專利名稱：榆錢菠菜轉錄活性蛋白AhPHD1及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種榆錢菠菜轉錄活性蛋白AhPHDl及其編碼基因與應用。
背景技術：
環境中物理、化學因素的變化，例如干旱、鹽堿、低溫等脅迫因素對植物的生長發育具有重要影響，嚴重時會造成農作物大規模減產，因此培育耐逆性高的作物是種植業的主要目標之一。目前，應用基因工程技術進行育種已經成為提高作物耐逆性的重要方法之一。高等植物細胞具有多條途徑應答環境中的各種逆境脅迫，其中轉錄因子起著調控耐逆相關效應基因表達的作用。現已在植物中發現了多類與植物耐逆性相關的轉錄因子，例如:EREBP/AP2中的DREB類，bZIP，MYB等等。PHD(Plant Homodomain)類具有轉錄活性的蛋白廣泛存在于動植物以及細菌、病毒蛋白中，比如哺乳動物的CBP類蛋白，人的INGl家族，酵母Yng2p蛋白，病毒MIRl蛋白。PHD類蛋白結構域是C4HC3類的鋅指結構，其功能主要為以下幾類:(I)作為乙酰化或去乙酰化酶參與染色質相關的轉錄調控；(2)作為E3泛素連接酶參與蛋白降解；(3)作為PIPs受體感知PIPs信號參與染色質相關的轉錄調控。在擬南芥中首次發現了 PHD類蛋白，植物中該類蛋白的功能研究尚少。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種蛋白及其編碼基因。本發明所提供的蛋白，名稱為AhPHDl,來源于榆錢菠菜(Atriplex hortensis),是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列2衍生的蛋白質。其中，序列表中的序列2由241個氨基酸殘基組成，屬于榆錢菠菜中的PHD家族。其編碼基因的讀碼框包含726個核苷酸。上述蛋白中，一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述蛋白AhPHDl的編碼基因AhPHDl也屬于本發明的保護范圍。上述基因可為如下(I)或⑵或(3)的DNA分子:(I)序列表中序列I所示的DNA分子；(2)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼與植物耐逆性相關蛋白的DNA分子；(3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與植物耐逆性相關蛋白的DNA分子。
上述基因中的嚴格條件可為如下:50°C，在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5MNaP04和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2X SSC，0.1% SDS中漂洗；還可為:50°C，在7%SDS,0.5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，I X SSC, 0.1 % SDS中漂洗；還可為:50°C，在 7% SDS,0.5M NaPO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0.5X SSC，0.1%SDS中漂洗；還可為:501:，在7%505、0.5M NaPOjP ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，0.1 X SSC, 0.1% SDS 中漂洗；還可為:50°C，在 7% SDS,0.5M NaPO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在65°C，0.1 XSSC,0.1% SDS中漂洗;也可為:在6XSSC，0.5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2 X SSC, 0.1% SDS和I X SSC, 0.1% SDS各洗膜一次。其中，序列表中的序列I由726個脫氧核苷酸組成，本序列為AhPHDl基因的讀碼框，編碼具有序列表中序列2的氣基酸殘基序列的蛋白質。含有上述基因的表達載體、細胞系或重組菌均屬于本發明的保護范圍。所述重組載體為將所述基因插入pBin438載體的BamH I和KpnI識別位點間得到的重組載體。擴增所述基因全長或其任意片段的引物對也屬于本發明的保護范圍。所述引物對具體可為如下⑴或(II):(I)由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對；(II)由序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA組成的引物對。所述蛋白、所述基因或所述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在培育耐逆性植物中的應用是本發明保護的范圍；上述應用中，所述耐逆性具體為耐鹽性。
