重組融合毒素VEGF₁₆₅-melittin及其制備方法和應用的制作方法

專利名稱：重組融合毒素VEGF₁₆₅-melittin及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程藥物領域，具體涉及一種重組融合毒素VEGF165-Hielittin及其制備方法和應用。
背景技術：
惡性腫瘤的預防與治療一直是世界難題，血管生成對腫瘤的生長和轉移有著至關重要的作用。腫瘤發生時能促進血管生成因子分泌，其中最主要的是血管內皮細胞生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF )。大量研究結果表明 VEGF 通過其加速新血管生長的作用而促進腫瘤細胞的增殖和擴散，與多種實體瘤如肝癌、乳腺癌、肺癌、 結腸癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌的發生、發展與轉移密切相關。而以血管定向的靶向藥物，尤其以VEGF受體為靶向的融合毒素兼具與VEGF受體結合，阻斷VEGF/VEGFR信號通路與殺傷血管內皮細胞的雙重作用，除了抑制腫瘤新生血管形成外，還能夠破壞已生成的腫瘤血管，是更有前景的治療手段，同時在視網膜疾病、艾滋病等方面亦有潛在的應用價值。VEGF 的mRNA經過剪切可形成四種不同的異構體，VEGF121, VEGF165, VEGF189和VEGF2tl6,它們的主要區別是與肝素及細胞外基質的結合力不同。已有研究報道在這四種VEGF的異構體中，以 VEGF121和VEGF165為靶向載體，可以產生更強的細胞毒性效果，這可能與VEGFm、VEGF165有更多的特異性受體有關。國外已有學者將VEGF165與白喉毒素結合形成大分子融合蛋白靶向抑制腫瘤血管的生成，Hotz等也將VEGF121與志賀祥菌毒素融合并進行了抗腫瘤活性檢測，但是這些常用的毒素分子量大，而且必須首先要通過細胞內化作用才能進入細胞發揮作用，這些都影響了其抗腫瘤作用的發揮。蜂毒肽(melittin)是由沈個氨基酸組成的小分子毒素，具有分子量小、易于深入實體瘤內部的優點，其發揮作用的主要機理是使細胞膜的通透性增加，細胞內容物泄露， 細胞裂解，無需經過細胞內化而直接發揮作用，這使得melittin非常適合作為“彈頭”用來制造融合毒素進行抗腫瘤的靶向治療。但目前還沒有相關方面的報道。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術僅僅以阻斷VEGF/VEGFR信號通路抑制腫瘤新生血管為目的的靶向治療方法存在的問題，提供一種兼具血管靶向與破壞已生腫瘤血管，并能殺死腫瘤細胞的雙重作用的新型重組融合毒素VEGF165-melittin，為抗腫瘤靶向治療技術的研究和發展提供基礎。本發明通過以下技術方案實現上述目的
一種重組融合毒素VEGF165-melittin，是通過連接肽在蜂毒素短肽melittin的氨基端連接VEGF165得到，或通過連接肽在VEGF165的氨基端連接蜂毒素短肽melittin得到；所述連接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。也就是說，融合毒素分子中，VEGF165與蜂毒素的連接次序或位置是可以互換的。
