專利名稱：一種從黃霉素預混劑中提取、純化制備黃霉素a對照品的方法
技術領域：
本發明屬于獸藥對照品試劑制備領域，具體涉及一種黃霉素預混劑中提取、純化黃霉素A對照品的方法。
背景技術：
黃霉素為磷酸化多糖類抗生素，具有抗菌作用機理，是通過干擾細菌細胞壁的結構物質肽聚糖的生物合成從而抑制細菌的繁殖，黃霉素的促生長原理可能在他能提高飼料中能量和蛋白質的消化，能使腸壁變薄，從而提高營養物質的吸收，能有效地持續腸道菌群的平衡和瘤胃PH值的穩定。細菌對黃霉素不易產生耐藥性，黃霉素也不容易與其他抗生素產生交叉耐藥性。黃霉素主要包括黃霉素A、Bl、Ba和C等，其中黃霉素A為主要有效成分，占50%以上。黃霉素只用作飼料添加劑，不作為治療用藥，具有抗生素類添加劑的防病和促生長等作用。黃霉素抗菌譜較窄，主要對革蘭氏陽性菌有效，且對其他抗生素耐藥性的革蘭氏陽性菌也有效，但對革蘭氏陰性菌作用很弱。對牛，豬、雞、兔都有促生長、提高飼料轉化率的作用。 美國FDA規定肉雞每噸飼料添加I 2g，火雞為每噸I 2g，豬為每噸2 4g。日本每噸雞飼料添加O. 5 5g，腐乳豬為5 10g，仔豬為I 10g。現有黃霉素對照品為生物發酵法制備，黃霉素A純度不高，約50% 70%左右，含有黃霉素BI、Ba和C等副產物，不適用于黃霉素A殘留檢測使用。本發明從黃霉素預混劑中提取純化的黃霉素A對照品，純度高達93% 99%，雜質少，步驟簡便，成本低廉,主要應用于黃霉素殘留檢測領域。黃霉素A對照品的用途，即本發明的推廣應用前景持續使用抗生素所引起的畜產品抗生素殘留以及動物和人類出現耐藥性問題已經越來越為人們所重視。20世紀80年代以來，越來越多的國家立法禁止濫用抗生素。畜禽飼料中慎用抗生素原則和限制抗生素促進生長劑，必定是未來養殖業發展的趨勢。1997年聯合國糧農組織(FAO)要求停止或禁止抗生素飼料添加劑。1998年12月又提議在10年內淘汰抗生素飼料添加劑。目前，聯合國FAO，WTO組織及發達國家特別規定人用抗生素不得用于動物，對使用抗生素有極嚴格的要殘限制，甚至完全不準使用。歐盟已經決定從2006年I月起，禁止在飼料中使用莫能霉素 (monensin),鹽霉素(salinomycin),卑霉素(Avilamycin),黃霉素(Flavophospholipol) 等4種生長促進因子類抗生素，這意味著歐盟將會全面禁止在飼料中投放任何種類的抗生素。在日本肯定表制度中，黃霉素沒有規定畜禽肌肉及內臟殘留限量，按照“一律標準”原則，即沒有規定殘留限量的化合物一律按10μ g/kg限量來執行，黃霉素的殘留限量為10 μ g/kg。動物源性食品中抗生素殘留的檢出，已成為世界肉類貿易中重要的技術指標和技術壁壘之一。由于黃霉素在我國養殖業廣泛使用，歐盟、日本等國家對我國出口動物產品的藥物殘留限制提出了更嚴格的要求，必將對我國動物源性食品出口帶來了嚴重影響。為了突破抗生素殘留限制的技術壁壘，對畜禽產品中黃霉素殘留進行檢測和監控，制備高純度
4的黃霉素A對照品顯得非常必要。
發明內容
本發明的目的是提供一種從黃霉素預混劑中提取純化黃霉素A對照品的方法，利用該方法制備的黃霉素A純度達到93%以上。為了實現上述目的本發明采用如下技術方案一種從黃霉素預混劑中提取、純化制備黃霉素A對照品的方法，包括如下步驟
(I)提取
以每mL甲醇與O. 4g黃霉素預混劑的比例混合二者并加入離心試管中，將離心試管置于超聲提取器中，超聲提取30min,每IOmin振蕩一次，8000轉/min下離心3min,將上清液轉移至旋轉蒸發瓶中；在殘渣中加入甲醇按照上述步驟，重復提取2次；合并每次提取的上清液，40°C水浴旋轉蒸發濃縮至干，得到提取物。(2) SPE 純化
依次用4mL乙酸乙酯、4mL甲醇和4mL水活化C18固相萃取小柱，控制流速為I 2mL/ min ;將提取物用IOmL超純水溶解，并全部加于固相萃取小柱上，并擠干柱床上的水分，依次用4mL5%甲醇溶液、4mL正己烷與二氯甲烷的混合溶液、4mL乙酸乙酯和6mL乙酸乙酯與甲醇的混合溶液淋洗除雜；最后用6mL甲醇將黃霉素從固相萃取小柱中解析，將解析液于 40°C水浴旋轉蒸發濃縮至干，得到黃霉素純化產物；將純化產物轉移至稱量皿中，_75°C真空冷凍干燥5h，即得黃褐色黃霉素A粗產品。(3) HPLC 純化
