07基因在衰老的葉片中表達量和高，詳見圖6和圖7，如圖6不同生育年齡的葉片(下圖)及其GmPHT07相對表達量(上圖，上圖中插入小圖為大圖相應樣品的放大圖)；圖7，開花期同一植株上不同葉片(下圖)及其GmPHTTP07的相對表達量(上圖，左為對應的不同葉片中的GmPHTTP07表達圖，右圖為相應葉柄中的GmPHTTP07基因表達量)；黑暗誘導葉片衰老的同時也誘導GmPHT07基因的表達(圖8)。實施例4 GmPHAT07基因在擬南芥中的表達及其在提高擬南芥對磷的利用率中的應用將GmPHT07基因構建在由35S啟動子驅動的雙元載體pLeela(pLeela載體來自德國馬普 Drs. George Coupland 實驗室，已公開在文獻 I. Liu, Y. X.，Koornneef, M.，and Soppe, ff. J. (2007)The Absence of Histone H2B Monoubiquitination in theArabidopsis hubI(rdo4)Mutant Reveals a Role for Chromatin Remodeling in SeedDormancy. The Plant Cell. 19 :433-444 ；2. Hanano, S. , Stracke, R. , Jakoby, M. , Merkle,T. , Domagalska, M. A. , Weisshaar, B. , and Davis, S. J. (2008)A systematic surveyin Arabidopsis thaliana of transcription factors that modulate circadianparameters. BMC genomics. 9 :182)上,過表達到擬南芥中檢測該基因的功能，已獲得轉基因植株。并用測定了 3棵獨立轉基因植株在低磷(濃度為10 μ M)脅迫的條件下植物體內總磷含量的變化。取生長14天的幼苗，用超純水清洗干凈，放入60°C烘箱中過夜烘干，將稱量后的樣品(100 300mg)直接放入消化罐中，加入7ml 68%的HNO3和2ml 30%的H2O2 (優級純)，用 Microwave laboratory system (Milestone, Italy)在 18CTC,lKPa 條件下消化15min。冷卻后,將消化液轉入25ml用超純水洗凈并烘干的容量瓶中，用超純水定容至 25ml ο 用 Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometer (ICP-0ES,Perkin Elmer, USA),以磷的標準溶液做標準曲線測定磷含量,每個樣品重復測量3次。從測定結果來看，轉基因擬南芥比野生型的總磷含量提高了 3.8%。由此可見，基因GmPHT07過表達于植物中，增強了轉基因植物在低磷脅迫條件下吸收磷的能力，進而有效地提高了植物抗低磷脅迫的能力。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
1.大豆衰老誘導的磷轉運蛋白GmPHT07，其特征在于，其具有 1)由SEQID No. 2所示的氨基酸序列；或 2)SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸且具有同等功能的氨基酸序列。
2.編碼權利要求I所述蛋白的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特征在于，其具有SEQID No. I所示的核苷酸序列。
4.含有權利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權利要求4所述載體的宿主細胞。
6.含有權利要求2或3所述基因的轉化植物細胞。
7.權利要求2或3所述的基因在提高植物對磷的利用率以及提高植物在磷脅迫下的抗逆能力中的應用。
8.如權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的植物為擬南芥。
9.如權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的植物為大豆。
全文摘要
本發明屬于基因工程領域，涉及一種大豆衰老誘導的磷轉運蛋白GmPHT07，其具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，以及編碼該蛋白的基因，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本發明提供的大豆衰老誘導的磷轉運蛋白GmPHT07可用于提高各種植物對磷的循環再利用率，提高植物在磷脅迫下的抗逆能力，從而提高植物的產量。
文檔編號C07K14/415GK102633871SQ20121007849
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月22日 優先權日2012年3月22日
發明者傅永福, 張曉玫, 范成明 申請人:中國農業科學院作物科學研究所