專利名稱：一種治療血管瘤的蛋白質的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白質，具體涉及一種用于治療血管瘤的蛋白質。
背景技術：
血管瘤(hemangioma)是以內皮細胞增生為特征的腫瘤，發病率:新生兒1%-2%，I歲時12%，體重低于IOOOg的早產兒發病率為22.9%，大約80%的血管瘤是單發，20%是多發[I]。血管瘤于出生后第一年生長迅速，I歲后生長速度減緩。血管瘤可見于身體的任何部位，以外表的血管瘤為多見，大約10%血管瘤發生于體內重要部位。生長在外表的血管瘤破壞周圍組織，有些血管瘤呈浸潤性生長，從而造成兒童美容缺陷。另外也可導致功能障礙。在少許情況下，血管瘤又有惡性進程特點，可出現諸多的并發癥如:潰爛、出血、感染等；生長在體內的血管瘤壓迫周圍組織，影響臟器功能，如眶內血管瘤影響視力，縱隔或肺部血管瘤影響壓迫氣道，肝臟 或腹腔多發血管瘤造成臟器受壓。巨大血管瘤可引起高排出量性心衰以及Kasabach-Merritt綜合征(巨大血管瘤伴血小板減少綜合征，KMS)等危及生命合并癥。KMS占嬰兒血管瘤的0.3-1%。因為大約25%的血管瘤在達到最大體積時能自行衰退，對于那些小的、位于不可能產生功能損害的部位以及慢生長的血管瘤，可以期待其衰退；但對于那些可以引起KMS，或影響視覺、呼吸、吞咽、泌尿、胃腸道和供血等生理功能，或快速生長以至于可以產生組織破壞，畸形或毀容，潰瘍和大面積的皮膚枯斑的那些影響人的機體健康和身心健康的血管瘤則必須及時治療。至今尚沒有有效的治療血管瘤的化學藥物。而手術、冷凍、激光、放射、硬化劑、物理、激素等方法治療的病例，經過遠期隨訪，證實有后余損害，美容效果不理想，其并發癥可達50%，并有30%的復發率。當前，亟待于開發新的抑制眼睛血管增生的藥物。
發明內容
本發明的目的是提供一種治療血管瘤的蛋白質。是通過DNA序列合成方法合成一段DNA序列，將這段DNA序列重組于畢赤酵母中表達，表達產物活性分析證明，所合成基因編碼的蛋白具有抑制血管新生和治療血管瘤的功能。其核苷酸序列和它的氨基酸序列如序列表中所述。本發明的目的是通過以下技術措施實現:1.DNA序列的合成設計如下DNA序列，并用套疊PCR方法進行其序列合成。將其序列命名為scl。ATGCACGGAGACTCAGAATACAACATCATGTTTGGTCCCGACATCTGTGGCCCTGGCACCAAGAAGGTTCATGTCATCTTCAACTACAAGGGCAAGAACGTGCTGATCAACAAGGACATCCGTTGCAAGGATGATGAGTTTACACACCTTACACTGATTGTGCGGCCAGACAACCAT
CATCATCATCATCATTAG2.DNA序列編碼蛋白功能的證明(I) DNA序列重組于酵母中表達
通過DNA內切酶和T4DNA連接酶的作用，將以上合成的DNA片段插入畢赤酵母(Pichia pastoris)表達載體pPIC9K的多克隆位點，將其表達載體命名為pPIC9K-scl (附圖1)。用電轉法將pPIC9K-scl轉化畢赤酵母65115，獲得工程菌65115( 1091(-8(31)。用BMGY-BMMY 發酵 GSl 15 (pPICP9K-scl)誘導表達 Scl 蛋白。(2)表達產物活性分析發酵液上清過離子交換柱和N1-Agarose His標簽蛋白純化柱進行純化(附圖2)，收獲的含目標蛋白的液體經過抽濾除鹽后，進行抑制抑制雞胚絨毛尿囊膜血管生成試驗驗證其具有抑制新生血管生成的活性，并且，其抑制血管生成的活性強于血管生成抑制因子Angiostatin0 用 DeadEndTM Fluorometric TUNEL System(Promega)試劑盒進行實驗證明Scl顯著地誘發血管瘤細胞凋亡(P < 0.01)(附圖3)，用噻唑藍法細胞毒性試驗證明Scl抑制血管瘤細胞增殖(P < 0.01))(附圖4)。將人體的血管瘤細胞接種于裸鼠建立人體血管瘤模型，然后用Scl蛋白進行治療證明Scl蛋白能有效地治療血管瘤，是一種治療人體血管瘤的藥物。本發明是人工合成scl基因序列，將scl基因重組于畢赤酵母基因組進行表達獲得Scl蛋白，Scl蛋白可有效地誘發血管內皮細胞凋亡率，抑制人體血管內皮細胞增殖，有效地抑制和治療血管瘤，為生產 特效的抑制人體血管瘤的藥物的開發創造了必要的條件，具有重要的理論和實踐意義。
附圖1.構建含scl基因的畢赤酵母表達載體附圖2.SDS-PAGE分析表達和純化重組Scl蛋白M.蛋白Marker ；0.畢赤酵母發酵液；1.含scl基因的畢赤酵母的發酵液；2.離子交換純化的洗脫I ;3.離子交換純化的洗脫2 ;3.離子交換純化的洗脫3 ;4.親和純化收獲的重組Scl蛋白。附圖3.Scl蛋白誘發血管瘤細胞凋亡a.PBS ；b.Scl附圖4.Scl蛋白抑制血管瘤細胞增殖
具體實施例方式1.DNA序列的合成(I)設計如下DNA序列。ATGCACGGAGACTCAGAATACAACATCATGTTTGGTCCCGACATCTGTGGCCCTGGCACCAAGAAGGTTCATGTCATCTTCAACTACAAGGGCAAGAACGTGCTGATCAACAAGGACATCCGTTGCAAGGATGATGAGTTTACACACCTTACACTGATTGTGCGGCCAGACAACCATCATCATCATCATCATTAG(2)合成如下引物:P 1.