其中所述VEGF165和蜂毒素短肽melittin分別與天然人VEGF165和天然蜂毒素至少有90%的序列同源性。所述重組融合毒素的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。或為將SEQ ID NO: 2的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的蛋白質。本發明還保護上述重組融合毒素VEGF165-Hielittin的編碼基因。該編碼基因的核苷酸序列為編碼SEQ ID N0:2所示蛋白序列的基因，具體核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示， 或者與SEQ ID N0:3所示序列具有90%以上同源性且具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內皮細胞作用的核苷酸序列。或者在高嚴謹條件下可以與SEQ ID NO:3所示序列雜交的核苷酸序列。一種重組融合毒素VEGF165-Hielittin的表達載體，由VEGF165Ielittin的編碼基因插入到出發載體的多克隆位點構成，所述出發載體優選為pPICZa，pPIC9或pHIL-sl。含有上述表達載體的轉基因細胞系或宿主菌。本發明所述重組融合毒素VEGF165-Hielittin可以通過DNA重組技術制備，所使用的表達系統是酵母表達系統，優選畢赤酵母，而畢赤酵母X-33最佳。可以使用本領域熟知的方法如PCR、RT-PCR方法、人工合成方法和構建篩選cDNA 文庫等方法獲得編碼人VEGF165的多聚核苷酸和編碼蜂毒素melittin的多聚核苷酸。用作 PCR模板和用于構建cDNA文庫的mRNA或cDNA可以來源于任何含有相應mRNA或cDNA的組織、細胞及文庫等，如從人肝癌組織和工蜂毒腺cDNA文庫獲得，也可以用人工合成的方法獲得。人工合成時可選用宿主偏愛的密碼子，借以提高產物的表達效率。必要時，可采用本領域周知的方法對多聚核苷酸進行突變、缺失、插入和與其它多聚核苷酸連接等。可以使用本領域周知的各種方法，如通過PCR的方法，在保持各自閱讀框不變的前提下，在編碼序列的兩側引入適當的限制性內切酶位點，通過酶切產生粘性末端，并在DNA連接酶作用下，實現編碼人VEGF165和編碼蜂毒素的多聚核苷酸的粘性末端彼此連接，得到編碼本發明融合毒素的基因。如果需要，可在本發明的融合毒素基因兩側引入適當的限制性內切酶識別位點。 可用本領域公知的方法將含編碼融合毒素序列的基因序列克隆到各種適當的表達載體中。 所用標準的分子克隆方法參見J.薩姆布魯克等《分子克隆試驗指南》第三版，科學出版社， 2002。許多表達載體和其對應的宿主如酵母表達載體pPICZa，pPIC9，pHIL-sl (Invitrogerl Corp. San Diego, California, USA.)均可從市場上購得。可以將編碼本發明融合毒素或多肽的核苷酸序列克隆至酵母表達載體中。本發明優選的巴斯德畢赤酵母表達系統可以是胞內表達的，也可以是分泌表達的。這些載體都包括一個由大約0. 9kb的 5’醇氧化酶操縱子(A0X1)序列和大約0. 3kb的轉錄終止基因的3’序列組成的表達盒，因此可以便于目的基因在酵母染色體中整合與表達。表達融合毒素的宿主可以是酵母、細菌、動物細胞、植物細胞等，但本發明優選的是酵母。融合毒素或多肽可以存在于宿主細胞內，也可以是從宿主中分泌出來，但最好是在信號肽的幫助下從宿主細胞內分泌出來。本發明優選的信號肽是α因子(a MF)。α因子信號序列由87個氨基酸組成，來自于啤酒酵母(S. cerevsia)的α性成熟因子前導序列。 編碼融合蛋白的核酸序列，可以插入至宿主染色體，或以游離質粒形式存在。
得到攜帶融合毒素基因的重組表達載體后，可使用通常的方法，如鋰鹽法、PEG法、 原生質球法和電穿孔法等方法轉化宿主細胞。其中，本發明優選的轉化方法是電穿孔法。可通過人們熟知的技術加以鑒定，如收集并裂解細胞，提取DNA，然后用PCR方法鑒定被成功轉化的細胞，即含有本發明DNA構建體的細胞。或者，可用抗人VEGF165或抗蜂毒素的抗體檢測細胞培養上清或細胞破碎液中的蛋白。可以使用搖瓶或生物反應器，培養含有本發明DNA構建體的宿主細胞，以生產本發明的融合毒素。所使用的培養基應能提供菌體(或細胞)生長和產物表達所需的物質， 包含氮源、碳源、PH調節成分等，培養基配方應根據不同培養對象，通過試驗獲得。培養可分為兩個階段，第一階段主要用于菌體(或細胞)生長，第二階段主要用于產物的合成。可以用各種蛋白分離的方法自含有本發明DNA構建體的細菌或細胞培養物中分離、純化融合蛋白，如鹽析、有機溶劑沉淀、超濾、液相層析等技術及這些技術的組合。其中液相層析可以用分子篩、親和、離子交換、疏水、反相等層析技術。經過多種方案的優化組合，最終確定出效率最高的一種重組融合毒素 VEGF165-Hielittin的制備方法，步驟如下
