專利名稱：一種胸腺素α1及其類似物的制備方法
技術領域：
本發明屬于多肽固相合成及純化技術領域,具體而言,涉及到Tricyclic amidelinker resin樹脂和C端為Asn的多肽，尤其是胸腺素α I及其類似物的固相合成工藝。
背景技術：
胸腺素a I (Thymosin alphal，T α I)是從胸腺素組分5 (TF5)中分離純化出的，由28個氨基酸殘基組成的酸性多肽，不含蛋氨酸、半胱氨酸和芳香族氨基酸，相對分子質量為3108，pi值為4.2，N末端乙酰化但其對活性影響不顯著，其序列為Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-1Ie-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH
胸腺素α I是由胸腺分泌的免疫功能較強的小分子多肽，在體內外試驗中，胸腺素α I對細胞因子的分泌、淋巴細胞表面標志及淋巴細胞功能均有影響，在機體免疫應答過程中起著重要的作用，被認為是生物反應調節物，臨床上亦已廣泛應用于乙型肝炎、丙型肝炎、腫瘤以及免疫功能低下等疾病的治療。采用化學方法合成的N-乙酰化胸腺素α I已經上市，是1997年由意大利賽生(Sciclone)公司開發的，商品名為“日達仙”，用于治療病毒性肝炎等，療效顯著。在固相合成法中，2008年I月16日公布的中國專利(CN101104638A)公開了一種固相合成胸腺素α I的工藝，它以Fmoc-Rink Amide MBHA樹脂為載體，利用Asp側鏈羧基與樹脂氨基相連接從而使切割后形成Asn的方法；2008年4月23日公布的中國專利(CN101166761A)公開了以PEG樹脂固相合成胸腺素及其類似物的方法；2009年7月5日，BCN肽類股份有限公司的專利申請CN101484467A公開了以假脯氨酸二肽的形式固相合成的胸腺素；在“化學學報”2004年第55卷第2期胸腺素α I的DIC固相化學合成與鑒定’中提到，以Wang樹脂為起始載體，通過活化試劑DIC+HOBt將Fmoc-Asn (Trt) -OH與樹脂相連接。除了化學合成法，還可以采用生物合成技術，在2010年6月16號公布的中國發明專利(CN101736008A)公開了一種基因工程制備N-乙酰化胸腺素α I的方法。綜合參考國內外關于胸腺素α I制備專利以及相關的合成報道文獻，發現其在技術上主要存在固相合成收率低，純度低等缺點，從而不能用于工業化生產。
發明內容
本發明的目的在于提供一種具有高收率且有利于實現產業化的胸腺素α I及類似物的制備工藝。為實現上述目的，本發明采取如下技術方案:一種制備胸腺素α I及類似物的固相合成及純化方法，包括如下步驟:I)以Tricyclic amide linker resin樹脂為載體,將該樹脂脫去Fmoc保護基；2)用偶聯劑將Fmoc-Asp-Y的側鏈羧基與上述脫保護的Tricyclic amide linkerresin樹脂的氨基連接,并用乙酰化試劑優選Ac2O和DIPEA進行封閉處理,其中Fmoc-Asp-Y中的Y為羧基保護基；3)將步驟2)中所得產物脫Fmoc保護后，加入Fmoc-AA-Y形式的氨基酸和偶聯劑進行反應，其中Fmoc-AA-Y中的AA為氨基酸；4)根據目標合成序列重復進行步驟3)以依次偶聯氨基酸；5)將步驟4)中所得產物用乙酰化試劑優選Ac2O和DIPEA進行乙酰化處理；6)將步驟5)中所得產物用裂解試劑進行切割得到粗肽；7)用沉淀劑優選乙醚沉淀步驟6)中所得粗肽；8)用HPLC制備分離粗肽得到純品。在一個實施方案中，步驟I)中所述Fmoc保護基是通過20%哌啶/80% DMF或者2%哌啶/2% DBU/96% DMF處理來除去。在另一個實施方案中，步驟2)中所述羧基保護基Y為OtBu、ODmab或者OAlI。在另一個實施方案中，步驟2)中所述的偶聯劑為DIC+A或B+A+有機堿，其中A為HOBt,HOAt 或者 Cl-HOBt ；B 為 HBTU、HATU、HCTU 或者 PyBOP ;有機堿為 NMM、DIPEA 或者 TMP。