稱取黃霉素A粗產品,用流動相溶解并稀釋成2 10mg/mL,過O. 45mm濾膜,按下列條件分離純化，收集洗脫液。分離純化條件
色譜柱Agela Technologies Venusil MP C18, 250 mm X 4· 6 mm, 5 mm;
柱溫30°C ;
流動相0. 2%甲酸銨乙腈，體積比為55:45 ；
流速1. OmL/min ；
進樣量50 mL ；
檢驗波長258nm。(4)濃縮、干燥
將收集的洗脫液減壓濃縮去除乙腈，得到濃縮液；控制流速I 2 mL/min，將濃縮液全部過C18固相萃取小柱；用IOmL超純水淋洗C18固相萃取小柱；用IOmL甲醇解析C18固相萃取小柱，直至解析液中沒有黃霉素A ;將收集解析液在40°C水浴下氮吹儀濃縮至干，轉移至稱量皿后真空冷凍干燥，即得淡黃色的黃霉素A對照品。(5)純度鑒定
稱取一定量的黃霉素A對照品，用水溶解，用紫外分光光度計測定258nm下的吸光度， 計算黃霉素A的純度。本發明通過溶劑提取、固相萃取柱凈化、高效液相色譜純化、冷凍干燥的方式，代替了舊的生物發酵方法，使純化效果提高，可靠、穩定。用本發明的方法制備的黃霉素A純度可達到93% 99%。本發明生產的黃霉素A對照品純度高，步驟簡便，成本低廉，適用于黃霉素A殘留檢測領域。
具體實施例方式下面結合實施例，對本發明做進一步的描述。以下實施例用于說明本發明，但不限制本發明的范圍。(I)提取
本實施例采用的是武漢同興生物科技有限公司生產的黃霉素預混劑，產品含量8%，規格為25千克/袋。稱取10 g黃霉素預混劑于50mL離心試管中，加入25mL甲醇,置于超聲提取器中，超聲提取30分鐘，每10分鐘振蕩一次；8000轉/min下離心3min，上清液轉移至 250mL旋轉蒸發瓶中，殘渣中再加入25mL甲醇重復提取2次；合并提取液(即上清液)，40°C 水浴旋轉蒸發濃縮至干。(2) SPE 純化
C18固相萃取小柱(500mg, 3mL)依次用4mL乙酸乙酯、4mL甲醇和4mL水活化,控制流速為I 2mL/min，將提取物用IOmL超純水溶解，并全部加于固相萃取柱上，并擠干柱床上的水分，依次用4mL 5%甲醇溶液、4mL正己烷二氯甲烷(體積比I: l)、4mL乙酸乙酯和6mL乙酸乙酯甲醇(體積比3:1)淋洗除雜，最后用3X2mL甲醇將黃霉素從固相萃取柱解析。將黃霉素解析液于40°C水浴旋轉蒸發濃縮至干，得到黃霉素純化產物。將純化產物小心轉移至稱量皿中，-75°C真空冷凍干燥5h，即得黃褐色黃霉素A粗產品。其中所用試劑甲醇，乙酸乙酯，正己烷和二氯甲烷都選用色譜純級別的試劑。(3) HPLC 純化
稱取適量黃霉素A粗產品，用流動相溶解并稀釋成約含量2 10mg/mL，過O. 45mm濾膜。按下列條件分離純化。為保證純度，從黃霉素A色譜峰達到檢測器20秒后開始收集洗脫液，完全通過檢測器后10秒結束收集。液相色譜分離條件
a)色譜柱AgelaTechnologies Venusil MP C18, 250 mm X 4· 6 mm, 5 mm,或相當者；
b)柱溫30°C ；
c)流動相0.2%甲酸銨(pH4. 9):乙腈(55 :45);乙腈試劑選用色譜純級別的；
d)流速1.O mL/min ；
e)進樣量50mL ；
f)檢測波長258nm。(4)濃縮、干燥
將收集的洗脫液減壓濃縮去除乙腈；控制流速在I 2 mL/min下，將濃縮液全部過C18 固相萃取柱；用IOmL超純水淋洗C18柱；用IOmL甲醇解析黃霉素A，直至解析液中沒有黃霉素A ;將收集解析液在40°C水浴下氮吹儀濃縮至干，小心轉移至稱量皿后真空冷凍干燥，即得淡黃色的黃霉素A對照品。(5)純度鑒定
稱取一定量的黃霉素A對照品，用水溶解并定容至10mL，用紫外分光光度計測定258nm下的吸光度，依據A258=21，357 Μ—1 cm—1計算溶液中黃霉素的物質的量濃度，按式(I)計算黃霉素A對照品的純度。
