專利名稱：自組裝多肽及其在促進腫瘤細胞形成多細胞球體中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種可自組裝形成水凝膠的多肽及其在促進腫瘤細胞形成多細胞球體中的應用。
背景技術：
多肽具有獨特的生物學活性。1999年，美國國家衛生研究院(NationalInstitutes of Health, NIH)公布了兩種人類免疫缺陷病毒(HIV-I)多肽疫苗對人體進行的I期臨床試驗結果，證實這兩種多肽疫苗能刺激機體產生特異性抗體和特異性免疫細胞，并有較好的安全性。清華大學也證實HIV-I膜蛋白內一段多肽具有很強的免疫原性。丙肝病毒多肽疫苗也顯示有良好的發展前景，國外學者從丙肝病毒(HCV)外膜蛋白E2內篩選出一段多肽，它可刺激機體產生保護性抗體。總所周知，病毒通過與宿主細胞上的特異受體結合吸附細胞，依賴其自身的特異蛋白酶進行蛋白加工及核酸復制。因此，如果從肽庫內篩選能與宿主細胞受體結合的多肽或能與病毒蛋白酶等活性位點結合的多肽，那么這些多肽就可用于抗病毒的治療。此外，多肽還能夠模擬細胞因子，具有細胞因子活性的多肽可開發成新型藥物。綜上所述，多肽存在獨特的生物學活性，具有多方面的用途，因此，近些年來，生命科學與材料科學領域對多肽的研究也越來越多。其中，自組裝多肽納米纖維材料
(self-assembling peptide nanofiber scaffold, SAPNS)更是因其具有良好的材料-
細胞界面相容性和生物學活性越來越受關注。在生命科學研究領域，對于細胞的體外培養，關注的不僅僅是細胞的分裂生長，更為重要的是它們經過傳代后能否維持體內生長時的性狀。在很多情況下，常規單層細胞培養技術(二維細胞培養，Two-dimensional，2D)所取得的研究成果和體內的情況并不符合。細胞在體外二維環境下增殖，細胞的基因表達、信號傳導和形態學特征都與體內的有異，細胞會逐漸喪失原有的性狀，導致科研人員無法獲得可靠的實驗數據。體外細胞培養的一個重要原則是模擬細胞體內生長的環境，該環境不僅能讓細胞生長傳代，還能最大程度地維持細胞在體內生長時的性狀，并分化產生新的組織結構，以便全面研究發育過程。人體組織為三維(Three-dimensional，3D)結構，但是目前科學界對人體組織結構、功能、病理等方面進行研究時卻往往依賴體外的2D細胞培養或動物模型。由于體外2D細胞培養所創造的細胞培養環境與細胞體內生長環境有很大不同，如細胞與細胞、細胞與基質的相互作用等，因此利用體外2D細胞培養不足以反映細胞真實的生長狀況。動物模型由于與人體存在種屬差異，同樣不能真實地反映體內細胞生長特征。在此情況下，三維細胞培養技術應運而生。三維細胞培養技術(three dismensional cell culture, TDCC)是將具有三維結構的載體與各種不同種類的細胞在體外共同培養，使細胞能夠在載體的三維立體空間結構中遷移、生長，構成三維的“細胞——載體復合物”體系。目前，國內市場銷售的三維細胞培養材料雖然在一定程度上提高了細胞培養效果，但由于其中多數產品是采用非生物降解材料或化學材料制成，其降解產物和殘留有機溶劑往往對細胞有一定的毒副作用，常引起細胞無菌性炎癥，影響實驗結果和數據的可靠性；部分產品雖然是采用生物可降解材料制成，但一些生物材料含有大量未鑒定成分，這為臨床研究帶來巨大風險；此外，一部分生物材料制成的三維細胞培養產品具有保質期短，不易保存和應用的特點。
發明內容
