專利名稱：在制備抗毒素、抗血清中滅活病毒的方法
技術領域：
本發明涉及一種在制備抗毒素、抗血清過程中同時滅活病毒的方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
抗毒素、抗血清(Antitoxin/Antiserum)是指采用特定的抗原免疫動物后，再收集高效價免疫血清，并經過提取、純化后，制備出含完整抗體(IgG)或抗體片段[F(ab’ )2]的免疫球蛋白制品。以用于預防和治療各相應疾病引起的感染。由于抗毒素、抗血清原料來源于馬匹，而馬匹又飼養在開放的環境中，其可能攜帶的病毒較多，因而該制品存在生物安全性問題。為了保證該制品的安全性，除要控制免疫馬匹飼養環境和原料血漿質量外，在抗毒素、抗血清生產過程中，如何有效除去或滅活原料血漿中的病毒，是獲得安全可靠的抗毒素、抗血清等血液制品的關鍵問題。目前國內外較為成熟的病毒滅活/去除方法有巴氏消毒法、干熱法、有機溶劑/ 去污劑法、納米膜過濾法、光化學法等，但對于動物源性生化提取制品，尤其是規模化生產的抗毒素、抗血清的滅活病毒工藝，國內外至今未見報道。巴氏消毒法和干熱法屬熱力處理滅活病毒方法，即通過熱力使病毒蛋白變性，以破壞病毒結構從而滅活病毒，但同時熱力也存在會使蛋白制品變性或生物活性降低的問題，故采用上述兩種方法滅活病毒時，常需在蛋白制品中加入保護劑，但同時保護劑在保護蛋白制品的同時也保護了病毒，降低了病毒滅活率，從而加大了病毒滅活的難度。納米膜過濾法主要利用病毒顆粒與蛋白分子的大小差異，通過納米級的濾膜把病毒除去，但只適于小分子(直徑較小)的蛋白制品，不適于大分子(較大直徑)的蛋白制品，且納米膜價格昂貴。 光化學法是利用某些光敏劑對病毒表面及病毒核酸結構具有強烈的親和作用，在適當波長的光照下易激活，從而通過光化學作用破壞與其接觸的病毒結構的方法，但該方法對一些蛋白活性損傷較大。有機溶劑/去污劑法是利用有機溶劑和去污劑的配伍，破壞病毒的脂質包膜，使其失去傳染性，從而達到滅活病毒的目的。該方法有很好的蛋白質兼容性，能有效滅活病毒，且對蛋白的結構和功能的影響甚微，但如何從制品中除去加入的有機溶劑和去污劑，則是該方法最大的難點。
發明內容
針對現有生物制品中病毒滅活或去除存在的操作時間長，容易造成活性物質失活，病毒滅活不徹底，適用范圍受限等不足，本發明提供一種簡單、快速、經濟、適用范圍廣的，能在制備抗毒素、抗血清過程中，同時滅活存在于血液中的病毒的方法，以保證抗毒素、 抗血清制品能夠更安全有效地應用于臨床。本發明解決其技術問題所采用的技術方案是一種在制備抗毒素、抗血清中滅活病毒的方法，其特征在于包括下列步驟A、將血漿原料稀釋2 4倍體積后，調節稀釋液pH值至2.8 4. 0 ；
B、在每IOOml步驟A的稀釋液中，加入0.1 l.Og胃酶，于四 311下消化1 3小時，或者于20 22°C下消化20 22小時，得消化液；
C、在每IOOml步驟B的消化液中，加入14 16g硫酸銨，并調節混合液pH值至4. 8 5. 6，加熱混合液至57 59°C，并保持30分鐘，降溫至45 °C以下，分離，得上清液；
D、將步驟C的上清液稀釋至所含蛋白濃度為10 50g/L，在該稀釋液中加入有機溶劑和去污劑，直至每IOOml稀釋液中含有0. 25 1. 35g的有機溶劑，每IOOml稀釋液中含有 1. 00 1. 35g的去污劑，于M 37°C水浴中恒溫4 6小時，得混合液；
E、在每IOOml步驟D的混合液中，加入15 25g硫酸銨，靜置90 180分鐘，分離去上清液，得沉淀物；
F、將步驟E的沉淀物稀釋至蛋白含量低于20g/L,調整稀釋液pH值為7. 7 7. 9，并按每IOOml稀釋液加入0. 6 1. Og明礬的量，在稀釋液中加入明礬，靜置60 120分鐘后， 過濾得上清液；