(1)以SEQID NO:4 5為引物，擴增VEGF165基因；
(2)合成蜂毒素短肽melittin基因，兩端分別連接限制性酶切位點和損al，連接到載體pPICZa的多克隆位點，得到重組載體；
(3)分別用&ORI和損ol對VEGF165基因和重組載體進行雙酶切，連接后，電穿孔法轉化宿主畢赤酵母菌，構建VEGF165-Melittin基因工程菌；
(4)培養VEGF165-Melittin基因工程菌，培養基為BMGY培養基，下培養，誘導其產生可溶性重組融合蛋白VEGF165-Melittin ；
(5)將步驟(4)的培養物離心、收集上清，進行親和柱層析純化VEGF165-Melittin蛋白， 柱層析所述填料為Ni-NTA樹脂，吸附條件為pH 5. 5-8. 5之間，洗脫條件為降低pH、逐步提高咪唑的濃度或加入EDTA或者EGTA，pH為4_6之間，咪唑濃度為0. 02-0. 5M ；
(6)采用分子量1000道爾頓的超濾膜超濾，采用半透膜透析(透析液10mMTris -HCl, 150mM NaCl)，凍干得到 VEGF165-Melittin 蛋白。生物學實驗表明，本發明的融合毒素可以與肝癌細胞表面的受體靶向結合并且能夠抑制肝癌細胞的生長，可用于制備靶向抗腫瘤藥物。本發明中的重組融合毒素VEGF165-Hielittin可以有各種衍生物，這些衍生物可以是但不局限于其不同形式的鹽、修飾后產物等。如在多肽的氨基、羧基、羥基、巰基上再進行修飾。所用的修飾劑可以是但不局限于聚乙二醇，葡聚糖等。本發明中的重組融合毒素VEGF165-Hielittin或其衍生物可以單獨使用，優選的為與一種或多種藥學上可接受的載體一起組成藥物制劑。藥物載體一般應與融合毒素相容且不能對受體自身有害，典型的載體為水、鹽水、糖類、醇類或氨基酸，它們須無菌且無致熱原。藥物制劑可通過本領域己知的方法制備。這些方法包括將融合毒素與一種或多種輔助成分混合的步驟。優選的藥物制劑包括含水的液體制劑和含水量低于10%或不含水的凍干制劑。這些制劑可以含有緩沖劑，鹽類，小分子糖類等。本發明中的重組融合毒素VEGF165-Hielittin及其衍生物或其藥物組合物可以通過任何已知的方法，包括注射(如皮下或肌肉)、靜脈輸注、透皮、吸入等方法給藥。優選的方
5法為靜脈輸注或注射給藥。治療包括在一段時間內使用單一劑量或復合劑量。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果
本發明將人VEGF165分子，或其有至少90%序列同源性的類似物與蜂毒素或其有至少 90%序列同源性的類似物相融合，所形成的融合毒素既保留了與VEGFR、EGFR相結合的活性，又保留了蜂毒素溶解細胞的活性。因此本發明的融合毒素既可以通過人VEGF165與表達 VEGFR、EGFR的腫瘤細胞結合，在腫瘤細胞周圍富集高濃度的VEGF165-蜂毒素，借助蜂毒素的溶解細胞的活性，達到靶向殺傷腫瘤細胞的目的，同時，當VEGF165-Hielittin與VEGFR、 EGFR結合后，還可以與內源性的VEGF競爭VEGFR、EGFR的結合位點，從而阻斷VEGF/VEGFR 信號的酪氨酸激酶活化作用，阻斷多種VEGFs、EGFs過強信號，最終達到抑制腫瘤的增殖、 遷移，尤其抑制新生血管的生成的作用。實驗研究證實本發明的VEGF165-蜂毒素融合毒素具有高效結合、靶向殺傷腫瘤細胞的活性。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果