為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種可自組裝形成水凝膠的多肽。本發明的另一目的在于提供上述自組裝多肽在促進腫瘤細胞形成多細胞球體中的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現一種自組裝多肽，包含一段由3-20個連續的疏水氨基酸組成的氨基酸片段，在該氨基酸片段的N末端或C末端或同時在N末端和C末端連接特定多肽；所述特定多肽的序列為GYRGDS (SEQ ID NO. 1)、GYRGDSPRGDS (SEQ ID NO. 2)、YRGDS (SEQ ID NO. 3)、PFSSTKT (SEQ ID NO. 4)、SKPPGTSS (SEQ ID NO. 5)、YRGDSPRGDS (SEQID NO. 6)或 PRGDS (SEQ ID NO. 7)；所述的疏水氨基酸為丙氨酸(單字母縮寫A)、纈氨酸(V)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、酪氨酸(Y)或甘氨酸(G)；所述的氨基酸片段優選MAMA(SEQ ID NO. 8)、WVWV (SEQ ID NO. 9)、IIIIII (SEQID NO. 10)、LLLLLL (SEQ ID NO. 11)、FFFFFF (SEQ ID NO. 12)、PPGPPGPPG (SEQ ID NO. 13)、FYGFYGFYG(SEQ ID NO. 14)或 AVILF (SEQ ID NO. 15)；優選地，所述多肽的N末端進行乙酰化處理(ac-處理)，或者對N末端進行乙酰化處理的同時對其C末端酰胺化處理，即-CONH2 ；所述的自組裝多肽優選VVVVVV-GYRGDSPRGDS (SEQ ID N0. 16)、FFFFFF-GYRGDSPRGDS(SEQ ID Ν0· 17)、PPGPPGPPG-YRGDSPRGDS(SEQ ID NO. 18)或FYGFYGFYG-YRGDSPRGDS(SEQ ID NO. 1 。上述多肽的序列是人工設計的，按照現行通用的生物化學方法合成。上述的多肽可以促進腫瘤細胞形成多細胞球體。往上述多肽加入溶劑溶解(多肽的質量體積濃度可以小于)，形成無色透明的多肽納米纖維水凝膠溶液(含水量在99%以上)，在一定鹽離子濃度下可自發組裝成納米纖維，并進一步發生交聯，形成多孔網狀結構的水凝膠(見圖1)，該水凝膠可作為多種人類細胞，尤其是腫瘤細胞的三維空間組織培養支架。將腫瘤細胞放入上述的多肽納米纖維水凝膠中培養，腫瘤細胞能形成多細胞球體，從而更真實地模擬腫瘤在體內的生長情況，最終目的是使抗腫瘤藥物的體外藥理藥效試驗能更準確地反應其在體內的作用。本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果1、本發明的多肽形成水凝膠后能使培養的腫瘤細胞在膠內遷移并形成多細胞球體，模擬體內腫瘤組織因缺乏氧和營養造成的組織中心壞死及與胞外基質的相互作用，從而更真實地反映腫瘤在體內的生長情況，為有關腫瘤的各種基礎或臨床研究提供可靠的實驗材料。2、本發明的自組裝多肽在水相離子環境或生理鹽溶液中觸發形成三維支架材料凝膠，這種凝膠具有以下優點①黏彈性好；②易于運輸，可通過注射技術運送至靶位點；③降解性好，生物利用度高，降解產物為氨基酸單體，可作為生物體營養物質的來源；④對細胞或組織無毒副反應及免疫反應；⑤具有良好的表面活性、結構相容性及生物相容性。