G、將步驟F的上清液用3 5萬分子量的濾膜，濃縮至五分之一體積時，在濃縮液中加入20mM、pH值為6. 0 8. 0、加入量是步驟A的原料血漿體積的2 5倍的PB進行置換、 濃縮，直至硫酸銨含量低于1. 0 g/L，得濃縮液；
H、將步驟F的濃縮液，經離子交換層析后，得收集液，按常規對收集液進行除菌、過濾后，分裝得滅活病毒的抗毒素、抗血清制品。所述步驟A、D、F的稀釋是采用注射用水或者質量濃度為0. 8 1. 0%的NaCL溶液進行稀釋的。所述步驟A的稀釋液PH值是用1 4N的鹽酸溶液調整的，酸濃度過大，則會使pH 值的精確控制變為困難，酸濃度太小時，又會增加溶液(體積)的加入量，使待處理的制品濃度過稀。所述步驟C的混合液PH值、步驟F的稀釋液是用1 4N的氫氧化鈉溶液調整的， 堿濃度過大，則會使PH值的精確控制變為困難，堿濃度太小時，又會增加過量(體積)的溶液，使待處理的制品濃度過稀。所述步驟D的有機溶劑為醫用級的磷酸三丁酯；去污劑為醫用級的聚山梨酯-80 或"Triton X-100中的一種，其中聚山梨酯_80終濃度為每IOOml稀釋液中含有1.00 1. 35g的聚山梨酯-80，Triton X-100終濃度為每IOOml稀釋液中含有1. 00 1. 35g的 Triton X-IOO0所述步驟H的離子交換層析的介質為Q Sepharose Fast Flow ,DEAE Sepharose Fast Flow中的一種陰離子交換劑。所述抗血清制品包括破傷風抗毒素、抗狂犬病血清或抗蛇毒血清。本發明具有下列優點和效果采用上述方案，能在制備抗毒素、抗血清過程中，用有機溶劑和去污劑破壞病毒的脂質包膜，使其失去傳染性，從而徹底滅活血漿中殘留的病毒，同時保持蛋白的結構和功能，之后再用離子交換層析，有效除去有機溶劑和去污劑的殘留，使制品純度進一步提高，因為所選用的有機溶劑及去污劑為非離子型，不會與離子交換劑結合，而制品中的蛋白則能與離子交換劑結合，從而使有機溶劑和去污劑與蛋白完全分離，之后再在離子交換分離清洗過程中，除去有機溶劑和去污劑，不僅病毒滅活操作簡單，處理時間短，經濟實用，而且所得制品純度高、安全性好。本發明作了經離子交換層析后TNBP、Trit0n X-100殘留量實驗，實驗結果見表1。表1
樣品殘鑿靈(ug/ml)TIBPTriton X-10020100901201009022010C903201009012010090220100903屋析液2.22. 22.4碰出未檢出
從表中可見，經離子交換層，TNBP, Triton X_100殘留量均低于限定值，即 TNBP 彡 10ug/ml, Triton X-100 彡 10ug/ml。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發明作更詳細的介紹。實施例1
在制備破傷風抗毒素中滅活病毒的方法，包括下列步驟
A、將馬血漿原料用注射用水稀釋2倍體積后，用IN的鹽酸溶液調節稀釋液pH值至
2. 8 ；
B、在每IOOml步驟A的稀釋液中，加入0.Ig胃酶，于下消化3小時，得消化液；
C、在每IOOml步驟B的消化液中，加入14g硫酸銨，并用IN的氫氧化鈉溶液調節混合液PH值至4. 8，加熱混合液至57°C，并保持30分鐘，降溫至45°C以下，分離，得上清液；
D、將步驟C的上清液用注射用水稀釋至所含蛋白濃度為10g/L，在該稀釋液中加入醫用級有機溶劑磷酸三丁酯和醫用級去污劑Triton X-100，直至每100ml稀釋液中含有磷酸三丁酯0. 25g，每100ml稀釋液中含有1. 00g Triton X-100，于水浴中恒溫6小時，得混合液；
E、在每100ml步驟D的混合液中，加入15g硫酸銨，靜置90分鐘，分離去上清液，得沉淀物；
