通過刪除由nkt細胞識別的表位來調整抗原免疫原性的制作方法

通過刪除由nkt細胞識別的表位來調整抗原免疫原性的制作方法
【專利摘要】本發明描述了一種方法和化合物，其用于阻止針對外源因子、針對用于基因療法和基因接種的病毒載體、針對受治療者天然暴露的蛋白質、針對基因修飾的有機體和針對與用于變應性或傳染性疾病的疫苗施用有關的不希望的效應的免疫應答。
【專利說明】通過刪除由NKT細胞識別的表位來調整抗原免疫原性
【技術領域】
[0001]本發明涉及降低天然免疫原性或誘發耐受性的肽或多肽，和其在阻止針對外源因子(allofactors)、用于基因療法或基因接種的病毒載體、用于食品或飼料的環境抗原而誘發的免疫應答或受治療者通過吸入或接觸暴露的免疫應答，或誘發以降低與由變應原或傳染劑接種相關的副作用的免疫應答中用途。
【背景技術】
[0002]在許多情況下，用于治療目的的蛋白質施用導致針對治療性藥的免疫應答，其阻礙所述治療性藥的任何進一步施用。這樣的實例由受血友病A影響的受治療者中凝血途徑的VIII因子的施用提供:約三分之一的接受治療者產生抑制VIII因子作用的抗VIII因子抗體。在罹患糖原代謝缺陷的受治療者中對酶類如α半乳糖苷酶的施用同樣地帶來阻止任何進一步施用的針對治療性藥的免疫應答。第三實例由用作治療性藥和針對淋巴細胞表面分子、細胞因子或細胞因子受體使用的抗體提供。總的說來，高度需要發現阻止抗治療性藥的免疫的新治療方法。
[0003]病毒載體用于基因療法或基因接種的用途受以下事實的嚴格限制:這種病毒載體誘出的免疫應答，其導致由載體轉導的細胞迅速消除和轉基因表達的迅速損耗。取決于病毒載體的性質，病毒載體誘出具有可變程度的強度的先天性和適應性免疫應答的激活。因此，腺病毒載體強烈地刺激先天性免疫應答，其后是適應性免疫應答。腺相關病毒載體觸發較弱先天性應答，但誘出抗體產生。基因療法和基因接種的可能性是巨大的。先天性和/或適應性應答通過其來針對病毒載體的治療方法將在本領域表現高度顯著的進展。
[0004]許多受治療者受到誘出以抵抗他們天然暴露的蛋白質的應答困擾。變應原(空氣傳播的或來自食品)誘出諸如變應性鼻炎和哮喘、蕁麻疹、濕疹和過敏性反應之類的反應。至于為什么所述受治療者呈 現這種反應的原因僅被部分地解釋。降低以下的天然免疫原性將是十分有益的:蛋白質，諸如各種各樣的食物變應原；導致乳糜瀉的小麥；或受治療者出于職業原因而暴露的諸如酶類的產物。
[0005]在用于變應性疾病或抗傳染劑的接種策略中，治療功效經常受副作用限制，所述副作用由變應原或傳染劑的促炎性質誘出。這種炎性效應妨礙更高劑量的疫苗的使用，并因此妨礙疫苗功效，并且使免疫應答適應無用的細胞應答，諸如遲發型反應，以及適應對所考慮狀況不是最理想的同種型的抗體的產生。對接種中炎癥的更佳控制將提供對免疫應答的更加有效調整，同時降低與發炎有關的副作用。
[0006]自然殺傷T(NKT)細胞構成識別由非經典MHC絡合分子⑶Id呈現的抗原的非常規T淋巴細胞的不同譜系。現在描述NKT細胞的兩個亞型。I型NKT細胞，也稱為不變NKT細胞(iNKT)，是最豐富的。它們的特征在于，存在由不變α鏈(小鼠中的Va 14和人中的V a 24)構成的α-β T細胞受體(TCR)。該α鏈與變量相關，但限制β鏈的數量。2型NKT細胞具有a-PTCR，但攜帶多態α鏈。然而，顯而易見的是存在NKT細胞其它亞型，其表型仍未完全定義，但其特征為由在CDld分子的背景下呈現的糖脂激活。[0007]NKT細胞一般表達自然殺傷(NK)細胞受體(包括NKG2D和NKl.1)的組合。NKT細胞是先天免疫系統的一部分，其可以區別于適應性免疫系統，實際上它們在得到完全效應子能力之前不需要擴張。NKT細胞的激活導致各種效應。這種細胞釋放預形成介體，包括幫助B細胞產生抗體的一大列細胞因子(包括中間白細胞素(IL)-4，干擾素(IFN)-Y，IL-21和IFN-α )，并且有人提出細胞因子的釋放也可影響⑶4+T細胞(Burrows等人，NatureImmunology2009,10:669-671)。在本發明中，認為對B細胞激活和主要組織相容性(MHC)II類限制性CD4+T細胞激活的預防在降低或消除蛋白免疫原性中起作用。
[0008]用于NKT細胞的識別單元(⑶Id分子)具有與MHC I類分子極其類似的結構，包括β-2微球蛋白的存在。其特征為毗連兩個α鏈的很深裂隙并且含有接收脂質鏈的高度疏水的殘基。該裂隙在兩個末端開放，允許容納較長鏈。用于CDld的規范配位體是合成的α半乳糖酰基鞘氨醇(a GalCer)。然而，已經描述了許多自然替代性配位體，包括糖脂和磷脂，該自然脂質硫脂發現于髓鞘質、微生物磷酸肌醇甘露糖苷和α半乳糖醛酸神經酰胺中。目前的共識(參見綜述，諸如Matsuda等人，Current Opinion in Immunology 2008，20:358-368 和 Godfrey 等人，Nature reviews Immunology 2010,11:197-206)在于，CDld僅結合含脂質鏈的配位體，或通常由被嵌入CDld中的脂質尾部和從CDld中伸出的糖類殘基首基構成的常見結構。