圖1是本發明實施例1的自組裝多肽所形成的水凝膠外觀形態圖。圖2是腫瘤細胞在實施例1的水凝膠中所形成的多細胞球體外觀形態圖；其中，A-乳腺癌細胞SK-BR-3在水凝膠中形成多細胞球體，B-轉染GFP基因的293細胞在水凝膠中形成多細胞球體(熒光下拍攝)，C-腦神經瘤細胞Neuro-加在水凝膠中形成多細胞球體。圖3是腫瘤細胞在實施例2的水凝膠中所形成的多細胞球體外觀形態圖；其中，A-乳腺癌細胞SK-BR-3在水凝膠中形成多細胞球體，B-轉染GFP基因的293細胞在水凝膠中形成多細胞球體(熒光下拍攝)，C-腦神經瘤細胞Neuro-加在水凝膠中形成多細胞球體。圖4是腫瘤細胞在實施例3的水凝膠中所形成的多細胞球體外觀形態圖；其中，A-乳腺癌細胞SK-BR-3在水凝膠中形成的多細胞球體，B-在水凝膠中形成的多細胞球體(熒光下拍攝)，C-腦神經瘤Neuro-加在水凝膠中形成的多細胞球體。圖5是腫瘤細胞在實施例4的水凝膠中所形成的多細胞球體外觀形態圖；其中，A-乳腺癌細胞SK-BR-3在水凝膠中形成的多細胞球體，B轉染GFP基因的293細胞在水凝膠中形成的多細胞球體(熒光下拍攝)，C-腦神經瘤Neuro-加在水凝膠中形成的多細胞球體。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。實施例1應用本發明的自組裝多肽促進腫瘤細胞形成多細胞球體的方法，包括以下步驟(1)按照文獻(胡春玲，唐尹萍，施婧妮等.鱉甲抗肝纖維化活性多肽的固相合成·醫藥導報.2011,30(5) :561-562)方法合成多肽VVVVVV-GYRGDSPRGDS(SEQ ID NO. 16)。(2)將步驟(1)的多肽凍干粉末用去離子水溶解(多肽濃度)，多肽隨即形成水凝膠溶液，再用22um的濾膜過濾除菌。(3)將多肽水凝膠溶液超聲30分鐘，如果有氣泡產生，可離心lOOOrpm，5min,將氣泡去除。(4)腫瘤細胞(轉染GFP(綠色熒光蛋白)基因的293細胞(購自美國CellBiolabs Inc.公司，下同)、乳腺癌細胞SK-BR-3 (購自上海研晶生物科技有限公司，下同)和腦神經瘤細胞Neuro-加(購自上海拜力生物科技有限公司，下同))，離心去除培養基，用10%無菌蔗糖溶液洗滌細胞，然后離心，去除上清，再加入10%無菌蔗糖溶液配制成細胞懸
5液(細胞密度為1 X IO6CelWml)。(5)用10%無菌蔗糖溶液將多肽水凝膠溶液稀釋到0. 5%濃度。(6)將細胞懸液與稀釋好的多肽水凝膠溶液快速混勻后，加入培養板孔中，然后沿著培養板孔壁緩慢加入培養基(RPMI Medium 1640培養基，購買于hvitrogen公司)。(7)在培養箱中靜置30min后，用槍頭慢慢吸走培養基，再重新補加新鮮的培養基，放回培養箱。(8)再靜置30min，然后重復步驟(7)的操作。(9)最后置于37°C，5% CO2培養箱中，靜置培養。隔日檢查細胞生長情況與培養基顏色，及時換液。培養一周后，腫瘤細胞在水凝膠中培養逐漸形成多細胞球體(見圖2，圖2采用LEICA DMI 3000B倒置顯微鏡拍攝)，該多細胞球體可以模擬腫瘤細胞在體內生長的三維環
^Ml O實施例2應用本發明的自組裝多肽促進腫瘤細胞形成多細胞球體的方法，包括以下步驟(1)按照文獻(胡春玲，唐尹萍，施婧妮等.鱉甲抗肝纖維化活性多肽的固相合成·醫藥導報.2011,30(5) :561-562)方法合成多肽FFFFFF-GYRGDSPRGDS(SEQ ID NO. 17)。(2)將步驟(1)的多肽凍干粉末用去離子水溶解(多肽濃度)，多肽隨即形成水凝膠溶液，再用22um的濾膜過濾除菌。(3)將多肽水凝膠溶液超聲30分鐘，如果有氣泡產生，可離心lOOOrpm，5min,將氣泡去除。