5， ATGCACGGAGACTCAGAATACAACATCATGTTTGGTCCCGACATCTGTGGCCCTGGCAC3，ρ2.
5’ TTCTTGCCCTTGTAGTTGAAGATGACATGAACCTTCTTGGTGCCAGGGCCACAGATGTC3’ρ3.
5， TTCAACTACAAGGGCAAGAACGTGCTGATCAACAAGGACATCCGTTGCAAGGATGATGA3，ρ4.
5，TGGTTGTCTGGCCGCACAATCAGTGTAAGGTGTGTAAACTCATCATCCTTGCAACGGAT3，ρ5.CTAATGATGATGATGATGATGGTTGTCTGGCCGCACAA3’(3)用如下套疊PCR法進行以上序列的合成，其步驟是:①應用Pl和ρ2引物進行PCR，獲得產物I。②用Ρ3和ρ4引物進行PCR擴增，獲得產物2。③以上獲得的產物I和產物2的混合物為底物，用引物Pl和ρ5進行擴增，獲得產物3。(4)將以上PCR產物3 連接于T載體，進行DNA序列分析證明所獲的DNA序列與設計的一致:ATGCACGGAGACTCAGAATACAACATCATGTTTGGTCCCGACATCTGTGGCCCTGGCACCAAGAAGGTTCATGTCATCTTCAACTACAAGGGCAAGAACGTGCTGATCAACAAGGACATCCGTTGCAAGGATGATGAGTTTACACACCTTACACTGATTGTGCGGCCAGACAACCATCATCATCATCATCATTAG2.序列編碼蛋白功能的證明(I)DNA序列重組于酵母中表達及其表達產物的純化通過DNA內切酶和T4 DNA連接酶的作用，將以上合成的DNA片段插入畢赤酵母表達載體PPIC9K的多克隆位點，將其表達載體命名為pPPIC9K-scl (附圖1)。用電轉法將pPIC9K-scl轉化畢赤酵母GSl 15，獲得工程菌GS115 (pPIC9K_scl)。用BMGY-BMMY培養基發酵GS115(pIPIC9K-scl)誘導表達Scl蛋白。將發酵液上清過離子交換柱和N1-AgaroseHis標簽蛋白純化柱，獲得符合標準分子量的目標蛋白(附圖2)。2)表達產物活性分析發酵液上清過離子交換柱和N1-Agarose His標簽蛋白純化柱進行純化(附圖2)，收獲的含目標蛋白的液體經過抽濾除鹽后，進行抑制抑制雞胚絨毛尿囊膜血管生成試驗驗證其具有抑制新生血管生成的活性，并且，其抑制血管生成的活性強于血管生成抑制因子Angiostatin0 用 DeadEndTM Fluorometric TUNEL System(Promega)試劑盒進行實驗證明Scl顯著地誘發血管瘤細胞凋亡(P < 0.01)(附圖3)，用噻唑藍法細胞毒性試驗證明Scl抑制血管瘤細胞增殖(P < 0.01))(附圖4)。將人體的血管瘤細胞接種于裸鼠建立人體血管瘤模型，然后用Scl蛋白進行治療證明Scl蛋白能有效地治療血管瘤，是一種治療人體血管瘤的藥物。實用例一、取Scl蛋白0.5mg溶解于0.2ml生理鹽水(0.85% NaCl)，然后將其加入可經皮肽給藥治療局部血管瘤的特制的Scl蛋白釋放裝置中(Scl蛋白釋放裝置:由碗狀聚乙烯塑料和及鉬金電極片組成，電極內填充由0.0lmol/L朽1檬酸緩沖液(pH3.6)及聚乙烯吡咯脘酮制成的親水膠，內加Scl蛋白(0.5mg)，表面覆以高分子膜。接受電極由電極片和導電膠組成導。電膠的主要成分為羧甲基纖維素鈉和0.0lmol/L磷酸緩沖液，pH7.4。)，即可針對皮膚外表的血管瘤進行局部經皮給藥。