[0009]不認為肽能夠通過⑶Id的呈現激活NKT細胞。然而，有人提出，含龐大氨基酸殘基的長疏水肽可以結合至CDlcKCastano等人，Science 1995,269:223-226)。使用表達具有未定義的生理相關性的隨機序列肽的噬菌體呈現文庫進行的觀察，允許確立理論共有基序(Castano 等人，Science 1995，269:223-226 并且參見下文)。
[0010]實際上，Castano等人表明，激活的細胞是⑶8+T細胞，也就是MHC I類限制性細胞，而不是NKT細胞。這些發 現教導本領域技術人員不存在疏水肽由⑶Id分子呈現的證據。因在常規免疫方案下不能誘出NKT細胞，Castano等人宣稱的生理相關性被進一步懷疑(Matsuda 等人，Current Opinion in Immunology2008,20:358-368 and BrutkiewiczJournal of Immunology2006，177:769-775)。諸如用被轉染以過表達CDld并在體外加載卵清蛋白衍生肽的細胞進行免疫的人工系統能夠誘出NKT細胞。同樣地，用質粒DNA以及鼠CDld和共刺激分子進行的真皮內免疫誘發溶細胞CDld限制性T細胞(Lee等人，Journalof Experimental Medicine 1998,187:433-438)。Castano 等人宣稱，含由 Pl 位和 P7 位的芳族殘基和P4位的脂族鏈構成的結構基序的疏水妝含有用于CDld結合表位的核心基序。如上所述，Castano等人達成的該結論不受數據支持。
[0011]我們出乎意料地發現，包圍疏水氨基酸序列的肽實際上能夠誘出NKT細胞的激活。
[0012]如果來自用于治療性目的而施用，或受治療者通常暴露的，或在進行基因療法或基因接種時而施用，或在用于變應性或傳染性疾病的接種的背景下而施用的蛋白的表位結合至CDld并因此激活NKT細胞，則突變所致所述蛋白的變化和/或消除所述表位的刪除將是阻止免疫原性非常需要的。
[0013]鑒別這種表位，隨后突變、添加或刪除氨基酸以阻止NKT細胞激活形成本發明的基礎。
[0014]發明概述[0015]本發明涉及肽或多肽用于通過阻止針對外源因子的免疫應答治療受治療者中針對所述外源因子誘出的這種免疫應答的用途。
[0016]本發明還涉及肽或多肽用于通過阻止針對用于基因療法或基因接種的病毒載體的免疫應答治療受治療者中針對所述病毒載體誘出的免疫應答的用途。
[0017]本發明還涉及由基因修飾的有機體制備的肽或多肽用于在受治療者中阻止通過暴露于天然蛋白質而誘出的免疫應答的用途。
[0018]本發明還涉及肽或多肽在先天性免疫性的激活是有害時用于接種目的的用途。
[0019]本發明還涉及鑒別攜帶⑶Id結合表位的蛋白質和通過氨基酸取代或刪除消除這種表位的方法。
[0020]我們意外發現，顯著比例的肽或多肽攜帶允許它們結合用于激活天然殺傷T(NKT)細胞的CDld決定子和由其呈現的氨基酸序列。這種細胞的激活導致細胞因子的釋放，并且在一些情況下，導致獲得或增加溶細胞性。
[0021]在一個方面，本發明涉及至少一種分離肽或多肽用作外源因子的用途，所述肽或多肽已經被修飾以消除涉及由NKT細胞識別的表位的形成的至少一種疏水的氨基酸殘基，用作在受治療者中阻止對所述外源因子的免疫應答的藥物的用途。
[0022]在一個方面，本發明還涉及至少一種分離肽或多肽用作用于基因療法或基因接種的病毒載體的用途，所述肽或多肽已經被修飾以消除涉及由NKT細胞識別的表位的形成的至少一種疏水的氨基酸殘基，用作在受治療者中阻止對所述病毒載體的免疫應答的藥物的用途。
[0023]在一個方面，本發明還涉及由基因修飾的有機體產生的至少一種分離肽或多肽的用途，所述肽或多肽被修飾以消除涉及由NKT細胞識別的表位的形成的至少一種疏水的氨基酸殘基，用作在受治療者中阻止針對天然暴露于所述肽或多肽的免疫應答的藥物的用途。
[0024]在一個方面，本發明還涉及至少一種分離肽或多肽用作疫苗的用途，所述肽或多肽已經被修飾以消除涉及由NKT細胞識別的表位的形成的至少一種疏水的氨基酸殘基，用作在受治療者中阻止對所述疫苗的無用或不適當的免疫應答的藥物的用途。
[0025]在另一方面，本發明還涵蓋至少一種分離肽或多肽用作外源因子、病毒載體、基因修飾的有機體或疫苗的用途，所述肽或多肽已經被修飾以消除涉及由NKT細胞識別的表位的形成的至少一種疏水的氨基酸殘基，用作在受治療者中阻止激活、細胞因子產生、對由所述受治療者中CD4+NKT細胞攜帶的適應性免疫應答的溶細胞活性和抑制活性的藥物的用途。