(4)腫瘤細胞(轉染GFP基因的293細胞、乳腺癌細胞SK-BR-3和腦神經瘤細胞Neuro-2a)，離心去除培養基，用10 %無菌蔗糖溶液洗滌細胞，然后離心，去除上清，再加入10%無菌蔗糖溶液配制成細胞懸液(細胞密度為lX106cellS/ml)。(5)用10%無菌蔗糖溶液將多肽水凝膠溶液稀釋到0. 5%濃度。(6)將細胞懸液與稀釋好的多肽水凝膠溶液快速混勻后，加入培養板孔中，然后沿著培養板孔壁緩慢加入培養基(RPMI Medium 1640培養基，購買于hvitrogen公司)。(7)在培養箱中靜置30min后，用槍頭慢慢吸走培養基，再重新補加新鮮的培養基，放回培養箱。(8)再靜置30min，然后重復步驟(7)的操作。(9)最后置于37°C，5% CO2培養箱中，靜置培養。隔日檢查細胞生長情況與培養基顏色，及時換液。培養一周后，腫瘤細胞在水凝膠中培養逐漸形成多細胞球體(見圖3，圖3采用LEICA DMI 3000B倒置顯微鏡拍攝)，該多細胞球體可以模擬腫瘤細胞在體內生長的三維環
^Ml O實施例3應用本發明的自組裝多肽促進腫瘤細胞形成多細胞球體的方法，包括以下步驟(1)按照文獻(胡春玲，唐尹萍，施婧妮等.鱉甲抗肝纖維化活性多肽的固相合成·醫藥導報.2011,30(5) :561-562)的方法合成多肽 PPGPPGPPG-YRGDSPRGDS(SEQ IDN0. 18)。
(2)將步驟(1)的多肽凍干粉末用去離子水溶解(多肽濃度)，多肽隨即形成水凝膠溶液，再用22um的濾膜過濾除菌。(3)多肽水凝膠溶液使用前超聲30分鐘，如果有氣泡產生，可離心lOOOrpm，5min,
將氣泡去除。(4)用10%無菌蔗糖溶液將多肽水凝膠溶液稀釋到0. 5%濃度。(5)將多肽水凝膠溶液加入培養板孔中(這個過程不要產生氣泡)，然后沿著培養板孔壁緩慢加入培養基(RPMI Medium 1640培養基，購買于hvitrogen公司)。(6)將步驟(5)的培養板在培養箱中靜置30min后，用槍頭慢慢吸走培養基，再重新補加新鮮的培養基，放回培養箱。(7)再靜置 30min，重復 step (6)步驟。(8)將腫瘤細胞(轉染GFP基因的293細胞、乳腺癌細胞SK-BR-3和腦神經瘤細胞Neuro-2a)消化后用培養基(RPMI Medium 1640，購買于hvitrogen公司)調整為適合的濃度(5X 104cellS/cm2)，取200-300ul細胞懸液沿孔壁緩慢加入膠體上。(9)最后置于37°C，5% CO2培養箱中，靜置培養。隔日檢查細胞生長情況與培養基顏色，及時換液。培養10天后，腫瘤細胞逐漸遷移進水凝膠并形成多細胞球體(見圖4，圖4A、4C采用LEICADMI 3000B倒置顯微鏡拍攝，圖4B采用Olympus 1X71倒置顯微鏡拍攝)，該多細胞球體可以模擬腫瘤細胞在體內生長的三維環境。實施例4應用本發明的自組裝多肽促進腫瘤細胞形成多細胞球體的方法，包括以下步驟(1)按照文獻(胡春玲，唐尹萍，施婧妮等.鱉甲抗肝纖維化活性多肽的固相合成·醫藥導報.2011,30(5) :561-562)的方法合成多肽 FYGFYGFYG-YRGDSPRGDS(SEQ IDN0. 19)。(2)將步驟(1)的多肽凍干粉末用去離子水溶解(多肽濃度)，多肽隨即形成水凝膠溶液，再用22um的濾膜過濾除菌。(3)多肽水凝膠溶液使用前超聲30分鐘，如果有氣泡產生，可離心lOOOrpm，5min,