F、將步驟E的沉淀物用注射用水稀釋至蛋白含量低于20g/L，用IN氫氧化鈉溶液調整稀釋液PH值為7. 7，并按每100ml稀釋液加入0. 6g明礬的量，在稀釋液中加入明礬，靜置 120分鐘后，過濾得上清液；
G、將步驟F的上清液用3萬分子的濾膜，濃縮至五分之一體積時，在濃縮液中加入 20mM、pH值為7. 0、加入量是步驟A的馬原料血漿體積的2倍的PB進行置換、濃縮，直至硫酸銨含量低于1. 0 g/L，得濃縮液；
H、將步驟F的濃縮液，經過其上裝有介質為QSepharose Fast Flow陰離子交換劑的離子交換層析后，得收集液，按常規對收集液進行除菌、過濾后，分裝得滅活病毒的破傷風抗毒素制品。實施例2
在制備抗狂犬病血清中滅活病毒的方法，包括下列步驟
A、將血漿原料用注射用水稀釋4倍體積后，用4N鹽酸溶液調節稀釋液pH值至4.0；
B、在每100ml步驟A的稀釋液中，加入Ig胃酶，于31°C下消化1小時，得消化液；
5C、在每IOOml步驟B的消化液中，加入16g硫酸銨，并用4N的氫氧化鈉溶液調節混合液PH值至5. 6，加熱混合液至59°C，并保持30分鐘，降溫至45 °C以下，分離，得上清液；
D、將步驟C的上清液用注射用水稀釋至所含蛋白濃度為50g/L，在該稀釋液中加入醫用級有機溶劑磷酸三丁酯和醫用級去污劑Triton X-100，直至每IOOml稀釋液中含有磷酸三丁酯1.35 g，每IOOml稀釋液中含有1.35g Triton X-100，于37°C水浴中恒溫4小時，得混合液；
E、在每IOOml步驟D的混合液中，加入25g硫酸銨，靜置180分鐘，分離去上清液，得沉淀物；
F、將步驟E的沉淀物用注射用水稀釋至蛋白含量低于20g/L，用4N氫氧化鈉溶液調整稀釋液PH值為7. 9，并按每IOOml稀釋液加入1. Og明礬的量，在稀釋液中加入明礬，靜置 60分鐘后，過濾得上清液；
G、將步驟F的上清液用5萬分子的濾膜，濃縮至五分之一體積時，在濃縮液中加入 30mM、pH值為7. 6、加入量是步驟A的原料血漿體積的5倍的PB進行置換、濃縮，直至硫酸銨含量低于1.0g/L，得濃縮液；
H、將步驟F的濃縮液，經過其上裝有介質為DEAESepharose Fast Flow陰離子交換劑的離子交換層析后，得收集液，按常規對收集液進行除菌、過濾后，分裝得滅活病毒的抗狂犬病血清制品。 實施例3
在制備抗蛇毒血清中滅活病毒的方法，包括下列步驟
A、將血漿原料用質量濃度為0.8%的NaCL溶液稀釋3倍后，用3N鹽酸溶液調節稀釋液 pH值至3. 2 ；
B、在每IOOml步驟A的稀釋液中，加入0.5 g胃酶，于20°C下消化22小時，得消化液；
C、在每IOOml步驟B的消化液中，加入15g硫酸銨，并用3N的氫氧化鈉溶液調節混合液PH值至5. 0，加熱混合液至57°C，并保持30分鐘，降溫至45°C以下，分離，得上清液；
D、將步驟C的上清液用質量濃度為0.8%的NaCL溶液稀釋至所含蛋白濃度為25 g/ L，在該稀釋液中加入醫用級有機溶劑磷酸三丁酯和醫用級去污劑聚山梨酯-80，直至每 IOOml稀釋液中含有磷酸三丁酯0.85 g，每IOOml稀釋液中含有1. 20 g聚山梨酯-80，于
水浴中恒溫5小時，得混合液；
E、在每IOOml步驟D的混合液中，加入18g硫酸銨，靜置100分鐘，分離去上清液，得沉淀物；
F、將步驟E的沉淀物用質量濃度為0.8%的NaCL溶液稀釋至蛋白含量低于20 g/L，用 3N氫氧化鈉溶液調整稀釋液pH值為7. 8，并按每IOOml稀釋液加入0. 8 g明礬的量，在稀釋液中加入明礬，靜置100分鐘后，過濾得上清液；
G、將步驟F的上清液用5萬分子的濾膜，濃縮至五分之一體積時，在濃縮液中加入 25mM、pH值為7. 4、加入量是步驟A的原料血漿體積的3倍的PB進行置換、濃縮，直至硫酸銨含量低于1.0 g/L，得濃縮液；