本發明將VEGF165與小分子毒素melittin融合，構建新型重組毒素VEGF165-Hielittin， 在真核表達體系巴氏畢赤酵母中獲得可溶性表達，并對其腫瘤細胞的殺傷作用進行檢測， 篩選出具有更強靶向性和腫瘤細胞殺傷活性的新型重組毒素，將有助于進一步研究和發展相關的抗腫瘤靶向治療技術，具有較好的市場前景。我們的實驗結果表明，本發明獲得的融合毒素VEGF165-Hielittin同時具備與腫瘤細胞的VEGFR、EGFR結合，釋放蜂毒素殺傷腫瘤細胞的作用，并且當VEGF165-Hielittin與 VEGFR、EGFR結合后，阻斷VEGF/VEGFR信號的酪氨酸激酶活化作用，阻斷多種VEGFs、EGFs過強信號，最終達到抑制腫瘤的增殖、遷移，尤其抑制新生血管的生成的作用。本發明將VEGF/ VEGFR系統作為治療腫瘤的靶點，構建融合毒素VEGF165-Hielittin，實現特異性靶點、高效結合、靶向殺傷腫瘤細胞，為腫瘤的治療開辟一個全新的設計思路與途徑。


圖1. RT-PCR擴增VEGF165基因圖譜，其中，泳道1為VEGF165PCR產物，泳道2為DNA 分子量標準品。圖2. pPICZ α /VEGF165-Melittin表達質粒的酶切鑒定圖，泳道1為Xho I和Xba I雙酶切的重組質粒pPICZ α /VEGF165-Melittin ；泳道2為DNA分子標志物；泳道3為未酶切的重組質粒。圖3. VEGF165-Hielittin的表達鑒定圖，其中，泳道1為空載體轉化菌株誘導后；泳道3為蛋白質分子量標準品；泳道2、4、5為重組質粒pPICZ α /VEGF165-Hielittin轉化菌株誘導后的條帶。圖 4. VEGF165-Hielittin 的純化及 western-blotting 鑒定圖。其中，圖 A 為純化后的VEGF165-Hielittin鑒定圖譜，泳道1為純化的VEGF165-Hielittin，泳道2為蛋白質分子量標準品；圖B為western-blotting鑒定圖，泳道1為空載體轉化菌株誘導后蛋白檢測， 泳道2、3為純化VEGF165-Hielittin蛋白檢測。圖 5. RT-PCR 檢測腫瘤細胞系 AsPC-1、MHCC97-H 禾Π HepG-2 中 VEGF、VEGFRl、 VEGFR2的表達情況。圖6. MTT法測定VEGF-Melittin融合毒素對腫瘤細胞生長的抑制作用，其中為A肝癌細胞H印G-2、B為胰腺癌細胞AsPC-I，C為肝癌細胞MHCC97-H。
具體實施例方式以下借助實施例描述本發明的最佳實施方式。這些實施例旨在進一步舉例闡明本發明，而不是以任何方式限制本發明待批權利要求的范圍。實施例1
(1)取VEGF高表達的肝癌細胞H印G2，使用Trizol試劑(Invitrogen Corp. San Diego, California, USA.)，以一步法提取總RNA。具體步驟如下具體地說，將培養狀態良好的 HepG2細胞計數后，約IO6 IO7個細胞加入ImL Trizol，然后移入1. 5mL無RNA酶EP管中。再加入200 μ L氯仿，劇烈振蕩搖勻，室溫下放置30秒。4°C離心(12 000 r/min) 5分鐘后，將上清液小心轉移到另一個無RNA酶的EP管中。向其中加入等體積異丙醇，室溫放置5分鐘，并于4°C離心(12 000 r/min) 5分鐘，棄去上清。加入70% (體積)乙醇ImL洗滌沉淀兩次，4°C離心(12 000 r/min) 5分鐘。室溫下空氣蒸發殘存乙醇后，將沉淀溶于50 μ L DEPC水中，進行RNA的分析與定量，取1 μ L樣品稀釋100倍后經紫外分光光度計測定0擬60 和0擬80，按下列公式計算其濃度和純度RNA含量ΚΝΑ(μβ/πιυ=40Χ0^60Χ稀釋倍數， 0D260/0D280=1. 