[0026]本發明涉及包含至少一個CDld限制性T細胞表位的疏水的肽或多肽，其中定位為CDld的錨定殘基的氨基酸被替代性氨基酸替換，或被刪除，這導致對CDld的結合喪失或顯著減小并且因此導致NKT細胞激活 喪失或顯著減小。
[0027]CDld分子的結構表明，需要疏水的氨基酸殘基占據位于CDld裂隙的末端處的兩個疏水袋，并且脂族殘基應該占據所述裂隙中間的位置。因此，作為CDld結合序列的一般示例，可以使用基序[FW]-XX-[ILM]-XX-[FWTH]，其中[FW]表明F或W可以占據第一錨定殘基(P1)，P4位可以由1、L或M占據并且P7可以由F、W、T或H占據。在此一般模型基序中X代表任何氨基酸。對于本領域技術人員而言，應該清楚的是，這些氨基酸殘基的各種組合是可能的。在具體實施方案中，該一般模型基序可以作為反向序列如[FWTH]-XX-[ILM]-XX-[FW]呈現。在另一具體實施方案中，將至少一個氨基酸加入CDld結合基序內，所述氨基酸干擾該基序，阻礙其結合到CDld的能力并因此阻礙其激活NKT細胞的能力。
[0028]本發明更具體來說還涉及肽或多肽，其中Pl位和P7位中的F、W、T、H或Y被非天然氨基酸(例如D氨基酸)或有機化合物替換。
[0029]在任何上述用途中，所述外源因子可以是用于以下的任何肽或多肽:(1)凝血缺陷或纖維蛋白溶解缺陷的替換療法，包括VDI因子、IX因子和葡萄球菌激酶；(2)激素，例如生長激素或胰島素；(3)細胞因子和增長因子，例如干擾素-α，干擾素-Y，GM-CSF和G-CSF ； (4)用于調整免疫應答的抗體，包括在變應性疾病中的抗IgE抗體，在移植物排斥和各種各樣的自身免疫疾病中的抗CD3和抗CD4抗體，在非霍奇金氏淋巴瘤中的抗CD20抗體；(5)腎機能不全中的促紅細胞生成素和；(6)基因修飾過的抗原。
[0030]在任何上述用途中，所述病毒載體可以是RNA病毒(Y-逆轉錄病毒和慢病毒)或DNA病毒(腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒和痘病毒類)的任何肽或多肽。
[0031 ] 在任何上述用途中，所述基因修飾的有機體可以是植物或動物來源的任何有機體，其用作食用或飼料，用于生產農作物或制造材料，或用于生產食物或飼料、或畜牧業用轉基因動物。
[0032]在任何以上所述中，用于接種的所述肽或多肽可以來自變應原或來自傳染劑，包括病毒、細菌和寄生蟲。變應原可以是空氣傳播的變應原，例如衍生自房塵螨、來自花粉或來自家畜那些，食物變應原例如花生、卵清蛋白、谷物、水果和豆類，以及接觸性抗原例如膠乳。特征為變應原敏化的疾病包括變應性哮喘、變應性鼻竇炎、過敏性休克、蕁麻疹、特應性皮炎和接觸性皮炎。
[0033]本發明還涉及用于鑒別激活NKT細胞的肽或多肽和通過取代、添加或刪除氨基酸來改變CDld結合表位以消除這種激活的方法。所述方法包含以下步驟:用攜帶CDld的細胞培育所述肽或多肽，隨后添加多克隆`NKT細胞群并且確定所述NKT細胞的激活。
[0034]本發明還涵蓋分離的病毒載體，其特征在于它們包含通過取代或刪除至少一個疏水的氨基酸來修飾的外源因子的至少一個肽或多肽，或通過取代或刪除至少一個疏水的氨基酸殘基來修飾的變應原或傳染劑的至少一個肽或多肽。應當理解的是，病毒載體其自身也可通過取代或刪除疏水的氨基酸殘基被修飾。
[0035]定義
[0036]術語"肽"在本文中使用時是指包含由肽鍵連接的2至200個氨基酸的氨基酸序列，但其在具體實施方案中可以包含非氨基酸結構(如連接性有機化合物)。本發明的肽可以含有任何常規的20個氨基酸或它們的修飾物，或可以含有通過化學肽合成或化學或酶修飾摻入的非天然氨基酸。術語“多肽”當在本文中使用時是指通常較長的肽或蛋白質。
[0037]術語"表位"當在本文中使用時是指蛋白質的一個或若干個部分(其可以限定構象表位)，其由抗體或其一部分(Fab'、Fab2'等)或B或T細胞淋巴細胞的細胞表面上呈現的受體特異性識別和結合，并且其能夠通過所述結合而誘發免疫應答。
[0038]術語"抗原"當在本文中使用時是指包含一個或多個半抗原和/或包含一個或多個T細胞表位的大分子結構。一般而言，所述大分子是蛋白質或肽(具有或沒有多糖)或由蛋白成分構成并且包含一個或多個表位；所述大分子在本文可替換地稱為"抗原性蛋白質"或“抗原性肽”。
[0039]術語”變應原”是指抗原的特定亞型，特征為其在易感染個體中誘出IgE同種型的抗體的能力。
[0040]在本發明的背景下術語"T細胞表位"或“T-細胞表位”是指優勢、次優勢或次要T細胞表位，即，被T淋巴細胞的細胞表面上的受體特異性識別并且結合的抗原性蛋白質的一部分。表位是否為優勢、亞優勢或次要，取決于針對表位誘出的免疫反應。優勢取決于蛋白質的所有可能T細胞表位中，這種表位被T細胞識別并且能夠激活所述T細胞的頻率。特別地，T細胞表位是由MHC I類或MHC II類分子結合的表位。
[0041]術語“NKT細胞表位”是指被T淋巴細胞的細胞表面上的受體特異性識別并且結合的抗原性蛋白質的一部分。特別地，NKT細胞表位是由CDld分子結合的表位。
