專利名稱：腸道病毒71型cDNA感染性克隆、其構建方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及RNA病毒拯救技術，具體地說，涉及腸道病毒71型cDNA感染性克隆、 其構建方法及應用。
背景技術：
腸道病毒(Enterovirus) 71型(EV71)屬于小核糖核酸病毒科,腸道病毒屬。基因組為單股正鏈RNA。EV71主要感染5歲以下的兒童，通過糞-口途徑或飛沫進行傳播，其感染主要弓I起手足口病(HFMD)，在臨床上與柯薩奇病毒A16感染所引起的手足口病難以區別。嚴重的EV71感染還能引起無菌性腦炎、腦膜腦炎、腦干腦炎、脊髓灰質炎樣麻痹以及心肌炎和肺水腫等多種與神經系統相關的疾病，導致重癥甚至死亡病例的發生。EV71自1969 年首次由Schmidt等從加利福尼亞患有中樞神經系統疾病的嬰兒糞便標本中分離出來后， 已在世界范圍內引起十多次的爆發和流行。近年來，EV71的流行在亞太地區呈上升趨勢， 令人關注的是該地區的EV71感染引起越來越嚴重的中樞神經系統癥狀。2008年和2009年以EV71感染為主的手足口病在中國大陸多個省市流行，共導致479名兒童死亡。目前尚無治療EV71感染的特效藥物，主要通過對癥治療控制病情的發展。應用反向遺傳學技術構建RNA病毒的感染性克隆，比傳統的細胞傳代方法制備病毒的安全性高，并且可以避免病毒在傳代過程中引入的突變。此外通過基因工程的技術手段可以容易地實現對病毒基因組的改造，如定點突變、重組、缺失和嵌合等，為闡明病毒的致病機制，研發新的抗病毒藥物及獲得新的疫苗候選株奠定重要的基礎。Racaniello VR和Baltimore D于1981年首次利用反向遺傳學技術構建了脊髓灰質炎病毒的cDNA感染性克隆，提供了在DNA水平上研究RNA病毒的可能。2005年，Arita 等構建了 EV71標準株BrCr的一系列變異體的感染性克隆，研究了在猴子模型中，決定溫度敏感性的突變位點對病毒神經毒力的影響。近年來，中國大陸時有EV71的流行爆發，迫切需要構建出能夠代表我國EV71流行株特點的感染性克隆，為研究EV71的致病機理和抗病毒藥物提供技術支持。缺乏我國EV71流行株的感染性克隆以及EV71的快速變異，使得利用傳代病毒進行藥效評價的結果可靠性差，成為影響抗EV71藥物研發的主要技術瓶頸。因此構建我國EV71流行株的感染性克隆，將填補我國EV71標準株的空白，并為抗EV71病毒藥物的研發及EV71疫苗的研發奠定重要基礎。
發明內容
本發明的目的是提供腸道病毒71型流行株的cDNA感染性克隆、其構建方法及應用。為了實現本發明目的，本發明的一種腸道病毒71型cDNA感染性克隆，其是通過反向遺傳操作技術獲得的腸道病毒71型SZ98 pro株的cDNA感染性克隆。所述腸道病毒71 型SZ98 pro株是中國深圳98的實驗室傳代株(SZ98 pro)。前述的腸道病毒71型cDNA感染性克隆，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No. I所
3示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，將第215位Ρι·ο替換為His，或將第362位Glu替換為Gly，均不會影響其功能。前述的腸道病毒71型cDNA感染性克隆，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 2所示。本發明還提供一種構建上述腸道病毒71型cDNA感染性克隆的方法，其是以腸道病毒71型SZ98 pro株的基因組為模板，通過RT-PCR得到全長cDNA克隆。本發明還提供含有上述腸道病毒71型cDNA感染性克隆的載體。優選地，出發載體為 pBR322。本發明還提供含有上述載體的宿主細胞,其為大腸埃希氏菌(Escherichia coli) SZ98 pro/pBR322/DH5 α，已于2011年12月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏號為 CGMCC No. 5659。