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本發明的另一個目的是提供一種培育轉基因植物方法。本發明提供的方法是將上述基因導入目的植物中，得到轉基因植物，所述轉基因植物的耐逆性高于所述目的植物。上述方法中，該基因通過上述重組載體導入所述目的植物中；上述方法中，所述耐逆性為耐鹽性；上述方法中，所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；在本發明的實施例中具體為擬南芥。上述轉基因植物理解為不僅包含將所述基因轉化目的植物得到的第一代轉基因植物，也包括其子代。對于轉基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規育種技術將該基因轉移進入相同物種的其它品種，特別包括商業品種中。將所述基因導入目的植物，會使所述蛋白質目的植物中合成，進而是目的植物的耐逆性性狀得到改良。上述基因可先進行如下修飾，再導入宿主中，以達到更好的表達效果:I)根據實際需要進行修飾和優化，以使基因高效表達；例如，可根據受體植物所偏愛的密碼子，在保持本發明所述核苷酸序列編碼的氨基酸的同時改變其密碼子以符合植物偏愛性；優化過程中，最好能使優化后的編碼序列中保持一定的GC含量，以最好地實現植物中導入基因的高水平表達，其中GC含量可為35 %,優選為多于45 %,更優選為多于50%，最優選多于約60% ；2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列進行修飾；3)與各種植物表達的啟動子連接，以利于其在植物中的表達；所述啟動子可包括組成型、誘導型、時序調節、發育調節、化學調節、組織優選和組織特異性啟動子；啟動子的選擇將隨著表達時間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性表達啟動子，根據需要受體在發育的什么時期而定；盡管證明了來源于雙子葉植物的許多啟動子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動子用于雙子葉植物中的表達，單子葉植物的啟動子用于單子葉植物中的表達；4)與適合的轉錄終止子連接，也可以提高本發明基因的表達效率；例如來源于CaMV的tml，來源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發明基因進行連接。5)引入增強子序列，如內含子序列(例如來源于Adhl和bronzel)和病毒前導序列(例如來源于TMV，MCMV和AMV)。在實際操作中，也可以將本發明基因進行細胞靶向定位。可利用本領域現有的技術實現。例如，將來源于靶向細胞器的靶基因序列與本發明基因序列融合，再導入植物細胞中，就可定位了。攜帶有所述基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。本發明的實驗證明，本發明發現了一個新蛋白 及其編碼基因AhPHDl，該基因的表達明顯受高鹽和低溫誘導，也受植物激素脫落酸ABA的誘導。將AhPHDl基因經農桿菌的介導，導入擬南芥Col-O中，獲得了過量表達AhPHDl的純系株系，上述轉基因株系與野生型擬南芥相比，其耐鹽性有顯著提高，說明AhPHDl基因能夠顯著提高植物的耐鹽性。因此，本發明提供的蛋白AhPHDl對于培育耐逆植物品種，特別是培育耐非生物脅迫(耐鹽)的作物、林草等新品種具有重要價值，可用于農牧業和生態環境治理所需的耐逆性植物品種的培育和鑒定，對提高農作物產量具有重要意義；并且從分子生物學角度證明了 PDH家族中的一些成員確實參與植物對非生物脅迫應答的調控，其表達與植物的耐非生物脅迫呈正相關。
圖1為AhPHDl基因在不同處理時的轉錄特征圖2為植物表達載體pBin438_AhPHDl的示意3為AhPHDl過表達株系的分子鑒定圖4為AhPHDl過表達株系與對照的耐鹽性鑒定
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質量百分含量。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，數據為三次重復實驗的平均值或平均值土標準差。所有植物材料均生長于22°C每天的光照為16h/8h (光照/黑暗)。pBin438載體(雙元表達載體)記載在(李太元，田穎川，秦曉峰,等.高效抗蟲轉基因煙草的研究，中國科學(B輯)，1994，24 (3):276-282.)，由方榮祥院士惠賜。經方榮祥先生同意，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得。