8 2. 0表示純度合格。以瓊脂糖凝膠電泳法，觀察RNA的完整性。(2) RT-PCR 法克隆人 VEGF165 基因取如上提取的總 RNA lyg，WAlyL Oligo dT，70°C 變性 lOmin，冰浴 Imin ；然后加入 10XRNA PCR 緩沖液 2yL，MgCl2 (25 mmol/L) 4μ L, RNA 酶抑制劑 QOU/μ L)0. 5μ L，dNTPs (各 10mmol/L) 2 μ L，AMV 逆轉錄酶 QOOU/ μ L) 1 μ L，Oligo dT (20pmol/μ L) 1 μ L，無RNA酶滅菌水加入至終體積20 μ L，建立逆轉錄 (RT)反應體系。于PCR儀上42 °C反應60分鐘，然后99 °C 5分鐘使逆轉錄酶滅活，合成cDNA。通過在NCBI上搜索到VEGF165的序列(序列號NM_001204384. 1)，設計上游引物 5，-AAT CTC GAG AAC TTT CTG CTG TCT TGG G_3，( SEQ ID N0:4)，下游引物 5，-AAT GAA TTC CCG CCT CGG CTT GTC ACA T-3，( SEQ ID N0:5);委托上海英駿公司合成。再按如下 PCR 體系擴增 VEGF165 基因上述 cDNA 反應液 20 μ L ；MgCl2 (25 mmol/L) 6 μ L ； 10 X LA PCR 緩沖液 8 μ L ；上游引物 1 μ L (20pmol/μ L)；下游引物 1 μ L (20pmol/μ L) ；TaKaRa LA Taq (5U/ μ L) 1 μ L ；滅菌超純水至終體積 100 μ L0 PCR 條件是 94°C，5min，94°C，30s， 57°C，lmin，72°C，30s，35個循環，72°C，IOmin ；1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察片段大小與預計產物大小是否相吻合，擴增結果見圖1，可見約500bp條帶。(3)克隆載體的構建與鑒定回收RT-PCR擴增的人VEGF165基因片段后，與T載體 16°C連接30分鐘。連接反應體系包括人VEGF165基因RT-PCR產物0. 1 0. 3pmol ；T載體 0. 03pmol ；溶液I (含DNA連接酶和連接緩沖液，見Takara公司T載體試劑盒)5 μ L ；滅菌超純水至終體積10 μ L0按照常規方法，制備大腸桿菌DH5 α感受態細胞，加入上述連接產物，進行常規方法轉化。然后取200 μ L已轉化的感受態細胞涂布于含X-Gal、IPTG和氨芐青霉素(100 μ g/ mL)的LB瓊脂平板上，37°C培養箱中培養12 16小時。隨機挑取轉化后的白色單菌落(藍白篩選)，接種于含氨芐青霉素(100yg/mL)的 LB培養基中，37°C強烈震蕩培養過夜，然后常規提取質粒DNA。取1 μ L溶解的DNA沉淀物進行瓊脂糖凝膠電泳定量分析和酶切鑒定。37°C下用ZAo I和I雙酶切鑒定消化2
7小時，瓊脂糖凝膠電泳后根據內切酶譜鑒定為正確克隆。挑選酶切鑒定正確的克隆，提取質粒，用于DNA測序分析。(4)人工合成沈肽臨1丨《^1基因，N端攜帶(GGGGQ2柔性短肽，兩端分別攜帶酶切位點和損a I，以供與VEGF融合后連接表達載體pPICZ α構建重組載體pPICZ α / melittin，并且我們在連接肽與melittin之間引入酶切位點如al，以便可以將融合毒素分子中的VEGF165與蜂毒素的連接次序進行互換。feoRI和損al雙酶切上述人工合成基因后與同樣雙酶切的PPICZ α載體進行常規連接，16°C連接過夜后轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，Zeocin抗生素(25yg/mL)抗性篩選，隨機挑取陽性克隆接種于5mL LB培養基中，37°C 震蕩培養過夜，然后常規提取質粒DNA。