[0042]術語“⑶4+效應子細胞”是指屬于T-細胞的⑶4-陽性亞型的細胞，其功能為向其它細胞例如B-細胞提供協助。這些效應子細胞通常作為Th細胞(T協助細胞)報告，具有不同的亞型，例如ThO、Thl、Th2和Thl7細胞。
[0043]術語“NKT細胞”是指先天性免疫系統的細胞，其特征為實際上它們攜帶諸如NKl.1和NKG2D的受體，并且識別由⑶Id分子呈現的表位。在本發明的背景下，NKT細胞可以屬于I型(不變)或2型亞型。
[0044]“⑶Id分子”是指由3 α鏈和β鏈的一個逆平行組構成的非MHC衍生分子，所述β鏈被布置到在兩側開放的深疏水凹槽中，所述非MHC衍生分子能夠向NKT細胞呈現脂質、糖脂或疏水肽。
[0045]術語"免疫紊亂"或"免疫疾病"是指這樣的疾病，其中免疫系統的反應對有機體中功能失常或非生理性情況負責或者維持所述功能失常或非生理性情況。在本發明的背景下，免疫紊亂是指由傳染劑和腫瘤監視誘發的病理學。
`[0046]術語“外源因子”是指當在相同物種的兩個個體之間進行比較時呈現多態性的蛋白質、肽或因子(即任何分子)，且更一般說來，是在接受外源因子的受治療者中誘發(同種異體反應性)免疫應答的任何蛋白質、肽或因子。通過延伸，外源因子還包括用于飼養的基因修飾的蛋白質。
[0047]術語“異體抗原”或“異體移植抗原”當在本文中使用時是指衍生自(脫落自和/或呈現于)細胞或組織中的抗原，當從供體轉移到接受者時，其可以被受體的B或T-細胞受體的抗體識別和結合。異體抗原一般是多態基因的產物。異體抗原是蛋白質或肽，當在供體和受體(屬于相同物種)之間比較時，其呈現輕微結構差異。在接受者的身體內這種供體抗原的存在可以誘出接受者中的免疫應答。這種同種異體反應性免疫應答是對異體抗原特異性的。
[0048]發明詳述
[0049]本發明提供在受治療者中阻止針對外源因子、針對用于基因療法或基因接種的病毒載體、針對用于食物或飼料的蛋白質、針對所述受治療者通過吸入或螫傷暴露的蛋白質的免疫應答的方法，或在疫苗使用中在受治療者中阻止對變應原或傳染劑的先天免疫性的不希望激活的方法。
[0050]特別地，本發明提供阻止CD4+NKT細胞的擴張和官能活性的方法。這種細胞通常分類為兩種不同的亞型，也就是針對攜帶不變TCRa鏈(小鼠中Vcil4，人中Vci24)的I型，或用不同的α鏈所有組成成分呈現的2型NKT細胞。然而，近來有證據提出不適合I型或2型種類的NKT細胞的替代性亞型。本發明的目的為包括這些非常規NKT細胞，前提是它們攜帶CD4共同受體。在結合到CDld的抗原呈現之后，NKT細胞被迅速激活并且分泌被認為是影響來自先天性和適應性免疫系統的其它細胞的決定簇的許多細胞因子。在有些情況下，所述激活的NKT細胞獲得或增加細胞毒性。在其它情況下，所述激活NKT細胞通過與II類限制性CD4+T細胞的相互作用抑制或減少適應性免疫應答的誘出。
[0051]在本發明的背景下，我們意外觀察到肽可以通過⑶Id分子呈現。⑶Id分子的特征在于，其由形成裂縫的兩個逆平行α鏈構成，所述α鏈位于由兩個逆平行β鏈構成的平臺的頂上。該裂隙狹窄且很深，并且僅接受疏水的殘基，通常認為僅接受脂質。該裂隙可以容納7個氨基酸的序列，所述序列的特征為在(P) I和7位置中的疏水殘基，和在Ρ4中的脂族殘基。Pl是專性疏水的殘基，諸如F、W、H或Y。然而，P7是允許的，并且可以含有替代性殘基，前提是它們是非極性的。P4中殘基優選是脂族，但為任選的。CDld結合基序的一般序列因此是[FWTHY]-X2X3-[ILMV]-X5X6-[FWTHY]。然而，本領域技術人員應該清楚的是，該基序是對稱的并且P7可以被看作P1，而Pl可以被看作P7。此處作為一般指示提供⑶Id結合基序的一般序列，而無任何限制意圖。考慮用于本發明的應用的肽和多肽是根據其通過呈現到⑶Id分子中而激活NKT細胞的能力來定義。
[0052]能夠激活NKT細胞并因而攜帶CDld結合基序的疏水肽或多肽發現于以下中:外源因子，病毒載體，用于食物或飼料的蛋白質，所述受治療者通過吸入或螫傷暴露的蛋白質，基因修飾的蛋白質和變應原；因此賦予所述外源因子、病毒載體、基因修飾的蛋白質或變應原激活CD4+NKT細胞的能力。
[0053]本發明涉及含有CDld結合基序的肽或多肽的產生，所述CDld結合基序給予所述肽或多肽激活NKT細胞的能力并且通過取代Pl和/或P7中的疏水的殘基，并且任選地，取代或刪除P4中的脂族殘基，或這些的任何組合來修飾所述CDld結合基序，這導致肽或多肽結合至CDld的能力喪失或顯著減小，并因此導致所述肽或多肽激活NKT細胞的能力喪失或顯著減小。
[0054]在更具體的實施方案中，Pl位和/或P7位中的F、W、T、H或Y由非疏水的氨基酸殘基替換，或任選地，P4位中的1、L、M或V由非脂族殘基代替，或這些替換的任何組合。