農桿菌GV3101 菌株記載在 Clough-SJ, Bent-AF.Floral dip:a simplifiedmethod for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.PlantJournal.1998,16:6,735-743中，公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得。哥倫比亞生態型擬南芥(Col-O):種子購自Arabidopsis Biological ResourceCenter(ABRC)，以下簡稱野生型擬南芥。實施例1、榆錢菠菜AhPHDl基因cDNA克隆1、榆錢菠菜AhPHDl基因的發現前期的研究表明具有轉錄活性的PHD蛋白家族參與植物對非生物脅迫的應答反應，并與植物耐逆性相關。榆錢菠菜(Atriplex hortensis)又名山菠菜,是一種鹽生植物，參考擬南芥和大豆等物種PHD的保守氨基酸序列，設計一對簡并引物:AhHDFl: GYATHAAYTTYGCYAGRGATGG,AhHDRl:GCffGGDGTDATYTTMACACA,榆錢菠菜發芽,生長7天后分別以300mM NaCl水溶液處理0hr、5hr, IOhr,混合樣本，按照常規方法提取cDNA。以該cDNA為模板，應用上述引物，經PCR擴增出大小在400bp左右的條帶，克隆到PMD18-T載體后測序，獲得4個不同的序列，用DNAStar Megal i gn軟件，與大豆PHD氨基酸序列比對，發現相似度均在50%以上，且具有共同的保守結構域，分別命名為 AhPHD1、AhPHD2、A hPHD3，AhPHD4。對其中的 AhPHDI 進行了 進一步研究。根據已獲得的部分cDNA序列各設計兩對巢式引物，采用Smart RACE的方法PCR擴增cDNA的5’ -端和5’ -端序列，結果獲得了包括完整⑶S在內的cDNA序列。Smart RACE 通用引物:SMART II Oligo (12 μ Μ):5’ -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3’3，-CDS (12 μ Μ):5’ -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC (T) 30V N_3’ (N = A, C, G, or T ；V = A, G, orC)再以下述引物經RACE，克隆全長AhPHDl基因AhPHDlRACE 特異引物:SF1 (Specific forward primer for AhPHD I RACE):TAAGGACAAGCCTAGTGTGGATAGTG 194-NSFl(Nested specific forward primer for AhPHDIRACE):GGCAAGTGATGGGCAGATCAAGAG 248-SRl(Specific reverse primer for AhPHDIRACE):CTCTTGATCTGCCCATCACTTGCC -271NSRl(Nested specific reverse primer for AhPHDIRACE):CTATCCACACTAGGCTTGTCCTTAAC -217所克隆的序列包括ATG前面239bp，和終止密碼子TGA后的375bp。該基因的讀碼框架包括726bp，為AhPHDl的cDNA，為序列I中的核苷酸序列，編碼具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列。氨基酸序列分析表明，在序列表中序列2由241個氨基酸殘基組成。2、榆錢菠菜AhPHDl基因的獲得根據AhPHD I基因序列設計引物:
AhPHDlsense:5 ‘-ATGGAAGGAGGAACTGCGCAC-3，，(序列 3)AhPHDlantisense:5 ‘-CTAGGGTCGTGCTCTTTTGTT_3’(序列 4)應用RT-PCR方法，從榆錢菠菜，又名山菠菜，(肖崗，張耕耘，劉鳳華，王軍，陳受宜，李聰，耿華珠，山菠菜甜菜堿醛脫氫酶基因研究，科學通報，1995,40 (8) =741-745,公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得)總RNA中擴增AhPHDl基因，具體如下:取榆錢菠菜葉片，置于液氮中研碎，懸于4mol/L硫氫酸胍中，并用酸性苯酚、氯仿抽提，向上清中加入無水乙醇進行沉淀，最后將沉淀溶于水中得到總RNA。取5μ g總RNA用反轉錄試劑盒(Promega公司)按試劑盒的方法進行反轉錄，以得到的cDNA片段為模板進行PCR擴增反應。20 μ IPCR反應體系為:1μ I 一鏈cDNA (0.05 μ g)、I μ I引物(AhPHDlsense、AhPHDl antisense:20 μ Μ)、2 μ I 10XPCR 緩沖液、0.4 μ I dNTP (IOmM)和 IU TaqDNA聚合酶，用超純水補足20 μ 1，液面覆蓋液體石蠟油。