專利名稱：一種制備人免疫球蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及血液制品的制備方法，特別涉及一種制備人免疫球蛋白的方法。
背景技術：
免疫球蛋白至少包括五種IgG、IgM、IgA、IgE和IgD，其中IgG是最重要的免疫球蛋白，其缺乏時會導致機體防御力低下。免疫球蛋白制劑主要有三類肌注人免疫球蛋白、 特異性免疫球蛋白及靜脈注射免疫球蛋白。目前，免疫球蛋白制劑主要是從血漿中分離。1940s，美國哈佛大學的E. J. Cohn教授發明了低溫乙醇分離血漿蛋白的工藝，其后，Nistchmarm和Kistler等人在Cohn氏低溫乙醇法的基礎上進行了改進，提出了改良的低溫乙醇分離血漿蛋白方法，簡化了步驟，縮短了生產周期。但是低溫乙醇分離工藝在免疫球蛋白生產中也存在一定的局限性，球蛋白的回收量停留在3. 8 4. 4g/L間。此外，低溫乙醇工藝制備的免疫球蛋白制劑中IgA的含量相對較高，先天性選擇性IgA缺乏癥患者輸注后易發生不良反應。1969年，Meinbruch等報道了采用辛酸沉淀結合陰離子交換層析從哺乳動物血漿中分離IgG的方法，在不低于pH4. 5的弱酸性條件下，可以將除免疫球蛋白以外的雜蛋白沉淀，然而，該方法仍需采用DEAE-纖維素作為陰離子交換介質進一步純化IgG，工藝復雜且成本高。專利申請號為US 6，307，028的美國專利申請公開了一種采用辛酸沉淀結合兩步陰離子交換層析的純化方法，制備得到了高純度，IgG亞類分布與正常血漿相同的免疫球蛋白制品。然而，與國外相比，中國人血漿中IgM含量較高(中國人血漿中IgM含量占總蛋白含量的10%左右，國外人血漿中IgM含量占總蛋白含量的-3% )，依照前述方法制備純度合格的免疫球蛋白，依靠層析柱吸附大量IgM所需的層析柱體積很大，成本高，難以實現大規模工業化生產。
發明內容
為了解決上述問題，本發明提供了一種新的制備人免疫球蛋白的方法。首先，本發明提供了一種制備人免疫球蛋白的方法，它包括如下步驟(1)溶解將Cohn組分I + II + III或者Cohn組分II + III溶于注射用水中；(2)辛酸沉淀用辛酸或辛酸鹽沉淀雜質，過濾，得濾液；(3)第一步陰離子交換層析將步驟( 所得濾液調節PH至5. 2，用陰離子交換層析純化，得流穿液；(4)沉淀IgM 用水將步驟(3)所得流穿液的電導率調節為500-1000uS/cm，再調節pH至6. 0-7. 3，靜置l-2h，過濾，得濾液；(5)第二步陰離子交換層析將步驟(4)所得濾液的pH調節至5. 6，用陰離子交換層析純化，得流穿液；
(6)經超濾或者透析，配制，病毒滅活，即得人免疫球蛋白成品。其中，所述步驟(1)為取Cohn組分I + II + III或者Cohn組分II +III，加入注射用水中，2-8°C攪拌至其溶解，調節pH為3.8-4.9。通常情況下，注射用水的用量為注射用水與Cohn組分I + II +III或者Cohn組分II +III的體積質量比為10 1-15 1。其中，所述步驟(2)為加入濃度為10mM-20mM的辛酸或辛酸鹽，調節pH為 5. 0-5. 3。其中，步驟(3)所述陰離子交換層析的填料為Capto Q.Gigacap Q或者Unosphere Q，交換層析柱體積為樣品體積的1/105 1/50。其中，步驟(4)所述pH優選為6. 3 6. 74，進一步優選為6. 51 6. 7，再進一步優選為6.51或者6. 7。其中，步驟(5)所述陰離子交換層析的填料為Macrocap Q，交換層析柱體積為樣品體積的1/50 1/35。本發明還提供了前述方法制備的人免疫球蛋白。本發明最后提供了一種藥物組合物，它是以前述的人免疫球蛋白為活性成分，力口上藥學上可接受的輔料或者輔助性成分制備而成。本發明提供的制備方在兩步陰離子層析之間巧妙的增加沉淀IgM這一步驟，第二步陰離子交換層析體積明顯較少，降低生產成本，具有良好的市場應用前景。顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。
圖1本發明人免疫球蛋白制備方法示意2pH與IgM沉淀量以及IgG收率的關系圖
具體實施例方式實施例1用本發明方法制備人免疫球蛋白1、實驗材料Cohn組分I + II +III或者組分II + III 按照《醫學生物制品學》(人民衛生出版社)，第二版，1194頁記載的低溫乙醇沉淀法制備。鹽酸、辛酸、CaptoQ 填料、Gigacap Q 填料、biosphere Q 填料、Macrocap Q、硅藻土和Beckman IMMAGE IgA檢測試劑盒，均為市售品。2、實驗方法如圖1所示，制備人免疫球蛋白(I)Cohn 組分 I + II +III 取 4kg Cohn 組分 I+II+III 沉淀溶解于 40L 5°CWFI (注射用水)中，攪拌lh，使用0. 5M鹽酸調整pH至4. 20，25°C水浴加熱攪拌池；(2)辛酸沉淀直接加入辛酸至終濃度15mM，使用0. 5M NaOH調pH至5. 20，25°C水浴加熱攪拌ai，8°c靜置池；(3)第一步陰離子交換層析辛酸沉淀反應混懸液用普通深層濾板過濾，濾液用 0. 5M鹽酸或0. 5M NaOH調整pH至5. 20，用Capto Q填料進行第一步陰離子交換層析，層析 PH5. 