[0055]在另一具體實施方案中，位于Pl位和/或P7位中的疏水的殘基，或任選地，位于P4中的脂族殘基，或這些殘基的任何組合，被不同于非天然F、W、T、H、Y的至少一個非天然氨基酸或被非芳族有機化合物替換。
[0056]在另一具體實施方案中，將至少一個氨基酸加入⑶Id結合基序中Pl至P7序列內任何位置，所述氨基酸干擾該基序，阻止其結合到CDld的能力并因此阻止其激活NKT細胞的能力。
[0057]在優選實施方案中，非天然氨基酸是D-氨基酸。
[0058]本發明還涉及含有CDld結合基序的肽或多肽的產生，所述CDld結合基序給予所述肽或多肽激活NKT細胞的能力并且通過取代Pl和/或P7中的疏水的殘基，并且任選地，刪除P4中的脂族殘基，或這些的任何組合來修飾所述CDld結合基序，這導致肽或多肽結合至CDld的能力喪失或顯著減小，并因此導致所述肽或多肽激活NKT細胞的能力喪失或顯著減小。[0059]在對受治療者施用之后，這種肽或多肽不加載于CDld并且因此被阻止激活NKT細胞。
[0060]在另一方面，本發明還涵蓋包含Pl位或P7位中F、W、T、H或Y的至少一個取代或刪除的至少一種分離肽或多肽的用途，用于在受治療者中阻止針對外源因子施用，病毒載體施用，所述受治療者通過食物、飼料、全身或吸入路徑暴露的蛋白質，或用于接種目的的變應原或傳染劑的免疫應答。
[0061]在另一方面，本發明還涵蓋包含Pl位或P7位中F、W、T、H或Y的至少一個取代或刪除的至少一種分離肽或多肽的用途，用于在受治療者中阻止針對外源因子施用，病毒載體施用，所述受治療者通過食物、飼料、全身或吸入路徑暴露的蛋白質，或用于接種目的的某些變應原或傳染劑的NKT細胞激活。
[0062]在另一方面，本發明還涵蓋包含Pl位或P7位中F、W、T、H或Y的至少一個取代或刪除的至少一種分離肽或多肽作為藥物的用途，所述藥物用于在受治療者中阻止針對外源因子施用，病毒載體施用，所述受治療者通過食物、飼料、全身或吸入路徑暴露的蛋白質，或用于接種目的的基因修飾的肽或多肽或某些變應原或傳染劑的免疫應答。
[0063]當在肽或多肽中呈現時，CDld結合基序的數量十分有限。這種肽或多肽的實例在下文提供。一般地，多肽呈現這些基序中的一至五個。
[0064]本發明的其它優點在于，CDld分子呈現十分有限程度的多態性。因此對本領域技術人員顯而易見的是，本發明的相同氨基酸取代、添加或刪除提供可用于所有或大多數受治療者的肽或多肽。這與結合至MHC II類分子的肽或多肽基序呈鮮明對比，其中大量的肽可以描繪成含有合適序列。這是由于施加于MHCII類結合肽和II類分子大多態性的極小約束。
[0065]作為本發明的目的的肽和多肽被確定為:
[0066](I)任選地，針對含有Pl和P7中疏水的殘基和P4中脂族殘基的至少一個⑶Id基序的存在，評價肽或多肽氨基酸序列。一般序列如[FWTHY]-X2X3-[ILMV]-X5X6-[FWTHY]可以用于使用本領域熟知的算法，例如
[0067]http://expasy.0rg/tools/scanprosite/
[0068]該一般序列應該視為協助鑒別所述肽或多肽中哪個序列含有可允許所述肽或多肽激活NKT細胞的基序的工具。
[0069](2)使用表達⑶Id分子的細胞系，體外測試肽或多肽結合至⑶Id和激活NKT細胞的能力。這種細胞系的實例是本領域已知的(例如JAWS2細胞)。在優選實施方案中，該細胞系不呈現MHC II類分子，并且用含有CDld的DNA序列的病毒載體或本領域已知的在細胞中引入基因的任何其它方法將其轉導用于CDld的超表達。用于細胞轉導的方法是本領域已知的。將該細胞系加載于具有肽或多肽、或具有包含對應序列的合成肽的培養物中。這種合成肽容易通過合成(例如用本領域熟知的fmoc固相合成法)來產生。隨后通過測量NKT細胞的激活，評價CDld分子對肽、多肽或對應合成肽的有效呈現。可以從周圍血液中(通過例如磁力分選)獲得這種細胞并且在細胞因子例如IL-2、IL-15或IL-7存在下維持于具有刺激劑如a-gal-神經酰胺的培養物中。這些方法本領域中已有描述(參見例如Godfrey 等人,Nature Reviews.1mmunology2010,11:197-206)。使用諸如細胞因子產生的評價之類方法，評估NKT細胞的激活。[0070]或者，由⑶Id分子中APC實際呈現的肽可以通過各種色譜法洗提并分離。這種方法的完整描述將見于Scott等人，Immunity，12 =711-720,2000中。隨后對所述肽測序以鑒別哪個氨基酸殘基位于Pl和P7。