反應在ΡΕ9600型PCR儀上進行，其程序為 94°C變性 5min ;再 94°C lmin,56°C lmin,72°C lmin，共 30-32 個循環；然后 72°C延伸IOmin ;4°C保存。PCR產物經回收后序列分析，結果表明該PCR產物具有序列表中序列I的核苷酸序列，然后克隆于PMD18-T質粒的多克隆位點，得到重組載體pMDAhPHDl。3、AhPHDl基因在非生物脅迫下的表達特征對榆錢菠菜進行聚乙二醇(PEG)模擬的干旱、NaCl, ABA和低溫處理，用于分析榆錢菠菜AhPHDl在非生物脅迫和脫落酸(ABA)處理下的轉錄特征。將榆錢菠菜種子種在盆中，生長2星期后，對幼苗分別進行下述脅迫處理:生長條件除指明外均為22_23°C，光照16h/天。干旱處理: 將榆錢菠菜幼苗的根系置于20% (質量百分含量)PEG溶液中，分別培養O小時、I小時、3小時、6小時、12小時和24小時后取樣。鹽處理:將幼苗的根系置于300mM NaCl水溶液中，分別在光照培養O小時、I小時、3小時、6小時、12小時和24小時后取樣。ABA處理:將幼苗的根系置于100 μ MABA水溶液中，分別在光照培養O小時、I小時、3小時、6小時、12小時24小時后取樣。低溫處理:將幼苗置于4°C培養箱中，分別在光照培養O小時、I小時、3小時、6小時、12小時和24小時后取樣。應用Real Time PCR分析AhPHDl基因在上述處理時的轉錄特征，總RNA的提取同實施例1。所用引物如下:QRT-AhPHD IF I:TATTTGCGAGAGGTGGTTCCQRT-AhPHD IR I:GCCCTGTCTTCTTCAAGCTG以Actin作為內對照，引物為:QRT-AhactinFl:CTGCTGGTATCCACGAGACTQRT-AhactinRl:GCAATGCCAGGGAACATAGT結果如圖1所示，AhPHDl基因的轉錄明顯受脫落酸ABA誘導，分別在脅迫12小時和24小時時受低溫和高鹽誘導，受干旱誘導不明顯。植物激素ABA與植物與非生物脅迫的應答反應相關，因此上述結果表明AhPHDl可能參與植物對非生物脅迫的應答。
實施例2、AhPHDl編碼蛋白的功能1、重組表達載體pBin438_AhPHDl的構建載體構建引物:BamHI/Kpn IAhPHDlFl:GGATCCATGTCATCCTCAAATCCTCGAAC (序列 5)AhPHDlRl:GGTACCGTCGACTCAGTGACTACGCCCTGTC (序列 6)以實施例1獲得的pMDAhPHD I為模板，用限制性內切酶BamHI和Kpn I雙酶切由AhPHDlFl和AhPHDlRl作為引物獲得的PCR產物，回收酶切產物，將該酶切產物與經過同樣酶切植物表達載體pBin438得到的載體骨架連接，得到連接產物。將連接產物轉入大腸桿菌中，得到轉化子。提取轉化子的質粒，送去測序，該質粒為將序列表中的序列I插入pBin438的BamH I和KpnI酶切位點之間得到的載體，將該載體命名為pBin438_AhPHDl，且序列表中的序列I位于CaMV 35S啟動子之后。重組表達載體PBin438_AhPHDl結構示意圖如圖2所示。2、轉AhPHDl擬南芥株系的獲得將上述獲得的重組載體 pBin438-AhPHDl用電擊轉化法導入農桿菌GV3101中，得到重組菌，提取重組菌的質粒，測序，驗證該質粒中的插入片段為AhPHDl，其讀碼框架無誤。將含有該質粒的重組菌命名為GV3101/pBin438-AhPHDl。挑取GV3101/pBin438-AhPHDl的單菌落在5mlLB中，于28°C培養8小時，再轉接到200mlLB中繼續培養3小時，收菌后重懸于LB培養基中得到轉化液。將野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana)Col-O的花浸泡于轉化液中10秒，取出后放入MS培養基中避光培養8小時，獲得Ttl代轉化種子，將其播于含卡那霉素(50mg/L)的MS培養基上，獲得25株Ttl代轉AhPHDl擬南芥。提取上述25株Ttl代轉AhPHDl擬南芥植株葉的RNA，并反轉錄獲得cDNA，進行RT-PCR鑒定，以野生型擬南芥為對照，探針為:AhPHDlFl:TATTTGCGAGAGGTGGTTCCAhPHDlRl:GCCCTGTCTTCTTCAAGCTG結果如圖3所示，經RT-PCR鑒定后，篩選2個Ttl代轉AhPHDl擬南芥作進一步研究，命名為0X5和0X10，在0X5和0X10中AhPHDl均有較高的轉錄水平，而在對照野生型擬南芥Col-O中，未能檢測到AhPHDl的轉錄。將T1單株收獲種子，此為T2代種子，各單株種子分別播種，用卡那霉素繼續篩選以觀察T2代的分離情況，如此重復篩選，直至T3代獲得遺傳穩定的轉基因株系，獲得穩定遺傳的AtPHD6基因過表達株系0X5和0X10。