將氣泡去除。(4)用10%無菌蔗糖溶液將多肽水凝膠溶液稀釋到0. 5%濃度。(5)將多肽水凝膠溶液加入培養板孔中(這個過程不要產生氣泡)，然后沿著培養板孔壁緩慢加入培養基(RPMI Medium 1640培養基，購買于hvitrogen公司)。(6)將步驟(5)的培養板在培養箱中靜置30min后，用槍頭慢慢吸走培養基，再重新補加新鮮的培養基，放回培養箱。(7)再靜置 30min，重復 step (6)步驟。(8)將腫瘤細胞(轉染GFP基因的293細胞、乳腺癌細胞SK-BR-3和腦神經瘤細胞Neuro-2a)消化后用培養基(RPMI Medium 1640，購買于hvitrogen公司)調整為適合的濃度(5X 104cellS/cm2)，取200-300ul細胞懸液沿孔壁緩慢加入膠體上。(9)最后置于37°C，5% CO2培養箱中，靜置培養。隔日檢查細胞生長情況與培養基顏色，及時換液。培養10天后，腫瘤細胞逐漸遷移進水凝膠并形成多細胞球體(見圖5，圖5A、5C采用LEICADMI 3000B倒置顯微鏡拍攝，圖5B采用Olympus 1X71倒置顯微鏡拍攝)，該多細胞球體可以模擬腫瘤細胞在體內生長的三維環境。 上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種自組裝多肽，其特征在于包含一段由3-20個連續的疏水氨基酸組成的氨基酸片段，在該氨基酸片段的N末端或C末端或同時在N末端和C末端連接特定多肽；所述特定多肽的序列為 GYRGDS、GYRGDSPRGDS、YRGDS、PFSSTKT、SKPPGTSS、YRGDSPRGDS或PRGDS。
2.根據權利要求1所述的自組裝多肽，其特征在于所述的疏水氨基酸為丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸或甘氨酸。
3.根據權利要求1所述的自組裝多肽，其特征在于所述的氨基酸片段為AAAAAA、VVVVVV, IIIIII、LLLLLL、FFFFFF, PPGPPGPPG、FYGFYGFYG 或 AVILF。
4.根據權利要求1所述的自組裝多肽，其特征在于所述自組裝多肽的N末端進行乙酰化處理；或者，對N末端進行乙酰化處理的同時對其C末端酰胺化。
5.根據權利要求1所述的自組裝多肽，其特征在于所述的自組裝多肽為 VVVVVV-GYRGDSPRGDS, FFFFFF-GYRGDSPRGDS, PPGPPGPPG-YRGDSPRGDS 或FYGFYGFYG-YRGDSPRGDS。
6.權利要求1-5任一項所述的自組裝多肽在促進腫瘤細胞形成多細胞球體中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種自組裝多肽及其在促進腫瘤細胞形成多細胞球體中的應用。本發明的自組裝多肽包含一段由3-20個連續的疏水氨基酸組成的氨基酸片段，在該氨基酸片段的N末端或C末端或同時在N末端和C末端連接特定多肽；所述特定多肽的序列為GYRGDS、GYRGDSPRGDS、YRGDS、PFSSTKT、SKPPGTSS、YRGDSPRGDS或PRGDS。本發明的自組裝多肽可以促進腫瘤細胞遷移并形成多細胞球體。本發明的多肽形成水凝膠后能模擬體內腫瘤組織因缺乏氧和營養造成的組織中心壞死及與胞外基質的相互作用的微環境，使培養的腫瘤細胞形成多細胞球體，從而更真實地模擬腫瘤在體內的生長情況，為有關腫瘤的各種基礎或臨床研究提供可靠的實驗材料。
文檔編號C07K7/06GK102558304SQ20121001495
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月17日 優先權日2012年1月17日
發明者任輝, 張曙光, 董友玉, 韓藍青, 黃斌 申請人:海貍(廣州)生物科技有限公司