步驟2)中乙酰化過程為以10 % Ac2O和10 % DIPEA的DMF溶液在室溫下反應。在另一個實施方案中，步驟3)中所述Fmoc-AA-Y形式的氨基酸衍生物選自 Fmoc-Asp-Y,其中 Y 為 OtBu、ODmab 或者 OAll ;Fmoc_Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H> Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr (tBu) -0H> Fmoc-1le-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH和 Fmoc-Asp(OtBu)-OH。
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在另一個實施方案中，步驟6)中裂解試劑以TFA為主要組分并含有適合的捕獲齊 ，裂解切割在室溫下反應，用乙醚沉淀粗肽。優選地，所述捕獲劑選自水，三甲基硅烷和1，2-乙_■硫醇。在另一個實施方案中，所述偶聯和脫保護過程中每一步都經過Kaiser Test檢測。在另一個實施方案中，其中所述HPLC為制備型RP-HPLC。與已有的胸腺素α I合成方法相比，本發明胸腺素α I的制備工藝具有以下優
占-
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1.米用了 Ramage，Tricyclic amide linker 類型樹脂,(Lit.R.Ramage et al.,Tetrahedron Lett.34,6599,1993)，附圖1 為 Ramage，Tricyclic amide linker 結構以及幾種此類型的樹脂。該樹脂的linker中含有二苯并環庚烯結構，非常適合用于以Fmoc策略(E.ATHERTON,R.C.SHEPPARD,Sold Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach.1RL Press, Oxford, 1989)制備酰胺肽末端，尤其是C末端為Phe，Tyr和lie時。切割時采用50% TFA的二氯甲烷或95% TFA均可，適當加入捕獲劑。實驗證明，利用此類樹脂為載體的固相合成工藝，可以有效減少固相合成工藝過程中偶聯的困難度，同時增加粗肽收率及純度。2.采取了側鏈錨定策略，以Fmoc-Asp-Y為C末端氨基酸代替Asn末端氨基酸，利用Asp側鏈羧基與氨基功能樹脂相連有很多優點:(I)把第一個氨基酸通過形成酰胺鍵的方式連接到樹脂上有很高的收率，同時使用的激活劑也可以和以后形成肽鍵所用的試劑相同。此外，把Asn衍生物連接到Wang樹脂上存在著收率低，消旋風險高，如果側鏈不保護還有形成β -氰基丙氨酸的可能；(2)側鏈錨定策略只涉及到t-Bu等類型的保護基(t-Bu酯可以保護第一個殘基的α -羧基，Asp和Asn的ω -羧基以及Ser和Thr的側鏈羥基)，這樣最后的切割時僅使用簡單的捕獲劑如H2O即可。然而,如果使用Asn衍生物如Trt、Xan或Tmob等就需要額外的捕獲劑；(3)在肽主鏈中少了一個酰胺鍵，從而減少了氫鍵的形成以及分子內肽鏈聚集的可能；(4)可以改變肽鏈在樹脂上的空間位置，使肽鏈更具靈活性，從而有利于后面的氨基酸順利連接。本發明采用Asp的側鏈羧基與Tricyclic amide linker resin樹脂相連可以使收率大幅度的提高，降低了生產成本，有利于實現規模化、產業化生產。
圖1為Ramage’ Tricyclic amide linker結構以及幾種此類型的樹脂。圖2是本發明總的工藝流程圖。圖3為胸腺素α I粗肽、純品HPLC圖譜，以及質譜圖。圖4為利用Rink amide MBHA resin合成的胸腺素α I粗肽及純品圖譜，以及質譜圖。圖5為胸腺素α I類似物粗肽、純品HPLC圖譜，以及質譜圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步詳細說明:說明書和權利要求書中所使用的縮寫的含義列如表I所示: 表I縮略詞表