Ax JW xFX =-二…；ζ—■ .................—.^ IQ V··································· (I)
X 21357 xL X1000
式中
X——黃霉素A的純度，單位為％ ；
A——258 nm處的吸光度；
M——黃霉素A的物質的量1582，單位為克每摩爾(g/mol);
V-樣液最終定容體積，單位為毫升(mL)；
m——試樣質量，單位為克(g)；
L——比色皿的長度。本發明獲得的黃霉素A對照品性狀為淡黃色粉末，純度93%以上。
權利要求
1.一種從黃霉素預混劑中提取、純化制備黃霉素A對照品的方法，包括如下步驟(1)提取以每mL甲醇與O. 4g黃霉素預混劑的比例混合二者并加入離心試管中，將離心試管置于超聲提取器中，超聲提取30min,每IOmin振蕩一次，8000轉/min下離心3min,將上清液轉移至旋轉蒸發瓶中；在殘渣中加入甲醇按照上述步驟，重復提取2次；合并每次提取的上清液，40°C水浴旋轉蒸發濃縮至干，得到提取物；(2)SPE純化依次用4mL乙酸乙酯、4mL甲醇和4mL水活化C18固相萃取小柱，控制流速為I 2mL/ min ;將提取物用IOmL超純水溶解，并全部加于固相萃取小柱上，并擠干柱床上的水分，依次用4mL5%甲醇溶液、4mL正己烷與二氯甲烷的混合溶液、4mL乙酸乙酯和6mL乙酸乙酯與甲醇的混合溶液淋洗除雜；最后用6mL甲醇將黃霉素從固相萃取小柱中解析，將解析液于 40°C水浴旋轉蒸發濃縮至干，得到黃霉素純化產物；將純化產物轉移至稱量皿中，_75°C真空冷凍干燥5h，即得黃褐色黃霉素A粗產品；(3)HPLC 純化稱取黃霉素A粗產品,用流動相溶解并稀釋成2 10mg/mL,過O. 45mm濾膜,按下列條件分離純化，收集洗脫液；分離純化條件色譜柱Agela Technologies Venusil MP C18, 250 mm X 4· 6 mm, 5 mm;柱溫30°C ;流動相0. 2%甲酸銨乙腈，體積比為55:45 ；流速1. OmL/min ；進樣量50 mL ；檢驗波長258nm ；(4)濃縮、干燥將收集的洗脫液減壓濃縮去除乙腈，得到濃縮液；控制流速I 2 mL/min，將濃縮液全部過C18固相萃取小柱；用IOmL超純水淋洗C18固相萃取小柱；用IOmL甲醇解析C18固相萃取小柱，直至解析液中沒有黃霉素A ;將收集解析液在40°C水浴下氮吹儀濃縮至干，轉移至稱量皿后真空冷凍干燥，即得淡黃色的黃霉素A對照品；(5)純度鑒定稱取一定量的黃霉素A對照品，用水溶解，用紫外分光光度計測定258nm下的吸光度， 計算黃霉素A的純度。
2.根據權利要求I所述一種從黃霉素預混劑中提取、純化制備黃霉素A對照品的方法， 其特征是步驟(2)中所述正己烷與二氯甲烷的混合溶液中二者的體積比為1:1 ;所述乙酸乙酯與甲醇的混合溶液中二者的體積比為3:1。
3.根據權利要求I所述一種從黃霉素預混劑中提取、純化制備黃霉素A對照品的方法， 其特征是步驟(3)中收集洗脫液應在黃霉素A色譜峰達到檢測器20秒后開始，完全通過檢測器后10秒結束。
4.根據權利要求I所述一種從黃霉素預混劑中提取、純化制備黃霉素A對照品的方法，其特征是步驟(5)中黃霉素A的純度達到93% 99%。
全文摘要
本發明公開了一種從黃霉素預混劑中提取、純化制備黃霉素A對照品的方法。該方法包括黃霉素的提取、濃縮、純化、干燥和純度鑒定方法。根據本發明制備的黃霉素A純度達到93%以上。本發明提供的黃霉素A對照品制備方法具有步驟簡便，成本低廉和純度高的優點。
文檔編號C07H1/06GK102603817SQ20121002945
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月10日 優先權日2012年2月10日
發明者唐柏彬, 張雷, 李應國, 李賢良, 王國民, 郗存顯 申請人:重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心