本發明還提供制備腸道病毒71型SZ98 pro株的拯救病毒的方法，首先對腸道病毒71型SZ98 pro株進行了全基因組測序，根據測序結果設計用于構建cDNA克隆的引物和酶切位點，通過引物在基因組cDNA的5’端引入T7啟動子，在其3’端引入polyA尾，然后以腸道病毒71型SZ98 pro株的基因組為模板，進行RT-PCR反應，得到全長cDNA克隆，酶切線性化后利用T7聚合酶系統進行體外轉錄，用體外轉錄出的RNA轉染vero細胞，獲得拯救病毒。本發明進一步提供上述腸道病毒71型cDNA感染性克隆在制備抗EV71病毒藥物及疫苗中的應用，并通過對感染性克隆進行基因工程改造，以更好地闡明病毒的致病機制， 研究抗病毒的策略。本發明構建的我國EV71流行株的感染性克隆，填補了我國EV71標準株的空白，為抗EV71病毒藥物的研發及EV71疫苗的研發奠定重要基礎。通過對感染性克隆的基因工程改造，可以更好地闡明病毒的致病機制，研究抗病毒的策略。
圖I為SZ98與SZ98 pro序列對比結果。圖2為通過比對24株EV71的結構蛋白VPl的基因序列繪制的系統進化樹。圖3為用脂質體轉染體外轉錄得到的EV71病毒基因組的RNA到vero細胞24h后， 觀察到的CPE結果。圖4為接種SZ98 pro株拯救病毒的vero細胞經裂解后,離心所得上清的western blotting.結果。圖5為用SZ98 pro株拯救病毒接種vero細胞后的病毒增殖曲線。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。實施例I腸道病毒71型SZ98 pro株的基因組測序與序列分析根據EV71基因組的保守序列設計了 9對通用引物對腸道病毒71型中國深圳98的實驗室傳代株，即SZ98 pro株進行基因組測序。使用DNAStar軟件對SZ98株與其實驗室傳代株的基因組序列包括5’ -NTR區、3’ -NTR區和蛋白編碼區的序列以及由其編碼的蛋白氨基酸序列進行分析和比對，SZ98與SZ98 pro序列對比結果如圖I所示。從GenBank提取 EV71其他株的基因組序列進彳丁對比。SZ98株與其實驗室傳代株的基因組序列一致為96%, 其中5’-UTR區的一致性為98%，3’-UTR區的一致性為93 %。兩者編碼的多聚蛋白氨基酸序列的一致性為97%。通過比對24株EV71的結構蛋白VPl的基因序列，應用MeGa3. I軟件繪制系統進化樹(圖2)。實施例2腸道病毒71型SZ98 pro株的全長cDNA克隆的構建根據測序結果和選擇的酶切位點設計了 2對引物，5’端上游引物Sal-T7_EV71+ 引入T7啟動子序列及Sal I酶切位點，3’端下游引物Hind-End-引入37個Poly(T)及 HindIII酶切位點。由Sangon公司合成。用Trizol提取病毒基因組RNA。用長片段逆轉錄酶 M-MLV Reverse Transcriptase (貨號M1705,購自 Promega 公司)以病毒基因組 RNA 為模板，以3’端下游引物Hind-End-為反轉錄引物，42°C反應2h反轉錄全長cDNA，然后用 DNA聚合酶PrimeSTAR(貨號DR010S，購自TaKaRa公司)分兩段進行基因組全長擴增。反應產物進行I %瓊脂糖電泳檢測。RT-PCR擴增產物經膠回收純化后，雙酶切依次連入PBR322 載體，用Sal I和HindIII酶切鑒定是否插入了目的片段，并對陽性克隆進行全長的基因組測序，排除克隆構建過程中突變的引入。腸道病毒71型SZ98 pro株的全長cDNA克隆， 其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，由其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。