[0071]或者，可將所述合成肽加載于⑶Id分子的四聚物上以檢測對這種肽特異性的NKT細胞。一種可能性是使用熒光標記的四聚物并且用熒光激活的細胞分選系統(facs)檢測。[0072](3)鑒別為能夠激活NKT細胞并且任選地通過算法鑒別的氨基酸序列隨后通過取代或刪除被修飾。在優選實施方案中，Pl位和/或P7位中的F、W、T、H或Y由不同于F、W、T、H、Y的至少一個氨基酸替換。天然氨基酸可以通過轉錄后修飾來修飾或用諸如甲基的化學基團取代。在另一優選實施方案中，Pl位和/或P7位中的F、W、T、H或Y由任何適當的替代性非天然氨基酸替換。非天然氨基酸殘基的實例是D-氨基酸。在又一個實施方案中，Pl位和/或P7位中的F、W、T、H或Y由不同于F、W、T、H、Y的至少一個氨基酸替換。在另一優選實施方案中，Pl中的F、W、T、H或Y由不同于F、W、T、H、Y的至少一個氨基酸，由任何適當的替代性非天然氨基酸或由非芳族有機化合物替換。這種氨基酸取代是用本領域熟知的方法獲得。在另一優選實施方案中，Pl位中的F、W、T、H或Y被刪除。在又一個實施方案中，Pl位和P7位中的F、W、T、H或Y被刪除。進行所述刪除的方法是本領域熟知的。在另一具體實施方案中，將至少一個氨基酸加入⑶Id結合基序中Pl至P7序列內任何位置。
[0073]根據本發明，設想出用于治療其中需要外源因子的施用的疾病的藥物，所述疾病例如
[0074](I)與凝血(例如VIII因子、IX因子或X因子)或纖維蛋白溶解相關的因子的天生或后天缺陷，伴隨與多糖或糖原的代謝相關的酶類缺陷(例如龐培氏(Pompe)病)，或伴隨激素(例如糖尿病中的胰島素或侏儒癥中的生長激素)產生的缺陷
[0075](2)急性或慢性情況，其中有利的是施用治療劑，例如包括葡萄球菌激酶和微纖溶酶的血栓溶解劑，
[0076](3)免疫系統的紊亂，其中需要施用細胞因子(或其受體)或增長因子(例如干擾素-α、干擾素-β、干擾素-Y、G-CSF> GM-GSF> KGF或促紅細胞生成素)
[0077](4)特征為慢性炎癥或不適當免疫應答的疾病，其中應該施用治療性抗體包括抗腫瘤壞死因子，自身免疫疾病和移植物排斥中的抗CD3或抗CD4抗體，對淋巴細胞表面標記的抗體(例如非霍奇金氏淋巴瘤中的抗CD20抗體)，或預防血栓癥的對VIII因子的抗體。治療性抗體的名單增長很快，并且本發明旨在涵蓋用于通常治療性目的的任何抗體的用途。
[0078]根據本發明，還設想出供基因療法和基因接種使用的藥物，其中使用病毒載體并且其中針對所述載體的免疫應答妨礙轉基因表達。
[0079]根據本發明，還設想出用于通過暴露于環境蛋白而誘出的疾病的藥物，所述蛋白例如:
[0080](I)所述受治療者通過食物或飼料暴露的蛋白。這些的實例是谷物如小麥、玉米、大米、大豆和菜籽，蔬菜如馬鈴薯和甜菜根，水果如酒糟(rosacea)、堅果和鱷梨，酶類，抗病毒或抗細菌藥物。
[0081](2)受治療者通過吸入、全身路徑或螫傷暴露的蛋白。這些的實例是對花粉的變應性反應，對膠乳或膜翅目螫刺的接觸性反應。[0082]根據本發明，還設想出用于免疫(接種)的藥物，所述接種例如:
[0083](I)針對變應原的接種
[0084](2)針對傳染劑的接種，所述傳染劑包括病毒、細菌和寄生蟲
[0085]在這兩個情況下，可能有利的是阻止先天性免疫系統的激活，以便阻止炎癥的過量和其對所述接種的結果的有害后果。對變應原或傳染劑的接種的設定中的另一優點在于，NKT細胞激活的消除阻止激活的NKT細胞對針對所述變應原或所述傳染劑的適應性應答的發展的抑制作用。
[0086]應該承認的是，上述名單并非詳盡無遺并且本發明旨在涵蓋新推出的產品，例如抗體，細胞因子，在天生或后天缺陷中用于替換的增長因子或肽和多肽，和基因修飾的蛋白。
[0087]應當理解的是，上文所列任何肽或多肽可以用于轉基因的基因形式施用，所述施用通過本領域技術人員已知的病毒載體或其它方法進行。在這種情況下，可以根據本發明通過消除CDld結合基序來修飾病毒載體本身。
[0088]盡管不是必需，本發明的藥物通常是(藥物)制劑，其包含作為活性成分的至少一種本發明的肽或多肽或能夠表達所述肽或多肽的基因治療性載體。除所述活性成分以外，這種制劑將包含至少一種(藥學上可接受的)稀釋劑。
[0089]該規則值得注意的例外是使用通過吸入或通過全身路徑暴露的來自用于食物或飼料的基因修飾的有機體的蛋白。
[0090]一般說來，本發明的肽或多肽的施用阻止先天性免疫系統的激活，更特別是NKT細胞的激活，更特別地是與NKT細胞激活相關的細胞因子的產生。
[0091]用于本發明的肽 或多肽的施用途徑可以根據指示和/或肽或多肽的性質變化。實例是凝血因子的靜脈內注射，胰島素的皮下注射和基因修飾的蛋白的口服施用。本發明旨在涵蓋所有其它可能的施用途徑，例如鼻內、舌下、經皮、肌肉內、直腸內或陰道內。
[0092]如進一步詳細解釋的，本發明的肽或多肽可以通過化學合成制備，所述制備還允許非天然氨基酸的摻入。本發明的肽或多肽也可用本領域已知用于產生重組蛋白質的方法，使用表達系統如細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、植物細胞或哺乳動物細胞來產生。