H、將步驟F的濃縮液，經過其上裝有介質為QSepharose Fast Flow陰離子交換劑的離子交換層析后，得收集液，按常規對收集液進行除菌、過濾后，分裝得滅活病毒的抗蛇毒血清制品。
實施例4
在制備抗蛇毒血清中滅活病毒的方法，包括下列步驟
A、將血漿原料用質量濃度為1.0%的NaCL溶液稀釋3倍后，用3N鹽酸溶液調節稀釋液 pH值至3.6 ；
B、在每IOOml步驟A的稀釋液中，加入0.7 g胃酶，于22°C下消化20小時，得消化液；
C、在每IOOml步驟B的消化液中，加入15g硫酸銨，并用3N的氫氧化鈉溶液調節混合液PH值至5. 0，加熱混合液至57°C，并保持30分鐘，降溫至45°C以下，分離，得上清液；
D、將步驟C的上清液用質量濃度為1.0%的NaCL溶液稀釋至所含蛋白濃度為35g/ L，在該稀釋液中加入醫用級有機溶劑磷酸三丁酯和醫用級去污劑聚山梨酯-80，直至每 IOOml稀釋液中含有磷酸三丁酯0. 90 g，每IOOml稀釋液中含有1.20 g聚山梨酯-80，于 25°C水浴中恒溫5小時，得混合液；
E、在每IOOml步驟D的混合液中，加入20g硫酸銨，靜置100分鐘，分離去上清液，得沉淀物；
F、將步驟E的沉淀物用質量濃度為1.0%的NaCL溶液稀釋至蛋白含量低于20 g/L，用 3N氫氧化鈉溶液調整稀釋液pH值為7. 8，并按每IOOml稀釋液加入0. 8 g明礬的量，在稀釋液中加入明礬，靜置100分鐘后，過濾得上清液；
G、將步驟F的上清液用5萬分子的濾膜，濃縮至五分之一體積時，在濃縮液中加入 25mM、pH值為7. 2、加入量是步驟A的原料血漿體積的4倍的PB進行置換、濃縮，直至硫酸銨含量低于1.0 g/L，得濃縮液；
H、將步驟F的濃縮液，經過其上裝有介質為QSepharose Fast Flow陰離子交換劑的離子交換層析后，得收集液，按常規對收集液進行除菌、過濾后，分裝得滅活病毒的抗蛇毒血清制品。為表明本發明在制備抗毒素、抗血清過程中，徹底滅活血漿中殘留的病毒的滅活效果，下面通過檢測實例加以驗證，其中滅活效果的檢測是依據國藥監注[2002]第160號文進行的
A)各取三批馬血漿樣品用注射用水稀釋至3倍體積，分別加入水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV，滴度為8. 0 TCID50/ml)和脊髄灰質炎病毒 (P0li0Virus，PV-l，滴度為9.0 TCID50/ml)為指示病毒，Vero細胞為病毒檢測用細胞。按實施例1的方法制得滅活病毒的破傷風抗毒素制品；
B)同時留存部分病毒作對照；
C)病毒檢測
采用96孔培養板微量法培養4天觀察，用Karber法計算病毒滴度，以評估滅活病毒的效率。病毒滅活驗證方案設未處理的含病毒的陽性對照、S/D系統空白對照(含病毒)，無病毒陰性對照，驗證結果見表2。注每組數據重復測定兩次，取平均值。驗證結論在本發明方法中，有機溶劑/去污劑(S/D)處理0.5h、1.0h、2.0h和 4. Oh后，可分別將樣品中8.5 logs的水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV)和9.0 logs的脊髄灰質炎病毒(Poliovirus，PV-I )降到2. 0 3. 0 logs，且重復三次檢測數據相近，根據國藥監注[2002]160號文的規定，認定本方法為有效的病毒滅活方法。為有效保證抗毒素、抗血清的質量及其安全性，按本發明實施例1連續生產的三批破傷風抗毒素制品進行檢測，檢測結果見表3。表2S/D法滅活病毒工藝驗證結果
權利要求