用構建好的含有腸道病毒71型SZ98 pro株全長cDNA克隆的pBR322載體轉化大腸埃希氏菌(Escherichia coli)DH5 α，得到 SZ98pro/pBR322/DH5 α，保藏號 CGMCC No.5659。實施例3體外轉錄與細胞轉染細胞培養待vero細胞(非洲綠猴腎細胞)生長為單層，用PBS清洗細胞面3次。 用O. 25%的胰酶消化細胞，待細胞變圓時終止消化，將胰酶吸出，立即加入含10% FBS的高糖DMEM培養基，用吸管輕輕吹打瓶底，使細胞完全脫離瓶底并分散為單細胞懸液。血球計數板計數后，用培養基將細胞濃度調整為2 X IO5個/ml，六孔板每孔接種2ml，置37 °C，5 % CO2孵箱培養。24h后(細胞豐度為80% )用于RNA轉染。體外轉錄與細胞轉染用HindIII對病毒cDNA克隆的3’端進行酶切，得到線性化的DNA模板,酹-氯仿抽提純化后用T7 RNA聚合酶體外轉錄試劑盒MEGA script High Yield Transcription Kit (貨號AM1334,購自 Ambion 公司)在體外轉錄出 RNA,用 Trizol 進行提取和純化。vero細胞培養于含10% FBS的DMEM培養基中，接種六孔板24h后，換成不含血清的DMEM培養基，用Lipofectamine 2000進行轉染，每孔轉染2 μ g RNA。轉染后每天觀察細胞，可見典型的CPE，部分細胞圓縮、脫落(圖3，A為病毒轉染后的細胞形態，B 為細胞對照)。待CPE達75%以上或觀察5d后，收獲細胞及培養液進行鑒定與傳代。實施例4RT-PCR鑒定拯救病毒的特異序列應用通用引物2F(1094) (5，-GCAGTGGATAAACCAACGC-3’)和 2R(2116) (5’-ATAGGCTATGAGCATCTTGC-3’)擴增病毒基因組第1094位至2116位核苷酸，通過測序分
析對病毒進行鑒定。實施例5免疫印跡(Western blotting)檢測當六孔板中vero細胞的CPE達到50%時，用Iml預冷的PBS收集細胞并加入細胞裂解液RIPA(購自Promega公司)，冰浴半小時裂解細胞，離心收集上清液，即為細胞與病毒的總蛋白樣品。進行SDS-PAGE電泳，轉膜，抗體孵育及ECL顯色。其中一抗為抗EV71鼠單克隆抗體(貨號ab36367,購自abeam公司)，二抗為辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠IgG(貨號SC2031，購自Santa Cruz公司)。免疫印跡結果(圖4)顯示有EV71的特異結構蛋白VPl和VP2兩條帶。條帶位置與EV71標準株BrCr-TR和BrCr-TS —致。實施例6微量滴定法測定病毒的滴度(TCID5tl)將vero細胞接種至96孔板，按IX IO4個/孔進行接種。2d后細胞長成致密單層。 取待滴定的EV71病毒液進行10倍梯度稀釋，即ICT1 10Λ傾掉96孔板中的生長液，用不含血清的DMEM培養基清洗2遍。每個稀釋度設4孔，每孔加100 μ I病毒稀釋液。另設病毒對照，每孔加病毒原液100 μ I ;細胞對照，每孔加DMEM培養基100 μ I。置37°C，5% CO2培養箱培養。每日觀察細胞的CPE變化并記錄結果，一般需要觀察5 7天。按Reed-Muench 法或Karber法計算結果得，收獲的SZ98 pro株拯救病毒液的滴度為7. 51gTCID5(l。實施例7繪制病毒增殖曲線待六孔板vero長至單層，用不含血清的DMEM培養基清洗細胞面2次，SZ98 pro 株拯救病毒按Μ. O. I = I接種細胞，37°C吸附30min，吸棄病毒接種液。然后六孔板每孔補加2ml含2% FBS的維持液，置37°C，5% CO2培養箱培養。在接種病毒后的0h、2h、4h、8h、 12h、24h、36h、48h和72h分別收集病毒培養上清和病毒感染的細胞至EP管中。將病毒液在常溫和_80°C反復凍融3次，使病毒顆粒充分釋放出來。