[0093]本發明的另一方面涉及用于產生本文所述的本發明的肽和多肽的方法。這種方法包括對NKT細胞表位的鑒別，所述NKT細胞表位來自外源因子，病毒載體，所述受治療者通過食物、飼料、全身或吸入路徑暴露的蛋白，變應原或特異性傳染劑。用于體外的和計算機模擬的NKT細胞表位鑒別的方法是本領域熟知的，并且某些方面在后文詳細說明。
[0094]在本發明的背景下，NKT細胞表位的鑒別對本領域的技術人員是已知的。舉例而言，通過(例如)NKT細胞生物技術，測試與外源因子，病毒載體，所述受治療者通過食物、飼料、全身或吸入路徑暴露的蛋白，基因修飾的蛋白，變應原或特異性傳染劑分離的肽序列，以確定肽序列是否誘出NKT細胞應答。被發現誘出NKT細胞應答的那些肽序列定義為具有NKT細胞刺激活性。還可以通過培養從對外源因子，病毒載體，所述受治療者通過食物、飼料、全身或吸入路徑暴露的蛋白，基因修飾的蛋白，變應原或特異性傳染劑敏化的個體獲得的NKT細胞，并且例如根據通過氚化胸苷的細胞攝取測量來確定NKT細胞的增殖是否響應于肽/表位而發生，測試哺乳動物NKT細胞刺激活性。NKT細胞對肽/表位響應的刺激指數可以按響應于肽/表位的最大CPM除以對照CPM來計算。將等于或大于背景水平兩倍的NKT細胞刺激指數(S.1.)視為"陽性"。陽性結果用于計算所測試肽/表位群組的每個肽/表位的平均刺激指數。還可以任選地測試非天然NKT細胞表位對CDld分子的結合親和力。非天然NKT細胞表位對CDld分子的結合可以不同方法進行。舉例而言，獲得可溶⑶Id分子，并且通過合成和/或化學偶合制備四聚物。通過親合色譜法純化該⑶Id分子。用根據對所述CDld分子的強烈結合親和力產生的生物素標記的參考肽，培育可溶CDld分子。隨后在不同濃度下培育待評估CDld結合的肽，并且其替代其CDld結合位點的參考肽的能力通過添加親和素來計算。在例如Texier等人(2000) J.1mmunologyl64, 3177-3184中可見用于通過MHCII類決定簇呈現肽的方法，但該方法可以容易地應用于⑶Id限制性NKT細胞表位。本發明的免疫原性肽或多肽具有大于或等于2的平均NKT細胞刺激指數。認為NKT細胞刺激指數大于或等于2的免疫原性肽可用作候選者來進行CDld結合基序的序列中疏水的氨基酸殘基的取代或刪除，或氨基酸的添加，如在本發明中所述。
[0095]如果通過T細胞生物技術測定，共享天然肽或多肽序列中重疊區域的兩個或多個氨基酸序列被發現具有人NKT細胞刺激活性，則針對屬于所述序列中的一個或兩個的殘基進行疏水的氨基酸殘基的突變或刪除。
[0096]可以通過在例如細菌細胞(例如大腸桿菌)，酵母細胞(例如畢赤酵母(Pichia)物種，漢遜酵母(Hansenula)物種，釀酒酵母(Saccharomyces)或裂殖酵母(Schizosaccharomyces)屬物種)，昆蟲細胞(例如草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)或粉紋夜蛾(Trichoplusia ni))，植物細胞或哺乳動物細胞(例如，CHO、COS細胞)中重組表達產生本發明的肽或多肽。同時，因此所需的合適表達載體的結構(包括進一步信息，例如啟動子和終止序列)涉及標準重組DNA技術。例如，經由接近肽或多肽的N-和/或C-末端插入的酶切位點的酶切，隨后適當純化，本發明的重組產生的肽或多肽可以來源于較大前體蛋白。
[0097]考慮到本發明 某些肽的有限長度，它們可以通過化學肽合成法制備，其中肽是通過不同氨基酸彼此偶合來制備。化學合成特別適于對例如D-氨基酸、具有非天然側鏈的氨基酸或具有修飾側鏈的天然氨基酸例如甲基化半胱氨酸的夾雜。化學肽合成法已被充分描述，并且肽可以訂購自諸如Applied Biosystems公司和其它公司。可以按固相肽合成法(SPPS)或者與液相肽合成法相反，進行肽合成。熟知的SPPS方法是技術人員熟知的t-Boc和 Fmoc 固相化學法。另外，按 Kent 最初描述(Schnolzer & Kent (1992) Int.J.Pept.Protein Res.40，180-193)和例如在Tam等人(2001)Biopolymers60，194-205 中總結，可以使用連接策略(兩個未保護肽片段的化學選擇偶合)將肽彼此連接以形成較長肽。這提供實現超過SPPS范圍的蛋白合成的可能性。尺寸為100至300個殘基的許多蛋白已經成功通過該方法合成。
[0098]測驗本發明的肽或多肽的物理和化學性質(例如可溶性、穩定性)以確定該肽是否適用于/是否將適用于治療性組合物。一般地，所述性質通過調整肽的序列來優化。任選地，該肽可以在合成之后使用本領域已知技術修飾(化學修飾，例如添加/刪除官能團)。
[0099]基因修飾的有機體的產生依賴于本領域技術人員眾所周知的方法，包括克隆、定點誘變和生長。