1.一種在制備抗毒素、抗血清中滅活病毒的方法，其特征在于包括下列步驟A、將血漿原料稀釋2 4倍體積后，調節稀釋液pH值至2.8 4. 0 ；B、在每IOOml步驟A的稀釋液中，加入0.1 l.Og胃酶，于四 311下消化1 3小時，或者于20 22°C下消化20 22小時，得消化液；C、在每IOOml步驟B的消化液中，加入14 16g硫酸銨，并調節混合液pH值至4. 8 5. 6，加熱混合液至57 59°C，并保持30分鐘，降溫至45 °C以下，分離，得上清液；D、將步驟C的上清液稀釋至所含蛋白濃度為10 50g/L，在該稀釋液中加入有機溶劑和去污劑，直至每IOOml稀釋液中含有0. 25 1. 35g的有機溶劑，每IOOml稀釋液中含有 1. 00 1. 35g的去污劑，于M 37°C水浴中恒溫4 6小時，得混合液；E、在每IOOml步驟D的混合液中，加入15 25g硫酸銨，靜置90 180分鐘，分離去上清液，得沉淀物；F、將步驟E的沉淀物稀釋至蛋白含量低于20g/L,調整稀釋液pH值為7. 7 7. 9，并按每IOOml稀釋液加入0. 6 1. Og明礬的量，在稀釋液中加入明礬，靜置60 120分鐘后， 過濾得上清液；G、將步驟F的上清液用3 5萬分子量的濾膜，濃縮至五分之一體積時，在濃縮液中加入20mM、pH值為6. 0 8. 0、加入量是步驟A的原料血漿體積的2 5倍的PB進行置換、 濃縮，直至硫酸銨含量低于1.0 g/L，得濃縮液；H、將步驟F的濃縮液，經離子交換層析后，得收集液，按常規對收集液進行除菌、過濾后，分裝得滅活病毒的抗毒素、抗血清制品。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟A、D、F的稀釋是采用注射用水或質量濃度為0. 8 1. 0%的NaCl溶液進行稀釋的。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟A的稀釋液pH值、步驟C的混合液 PH值，是用1 4N的鹽酸溶液調整的。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟F的稀釋液pH值是用1 4N的氫氧化鈉溶液調整的。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟D的有機溶劑為醫用級的磷酸三丁酯；去污劑為醫用級的聚山梨酯-80或Triton X-100中的一種，其中聚山梨酯_80終濃度為每IOOml稀釋液中含有1. 00 1. 35g的聚山梨酯-80, Triton X-100終濃度為每IOOml 稀釋液中含有1. 00 1. 35g的Triton X-IOO0
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟H的離子交換層析的介質為Q Sepharose Fast Flow、DEAE Sepharose Fast Flow 中的一種陰離子交換劑。
全文摘要
本發明提供一種在制備抗毒素、抗血清中滅活病毒的方法，它將原料馬血漿稀釋并經胃酶消化、加溫變性去沉淀后，加入有機溶劑和去污劑進行病毒滅活，再經硫酸銨鹽析分離、明礬吸附、超濾濃縮/脫鹽、離子交換層析得收集液，經除菌過濾后，分裝得制品。通過有機溶劑和去污劑破壞病毒的脂質包膜，使其失去傳染性，從而徹底滅活血漿中殘留的病毒，同時保持蛋白的結構和功能，之后再有效除去有機溶劑和去污劑的殘留，使制品純度進一步提高，不僅病毒滅活操作簡單，處理時間短，經濟實用，而且所得制品純度高、安全性好。
文檔編號C07K16/06GK102532306SQ201210004548
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月9日 優先權日2012年1月9日
發明者吳笛, 楊冬, 羅靖雄 申請人:玉溪九洲生物技術有限責任公司