采用同樣的方法，將空載體pBin438轉入野生型擬南芥中，得到Ttl代轉空載體擬南芥，按照上述方法進行RT-PCR，結果沒有目的產物，因此，得到陽性Ttl代轉空載體擬南芥，播種、收種，得到T3代轉空載體擬南芥。3、轉AhPHDl擬南芥株系的耐鹽性鑒定實驗樣本如下(每個株系15粒種子):T3代轉AhPHDl基因植株(0X5和0X10兩個株系)、T3代轉空載體擬南芥和野生型擬南芥。將各個株系植株的種子同時播種在MS平板上，萌發后5天后將幼苗分別移栽到含有150mM NaCl的1/2MS培養基上生長14天，將NaCl處理14天后的幼苗移栽到蛭石中在正常條件下恢復生長25天。以正常生長(OmM NaCl)為對照處理。觀察鹽脅迫后恢復7天和25天比較表型，結果如圖4A和4B所示，其中，圖4A為移栽到含有150mM NaCl的1/2MS培養基上生長14天的結果，可以看出，150mM NaCl處理后的幼苗生長均受到嚴重抑制；圖4B為鹽脅迫后恢復7天(移栽后7天)和25天(移栽后25天)時野生型擬南芥和轉基因株系的表型，可以看出，與OmM NaCl處理下，150mM NaCl處理后所有植株的生長均受到抑制，而野生型擬南芥較之T3代轉AhPHDl基因植株(0X5和0X10兩個株系)更為嚴重。統計恢復培養第25天野生型擬南芥和轉基因株系的存活率，結果如圖4C所示，可以看出，野生型擬南芥(ColO)的存活率約為21%，而T3代轉AhPHDl基因植株的兩個株系0X5和0X10的存活率分別為44%和42%，明顯高于野生型擬南芥。T3代轉空載體擬南芥和野生型擬南芥的結果無顯著差異。
上述結果表明，有榆錢菠菜AhPHDl參與了植物在高鹽脅迫下的調控，其編碼基因AhPHDl的過量表達，提高了轉基因植株的耐鹽性。
權利要求
1.一種蛋白，是如下(a)或(b): (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b)將序列表中序列2所示的 氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列2衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因是如下⑴或(2)或(3)的DNA分子: (1)序列表中序列I所不的DNA分子； (2)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼與植物耐逆性相關蛋白的DNA分子； (3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與植物耐逆性相關蛋白的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.如權利要求4所述的重組載體，其特征在于: 所述重組載體為將權利要求1所述蛋白的編碼基因插入pBin438載體中，得到表達權利要求I所述蛋白的重組載體。
6.擴增權利要求2或3所述基因全長或其任意片段的引物對。
7.權利要求1所述蛋白、權利要求2或3所述基因或權利要求4所述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在培育耐逆性植物中的應用；所述耐逆性具體為耐鹽性。
8.一種培育轉基因植物的方法，為將權利要求1所述蛋白的編碼基因導入目的植物，得到轉基因植物，所述轉基因植物的耐鹽性高于所述目的植物。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于: 所述蛋白的編碼基因通過權利要求4或5所述的重組載體導入目的植物； 所述耐逆性為耐鹽性； 所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。
10.如權利要求8或9所述的方法，其特征在于:所述雙子葉植物為擬南芥。
全文摘要
本發明公開了一種榆錢菠菜轉錄活性蛋白AhPHD1及其編碼基因與應用。該蛋白命名為AhPHD1，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的序列2；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與植物耐逆性相關的蛋白質。本發明的實驗證明，該榆錢菠菜蛋白及其編碼基因可用于培育耐逆植物品種特別是耐鹽雙子葉植物品種。
文檔編號C07K14/415GK103204913SQ20121000989
公開日2013年7月17日 申請日期2012年1月13日 優先權日2012年1月13日
發明者張勁松, 陳受宜, 陶建軍, 張萬科, 林晴, 馬彪 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所