瓊脂糖凝膠電泳定量分析和酶切鑒定(37°C下用損ο I和I雙酶切鑒定，消化2小時)。挑選酶切鑒定正確的克隆，提取質粒，用于 DNA測序分析。(5)切膠回收經PCR擴增后的VEGF165基因，用feoR I和煬ο I雙酶切VEGF165基因后和同樣雙酶切的pPICZ α /melittin重組載體按照常規方法連接，并轉化到DH5 α感受態細胞，在平板上隨機挑選幾個克隆，抽提質粒，用損ο I和損al雙酶切鑒定重組子pPICZ α / VEGF165-melittin，鑒定結果見圖2，泳道3為未酶切的重組質粒，可見約750bp的條帶，同時重組子通過北京六合華大公司測序確定序列準確度，測序結果與設計一致。(6)取測序正確的培養菌液，按質粒提取試劑盒說明書提取質粒DNA并用瓊脂糖凝膠電泳法進行定量分析。取20 25 μ g表達載體pPICZ α /VEGF165IeIittin，經Sac I 酶消化(線性化)后用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。線性化的質粒用10 μ L超純水溶解后置冰上備用。從畢赤酵母Χ-33的YPD陰性培養板上(不含抗生素的YPD瓊脂平板)挑取單個菌落，接種于5mL YPD培養基中，250rpm, 30°C震蕩培養8小時，常規方法制備酵母感受態細胞。然后取80 μ L上述感受態細胞，與20 25 μ g線性化的重組表達質粒混合，移入 0. 2cm電轉化杯內進行電轉化。取50 100 μ L轉化后的菌液涂布于含kocin(100 μ g/mL) 的YPD平板上，30°C培養箱培養2 3天，觀察轉化子的生長狀況。然后用PCR方法(所使用的引物為上游引物5，-AAC TTT CTG CTG TCT TGG G -3，<SEQ ID N0:6>和下游引物 5，-CCG CCT CGG CTT GTC ACA T-3，<SEQ ID NO: 7>，反應條件同上)篩選轉化酵母菌。離心回收菌體后，以玻璃珠法提取酵母基因組DNA并進行PCR鑒定，擴增產物進行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，觀察是否得到預期大小的基因片段。(7)融合毒素VEGF165-Hielittin的表達、鑒定取上述鑒定結果陽性的克隆接種于 IOmL BMGY (pH 6. 0)培養基中，28°C震蕩培養24小時，至OD600達到2. 0 6. 0時收集細胞。用等體積(IOmL) BMMY (pH 6.0)重懸細胞沉淀，28°C震蕩培養，誘導表達，在培養的第0、24、48、72、96、120、144和168小時等時間點各取0. 5mL發酵液，離心收集上清，加入樣品緩沖液制備電泳樣品，SDS-PAGE^estern-blotting鑒定重組融合蛋白的分泌表達，鑒定結果見圖3，圖3顯示誘導后的融合毒素蛋白表達條帶約^kD。同時，在誘導過程中，每M 小時補充一次甲醇至終濃度0. 5%，同時補充滅菌超純水，使發酵液總體積保持不變。(8)融合毒素的western-blotting鑒定表達產物經SDS-PAGE后，電轉移至PVDF 膜上，然后用封閉液(TBS + 1%吐溫20 + 10%脫脂奶粉)封閉池，接著分別與兔抗VEGF蛋白抗體、兔抗melittin抗體(用封閉液按1:2500的比例稀釋)在4°C反應過夜，用洗脫液 (TBS + 1%吐溫20)洗膜5次；然后加入封閉液稀釋的羊抗兔(1: 6000)，室溫反應1 h ，用洗脫液洗膜5次；最后將PVDF膜置于含有辣根過氧化物酶底物的顯色液中顯色。(9)挑取表達量高的重組子，按1%接種量將其接入裝有5mL YPD培養基的培養瓶中，過夜，次日按1%轉接至500mL BMGY培養基中，培養至0D_達到2. 0 6. 0，用等體積 BMMY (pH 6.0)重懸細胞沉淀，28°C震蕩培養，誘導表達96小時時收集發酵液，離心收集上清。(10)融合毒素的純化(Ni柱親和層析結合超濾膜超濾、透析)