4°C 3000rpm離心15min，去除細胞碎片，上清即為收獲的病毒液。用微量滴定法測定各個時間點收獲的病毒液的滴度，繪制病毒的增殖曲線(圖5)。實施例8利用感染性克隆獲得的拯救病毒篩選抗病毒藥物Vero細胞接種96孔板2d后長至單層，用不含血清的DMEM培養基清洗細胞面2 次。拯救病毒液用含2% FBS的維持液稀釋至100 μ 1，病毒稀釋液中病毒量為100TCID5Q。 將發酵液或待測化合物用維持液進行10倍梯度稀釋，然后進行抗EV71活性測定。每個樣品設有藥效孔和毒性孔。藥效孔加入loo μ I病毒稀釋液和loo μ I藥物稀釋液；毒性孔加 Λ 100 μ I藥物稀釋液和100 μ I維持液。另外設細胞對照孔(加入200 μ I維持液)和病毒對照孔(加入100 μ I病毒稀釋液和100 μ I維持液)。置37°C，5% CO2培養箱培養，每天觀察記錄細胞的病變效應(CPE)，分析藥物抗EV71的活性。培養3d后，細胞對照孔無CPE出現，病毒對照孔達100% CPE,以CPE低于50%且無藥物毒性的化合物為初篩陽性結果，通過后續的復篩進一步確定其抗EV71的活性。以利巴韋林和干擾素作為陽性藥物對照，結果表明濃度為10μ g/ml的利巴韋林和10μ g/ml的干擾素對拯救病毒增殖的抑制率均達75%以上。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
1.一種腸道病毒71型CDNA感染性克隆，其是通過反向遺傳操作獲得的腸道病毒71型 SZ98 pro株的cDNA感染性克隆。
2.根據權利要求I所述的腸道病毒71型cDNA感染性克隆，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
3.根據權利要求2所述的腸道病毒71型cDNA感染性克隆，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID No. 2 所示。
4.一種構建權利要求1-3任一項所述腸道病毒71型cDNA感染性克隆的方法，其是以腸道病毒71型SZ98 pro株的基因組為模板，通過RT-PCR得到全長cDNA克隆。
5.含有權利要求1-3任一項所述腸道病毒71型cDNA感染性克隆的載體。
6.根據權利要求5所述的載體，其特征在于，出發載體為PBR322。
7.含有權利要求6所述載體的宿主細胞。
8.根據權利要求7所述的宿主細胞，其為SZ98pro/pBR322/DH5a，保藏號CGMCC No.5659。
9.制備腸道病毒71型SZ98pro株的拯救病毒的方法，其特征在于，首先對腸道病毒 71型SZ98 pro株進行了全基因組測序，根據測序結果設計用于構建cDNA克隆的引物和酶切位點，通過引物在基因組cDNA的5’端引入T7啟動子，在其3’端引入polyA尾，然后以腸道病毒71型SZ98 pro株的基因組為模板，進行RT-PCR反應，得到全長cDNA克隆，酶切線性化后進行體外轉錄，用體外轉錄出的RNA轉染vero細胞，獲得拯救病毒。
10.權利要求1-3任一項所述腸道病毒71型cDNA感染性克隆在制備抗EV71病毒藥物及疫苗中的應用。全文摘要
本發明提供了一種腸道病毒71型cDNA感染性克隆、其構建方法及應用，其是通過反向遺傳操作技術構建的我國EV71流行株的感染性克隆，填補了我國EV71標準株的空白，為抗EV71病毒藥物的研發及EV71疫苗的研發奠定重要基礎。通過對感染性克隆的基因工程改造，可以更好地闡明病毒的致病機制，研究抗病毒的策略。
文檔編號C07K14/085GK102604969SQ20121002890
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月9日 優先權日2012年2月9日
發明者岑山, 張永欣, 金奇 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所