權利要求
1.一種胸腺素α I及其類似物的固相合成及純化方法，包括以下步驟: 1)以Tricyclicamide linker resin樹脂為載體,將該樹脂脫去Fmoc保護基； 2)用偶聯劑將Fmoc-Asp-Y的側鏈羧基與上述脫保護的Tricyclicamide linkerresin樹脂的氨基連接,并用乙酰化試劑優選Ac2O和DIPEA進行封閉處理,其中Fmoc-Asp-Y中的Y為羧基保護基； 3)將步驟2)中所得產物脫Fmoc保護后，加入Fmoc-AA-Y形式的氨基酸和偶聯劑進行反應,其中Fmoc-AA-Y中的AA為氨基酸； 4)根據目標合成序列重復進行步驟3)以依次偶聯氨基酸； 5)將步驟4)中所得產物用乙酰化試劑優選Ac2O和DIPEA進行乙酰化處理； 6)將步驟5)中所得產物用裂解試劑進行切割得到粗肽； 7)用沉淀劑優選乙醚沉淀步驟6)中所得粗肽； 8)用HPLC制備分離粗肽得到純品。
2.權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟I)中所述Fmoc保護基是通過20%哌啶/80% DMF或者2%哌啶11% DBU/96% DMF處理來除去。
3.權利要求1所述的方法，其中步驟2)中所述羧基保護基Y為OtBiuODmab或者OAlI。
4.權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟2)中所述的偶聯劑為DIC+A或B+A+有機堿，其中 A 為 H0Bt、H0At 或者 Cl-HOBt ；B 為 HBTU、HATU、HCTU 或者 PyBOP ;有機堿為 NMM、DIPEA 或者 TMP。
5.權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟2)中乙酰化過程為以10%Ac2O和10%DIPEA的DMF溶液在室溫下反應。
6.權利要求1所 述的方法，其特征在于:步驟3)中所述Fmoc-AA-Y形式的氨基酸衍生物選自 Fmoc-Asp-Y,其中 Y 為 OtBu、ODmab 或者 OAll ;Fmoc_Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys (Boc) -0H> Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr (tBu)-OH、Fmoc-1le-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH和 Fmoc-Asp(OtBu)-OH。
7.權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟6)裂解試劑以TFA為主要組分并含有適合的捕獲劑，裂解切割在室溫下反應，用乙醚沉淀粗肽。
8.權利要求7所述的方法，其中所述捕獲劑選自水，三甲基硅烷和1，2_乙二硫醇。
9.權利要求1所述的方法，其特征在于:所述偶聯和脫保護過程中每一步都經過Kaiser Test 檢測。
10.權利要求1所述的方法，其中所述HPLC為制備型RP-HPLC。
全文摘要
本發明公開一種胸腺素α1及其類似物的固相合成及純化工藝，適用于工業化生產，屬于多肽合成技術領域。工藝包括以下幾個步驟1)以Tricyclic amide linker resin樹脂為載體；2)將該樹脂脫Fmoc保護后，將Fmoc-Asp-Y的側鏈羧基與樹脂氨基連接；3)采用Fmoc策略依次固相合成剩余氨基酸；4)去掉N末端氨基酸Fmoc保護基后用Ac2O，DIPEA的DMF溶液乙酰化N末端氨基；5)采用裂解試劑切割得到粗肽并用乙醚沉淀粗肽；6)粗肽經HPLC制備分離得到純品。
文檔編號C07K14/575GK103242443SQ20121002536
公開日2013年8月14日 申請日期2012年2月6日 優先權日2012年2月6日
發明者王麗鳳, 殷玉和, 李紀龍, 代麗萍 申請人:長春百克生物科技股份公司