a、用去離子水洗柱料；加入0. 5倍柱床體積0. IM硫酸鎳，充分振蕩柱料；加入5倍體積去離子水洗柱，重復2遍后，平衡緩沖液平衡，破碎上清樣品以0. 5mL/min上樣，然后分管收集；1. 5倍樣品體積平衡緩沖液洗去未吸附的樣品，流速l-2mL/min，分管收集；用1/2倍體積洗脫緩沖液洗脫，流速l-2mL/min，分管收集流出峰。SDS-PAGE、western-blotting電泳檢測純化蛋白VEGF165-melittin，鑒定結果見圖4。b、蛋白通過分子量10000道爾頓的超濾膜超濾，然后采用IOmM Tris · HCl，150mM NaCl透析后，凍干。(11) MTT法測定融合毒素VEGF165-Hie 1 ittin對肝癌細胞H印G-2、胰腺癌細胞 AsPC-I和肝癌細胞MHCC97-H生長的抑制作用
分別取指數生長期的肝癌細胞H印G-2、胰腺癌細胞AsPC-I和肝癌細胞MHCC97-H (1 X IO4)接種96孔板。每種細胞分為對照組和實驗組，實驗組加入VEGF165-melittin，濃度分另Ij為 0. 2μ g/mL、0. 4μ g/mL、0. 8μ g/mL、l. 6μ g/mL、3. 2μ g/mL、6. 4μ g/mL、12. 8μ g/mL， 每個濃度設5個復孔。對照組加入10%胎牛血清的H-DMEM培養液至等體積。放入37°C， 5% CO2孵箱培養。M小時后取出96孔板，向各孔內加入MTT溶液20 μ L (5 mg/mL),37°C 5% CO2孵育4小時后終止培養。小心吸棄孔內上清液，每孔加入100 μ L DMS0，振蕩10分鐘。待沉淀完全溶解后在Bio-red 550酶標儀上測定吸光度值(0D值)。按下列公式分別計算兩組在不同濃度VEGF165-Hielittin作用后的細胞生長抑制率(三次重復的平均值)。 以細胞生長抑制率對藥物濃度做曲線，求出IC50。細胞生長抑制率(％)=(對照組細胞OD 值一實驗組細胞OD值)/對照組細胞OD值X 100%。圖5為VEGF、VEGFRU VEGFR2表達的半定量RT-PCR檢測圖譜。分別檢測了三株腫瘤細胞系(人胰腺癌細胞系AsPC-I、人肝癌細胞系MHCC97-H和H印G-2)中VEGF、VEGFR1、 VEGFR2的表達，結果顯示三株細胞系中均呈現VEGF的高表達，并且VEGFRl、VEGFR2的表達情況有所不同其中AsPC-I胰腺癌細胞和MHCC97-H肝癌細胞中VEGFRl的表達均呈陽性， 同時MHCC97-H中VEGFR2的表達也呈陽性，而H印G-2肝癌細胞中只有VEGFR2呈陽性。純化VEGF165-Hielittin蛋白與肝癌細胞H印G-2、胰腺癌細胞AsPC-I和肝癌細胞 MHCC97-H共孵育后，MTT法測定VEGF165-Hielittin融合毒素對腫瘤細胞生長的抑制作用結果如圖6所示。可見VEGF165-Hielittin對VEGFR2高表達的肝癌細胞H印G-2生長抑制作用最強；對VEGFRl高表達而VEGFR2表達相對較低的肝癌細胞MHCC97-H的生長抑制作用次之；而VEGFRl高表達，VEGFR 2陰性表達的胰腺癌細胞AsPC-I的生長情況與對照組相比最弱。結果顯示，重組融合毒素VEGF165-Hielittin具有良好的腫瘤細胞殺傷作用，并且對腫瘤細胞的殺傷活性顯示出靶向作用于VEGFR2的特征。