20，線流速200cm/h，交換層析柱體積為樣品體積的1/75 ；(4)沉淀IgM 層析流穿液先調整電導至700 μ s/cm,后使用0. 5MNa0H調整pH至 6. 3，靜置 Ih;(5)第二步陰離子交換層析加硅藻土過濾，濾液調整PH至5. 6，進行第二步陰離子交換層析，所用填料為Macrocap Q，線流速75cm/h，交換層析柱體積為樣品體積的1/40 ；(6)收集層析流穿液，用0. 5M鹽酸調整pH至3. 9-4. 2，再將溶液超濾濃縮至蛋白濃度20mg/ml。為過濾病毒將溶液通過孔徑為200-15nm的病毒過濾器過濾，如DV50，DV20， Planova75, PlanOVa35等。該步驟結束后，將溶液濃縮至最終制劑所需要的蛋白濃度，如 5%或10% (W/V)，濃縮后添加適當的添加劑整溶液的滲透壓值適合靜脈注射的要求，添加劑可以使用糖或者氨基酸，再次調整溶液PH至4. 0-4. 8，25°C孵放21天，再按照制劑所需要求分裝到輸液瓶中。3、產品檢驗(1)檢測方法按照中國藥典(2010版)規定方法分別檢測產品純度檢、產品單體+ 二聚體即分子大小分布、產品亞類分布等檢測指標。產品IgA含量檢測在Beckman IMMAGE血漿蛋白分析儀上進行，采用免疫比濁法， 選用Beckman IMMAGE IgA檢測試劑盒進行檢測，具體檢測方法參見該檢測試劑盒說明書。收率檢測方法制品經超濾濃縮后，通過凱氏定氮法(《中國藥典》2010版，附錄 VI B第一法)測定制品的蛋白濃度，收率=蛋白濃度*制品體積/血漿體積。(2)檢測結果檢測結果如表1所示表1本發明制備的免疫球蛋白制品與現有低溫乙醇法所得制品的質量指標對比
w匕士一本工藝試驗樣品(5%ΙΥΚ})Π““現有產品^
檢測指標 --- ，,
__20110309 20110312 20110414 (低溫乙醇法)
純度__99.9%99.3% 99.9%__-98%
單體+二聚體 99.9%99.9% 99.2%__-98%
IgA (mg/L)__\Z5__1A5__18J__-150
權利要求
1.一種制備人免疫球蛋白的方法，其特征在于它包括如下步驟(1)溶解將Cohn組分I+ II + ΙΠ或者Cohn組分II + III溶于注射用水中；(2)辛酸沉淀用辛酸或辛酸鹽沉淀雜質，過濾，得濾液；(3)第一步陰離子交換層析將步驟( 所得濾液調節PH至5.2，用陰離子交換層析純化，得流穿液；(4)沉淀IgM:用水將步驟(3)所得流穿液的電導率調節為500-1000US/cm，再調節pH 至6. 0-7. 3，靜置l-2h，過濾，得濾液；(5)第二步陰離子交換層析將步驟(4)所得濾液的pH調節至5.6，用陰離子交換層析純化，得流穿液；(6)經超濾或者透析，配制，病毒滅活，即得人免疫球蛋白成品。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(1)為取Cohn組分I+ II +III 或者Cohn組分II + III，加入注射用水中，2-8°C攪拌至其溶解，調節pH為3. 8-4. 9。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟( 為加入濃度為10mM-20mM 的辛酸或辛酸鹽，調節PH為5. 0-5.3。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)所述陰離子交換層析的填料為 Capto Q、Gigacap Q 或者 Unosphere Q0
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(4)所述pH為6.3 6. 74。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于步驟(4)所述為6.51 6. 7。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于步驟(4)所述pH為6.51或者6. 7。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(5)所述陰離子交換層析的填料為 Macrocap Q0
9.權利要求1-8任意一項所述方法制備的人免疫球蛋白。
10.一種藥物組合物，其特征在于它是以權利要求9所述的人免疫球蛋白為活性成分，加上藥學上可接受的輔料或者輔助性成分制備而成。
全文摘要
本發明提供了一種制備人免疫球蛋白的方法，包括Cohn組分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ或者Cohn組分Ⅱ+Ⅲ溶解、辛酸沉淀、第一步陰離子交換層析、沉淀IgM、第二步陰離子交換層析、超濾或者透析、配制、病毒滅活等步驟，制備得到了高純度人免疫球蛋白。還提供了該方法制備的人免疫球蛋白和一種藥物組合物。本發明制備方法簡單，成本低，工業應用前景良好。
文檔編號C07K1/30GK102532307SQ201210041098
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月22日 優先權日2012年2月22日
發明者蘭學淵, 呂家成, 李澤林, 楊匯川, 梁洪, 武鵬, 王焰 申請人:成都蓉生藥業有限責任公司