實用例二、取Scl蛋白0.5mg溶解于0.2ml PBS，然后將其加入可經皮肽給藥治療局部血管瘤的特制的Scl蛋白釋放裝置中(Scl蛋白釋放裝置:由碗狀聚乙烯塑料和及鉬金電極片組成，電極內填充由0.0lmol/L檸檬酸緩沖液(pH3.6)及聚乙烯吡咯脘酮制成的親水膠，內加Scl蛋白(0.5mg)，表面覆以高分子膜。接受電極由電極片和導電膠組成導。電膠的主要成分為羧甲基纖維素鈉和0.0lmol/L磷酸緩沖液，pH7.4。)，即可針對皮膚外表的血管瘤進行局部經皮給藥。藥物療效檢測:在40只C57BL/6J雌性裸小鼠(4_6周齡)的背部皮下注入人體血管瘤細胞(1.5 X 106個/只)當腫瘤體積增長至100mm3左右時，將小鼠隨機分為4組，每組10只(A、C組為試驗組，B、D組為對照組)。以同樣的條件對4組血管瘤模型進行經皮給藥，治療使用的脈沖電流強度為0.4mA/cm2,頻率為2000Hz治療時間為20分鐘。在A組使用的給藥裝置中加入用NaCl配制的0.5mg/L的Scl蛋白，在C組使用的給藥裝置中加入用PBS配制的0.5mg/L的Scl蛋白，在B組使用的給藥裝置中加入等體積的NaCl溶液，在D組使用的給藥裝置中加入等體積的PBS溶液。治療時間為三周。治療結果計算兩組鼠治療后血管瘤的面積(計算式:腫瘤寬2X長X0.52)(見表I)。結果分析(表2)表明與對照組(B、D組)比較，試驗組(A、C組)的血管瘤面積呈顯著性減少(P <0.01)。結論:Scl蛋白對人血管瘤有治療作用。表1.用Scl蛋白治療人血管瘤結果(瘤體積mm3)
權利要求
1.一種治療血管瘤的蛋白質，其特征在于編碼這種蛋白質的核苷酸序列是: atgcacggag actcagaata caacatcatg tttggtcccg acatctgtgg ccctggcacc 60 aagaaggttc atgtcatctt caactacaag ggcaagaacg tgctgatcaa caaggacatc 120 cgttgcaagg atgatgagtt tacacacctt acactgattg tgcggccaga caaccatcat 180 catcatcatc attag195。
2.一種治療血管瘤的蛋白質，其特征在于這種蛋白質的氨基酸序列是: Met His Gly Asp Ser Glu Tyr Asn He Met Phe Gly Pro Asp Ile 151015 Cys Gly Pro Gly Thr Lys Lys Val His Val He Phe Asn Tyr Lys 202530 Gly Lys Asn Val Leu He Asn Lys Asp He Arg Cys Lys Asp Asp 354045 Glu Phe Thr His Leu Thr Leu He Val Arg Pro Asp Asn His His 505560His His His His0
3.根據權利要求1所述的一種治療血管瘤的蛋白質的核苷酸序列和權利要求2所述的一種治療眼睛血管增生的蛋白質的氨基酸序列，其特征在于:利用所述的核苷酸序列編碼的蛋白質制備治療血管 瘤的藥物和醫藥制品。
全文摘要
本發明涉及一種用于治療血管瘤的蛋白質，是以人工合成一段DNA序列(scl)，然后將這段DNA序列重組于Pichia pastoris基因組，在Pichia pastoris中表達Scl蛋白；再用離子交換方法和親和層析方法純化Scl蛋白，所得蛋白質具有序列表中<400>2項的序列。本發明的Scl蛋白可有效地誘發血管瘤細胞凋亡，抑制血管瘤細胞增殖，能有效地治療血管瘤模型，為生產特效的抑制血管瘤的藥物的研究和開發創造了必要的條件，具有重要的理論和實踐意義。
文檔編號C07K14/00GK103215257SQ20121004741
公開日2013年7月24日 申請日期2012年2月21日 優先權日2012年2月21日
發明者張愛聯, 張澤華, 沈錦城, 張添元, 羅進賢, 尹慧祥 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所, 海南金寶正誠礦業有限公司