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上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種重組融合毒素VEGF165-Hielittin，其特征在于是通過連接肽在蜂毒素短肽 melittin的氨基端連接VEGF165得到，或通過連接肽在VEGF165的氨基端連接蜂毒素短肽 melittin得到；所述連接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2.根據權利要求1所述重組融合毒素VEGF165-melittin，其特征在于其氨基酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。
3.權利要求1或2所述重組融合毒素VEGF165-Hielittin的編碼基因。
4.根據權利要求3所述重組融合毒素VEGF165-Hielittin的編碼基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.權利要求1或2所述重組融合毒素VEGF165-Hielittin的表達載體。
6.根據權利要求5所述的表達載體，其特征在于是由權利要求3所述重組融合毒素 VEGF165-Hielittin的編碼基因插入出發載體的多克隆位點得到，所述出發載體為pPICh， pPIC9 或pHIL-sl。
7.含有權利要求5所述表達載體的轉基因細胞系。
8.含有權利要求5所述表達載體的宿主菌。
9.一種重組融合毒素VEGF165-Hielittin的制備方法，其特征在于步驟如下(1)以SEQID NO:4 5為引物，擴增VEGF165基因；(2)合成蜂毒素短肽melittin基因，兩端分別連接限制性酶切位點和損al，連接到載體pPICZa的多克隆位點，得到重組載體；(3)分別用和損ol對VEGF165基因和重組載體進行雙酶切，酶切產物連接后，電穿孔法轉化宿主畢赤酵母菌，構建VEGF165-Melittin基因工程菌；(4)培養VEGF165-Melittin基因工程菌，培養基為BMGY培養基，28°C下培養，誘導其產生可溶性重組融合蛋白VEGF165-Melittin ；(5)將步驟(4)的培養物離心、收集上清，進行親和柱層析純化VEGF165-Melittin蛋白， 柱層析所述填料為Ni-NTA樹脂，吸附條件為pH 5. 5^8. 5之間，洗脫條件為降低pH、逐步提高咪唑的濃度或加入EDTA或者EGTA，pH在4 6之間，咪唑濃度為0. 02 0. 5M ；(6)采用分子量1000道爾頓的超濾膜超濾，采用半透膜透析，透析液為IOmMTris -HCl 禾口 150mM NaCl、凍干得到 VEGF165-Melittin 蛋白。
10.權利要求1或2所述重組融合毒素VEGF165-Hielittin在制備靶向抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了重組融合毒素VEGF165-melittin及其制備方法和應用，屬于基因工程藥物領域。本發明通過連接肽將VEGF165與小分子毒素melittin融合，構建新型重組毒素VEGF165-melittin，可通過巴氏畢赤酵母進行可溶性表達。經檢測，本發明的VEGF165-melittin同時具備與腫瘤細胞的VEGFR、EGFR結合，釋放蜂毒素殺傷腫瘤細胞的作用，并且當VEGF165-melittin與VEGFR、EGFR結合后，阻斷VEGF/VEGFR信號的酪氨酸激酶活化作用，阻斷多種VEGFs、EGFs過強信號，最終達到抑制腫瘤的增殖、遷移，尤其抑制新生血管的生成的作用，為腫瘤的治療開辟一個全新的設計思路與途徑。
文檔編號C07K1/36GK102558359SQ20121001056
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月14日 優先權日2012年1月14日
發明者孫艷, 王丁丁, 胡麗莉, 黃宏靚 申請人:廣東藥學院