[0100]本發明還涉及編碼本發明的肽或多肽的核苷酸序列，和它們用于重組表達或基因療法的方法。特別地，所述核苷酸序列能夠表達本發明的肽。[0101]在基因療法中，編碼本發明的肽或多肽的重組核苷酸分子可以用作裸露DNA，或用于遞送至靶標細胞的脂質體或其它脂質系統中。用于將質粒DNA直接轉移到細胞中的其它方法是本領域技術人員熟知用于人基因療法中的，并且涉及通過將該質粒DNA復合至蛋白而使DNA靶向細胞上的受體。在其最簡單的形式中，可以通過顯微注射的方法，簡單地將微量DNA注射到細胞的核中，進行基因轉移。一旦重組基因被引入細胞中，則可以通過轉錄和翻譯的細胞正常機制將其識別，并且基因產物將被表達。也已經嘗試了將DNA引入大量細胞中的其它方法。這些方法包括:轉染，其中由磷酸鈣沉淀DNA并且通過胞飲作用進入細胞；電穿孔，其中細胞暴露于大電壓脈沖以在膜中開孔；脂質體轉染/脂質體融合，其中DNA被包裝到與靶標細胞融合的親脂性囊泡中；和粒子轟擊，其使用結合至小轟擊粒子的DNA。將DNA弓丨入細胞中的另一方法是將DNA偶合至化學修飾的蛋白。腺病毒蛋白能夠使核內體不穩定并且增強細胞中DNA的攝取。將腺病毒混合至含有DNA復合物的溶液，或使用蛋白交聯劑將DNA結合至與腺病毒共價連接的聚賴氨酸，顯著提高重組基因的攝取和表達。腺相關病毒載體也可用于對血管細胞的基因遞送。如本文中所用，"基因轉移"意思是將外來核苷酸分子引入細胞中的方法，通常進行該方法以允許由該基因編碼的特定產物表達。所述產物可以包括蛋白、多肽、反義DNA或RNA、或酶活性的RNA。可以在培養細胞中或由直接施用到哺乳動物中，進行基因轉移。在另一實施方案中，提供包含編碼本發明的肽的核苷酸分子序列的載體。在具體實施方案中，產生該載體以使得核苷酸分子序列僅在特定組織中表達。實現組織特異性基因表達的方法是本領域熟知的，例如，將編碼本發明的免疫原性肽的序列置于啟動子的控制下，所述啟動子指導肽在一種或多種組織或器官中的特異性表達。來源于病毒諸如逆轉錄病毒、牛痘病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒、RNA病毒或牛乳頭瘤病毒的表達載體可以用于將編碼本發明的肽、其同系物或衍生物的核苷酸序列(例如cDNA)遞送到靶向組織或細胞群中。本領域技術人員熟知的方法可用于構造含有這種編碼序列的重組病毒載體。或者，含有本發明的肽或多肽的核苷酸分子代碼的工程細胞可以用于基因療法中。
[0102]本發明的藥物通常是，然而并非必然(例如，由基因修飾的有機體產生的蛋白，其用于食物、飼料、或所述受治療者經全身或吸入路徑暴露的)，(藥物)制劑，其包含作為活性成分的至少一種本發明的肽或多肽，能夠表達所述肽或多肽的基因治療性載體。除所述活性成分以外，這種制劑將包含至少一種(藥學上可接受的)稀釋劑。一般地，藥學上可接受的化合物可以見于例如藥典手冊(例如美國、歐洲或國際藥典)。本發明的藥物或藥物組合物通常包含(預防或治療)有效量的活性成分，其中有效是相對于待預防或治療的病況或病癥。
[0103]作為包含多次施用所述藥物或組合物的預防性或治療性方案的一部分，本發明的藥物或藥物組合物可能需要施用至有需要的受治療者。所述多次施用通常順序地發生，并且兩次施用之間的時間間隔可以變化并將針對活性成分的性質和待預防或治療的病況的性質進行調整。給予需要單獨施用的受治療者的活性成分的量也可變化，并且將取決于諸如受治療者的物理狀態(例如重量和年齡)，待預防或治療的病況的狀態，和主治醫生、醫師或護士的經驗之類因素。[0104]術語“稀釋劑”是指例如生理鹽水溶液。術語"藥學上可接受的載體"意思是用于配制活性成分以便例如通過溶解、分散或擴散所述組合物來促進其對待治療部位的應用或傳播，和/或促進其存貯、運輸或處理而不削弱其有效性的任何材料或物質。它們包括任何和所有的溶劑、分散介質、涂層、抗細菌和抗真菌劑(例如苯酚、山梨酸、氯丁醇)、等滲劑(例如糖類或氯化鈉)等等。可以包括其它成分，以便控制組合物中活性成分的作用持續時間。藥學上可接受的載體可以是固體或液體或經壓縮形成液體的氣體，即，本發明的組合物可以適當地用作濃縮物，乳液，溶液，顆粒，粉劑，噴霧劑，氣溶膠，懸浮體，軟膏，霜劑，片劑，小球或粉末。供所述藥物組合物和其制劑使用的合適藥用載劑是本領域技術人員熟知的，并且在本發明內對其選擇不存在特別限制。它們也可包括添加劑，例如潤濕劑、分散劑、粘著劑、粘合劑、乳化劑、溶劑、涂層、抗細菌和抗真菌劑(例如苯酚、山梨酸、氯丁醇)、等滲劑(例如糖類或氯化鈉)等等，前提是它們符合藥用實踐，即，不對哺乳動物產生永久傷害的載體和添加劑。本發明藥物組合物可以任何已知方式制備，例如將所述活性成分與所選載體材料和在適當情況下的其它添加劑如表面活性劑一起單步或多步地均勻混合、涂布和/或研磨。它們也可微分化制備，例如以便獲得通常直徑為約I至10 μ m的微球體形式，即制造用于受控或持續釋放所述活性成分的微膠囊。
[0105]本發明的肽或多肽、其同系物或衍生物(和其生理上可接受的鹽或藥物組合物，均包括在術語"活性成分"中)可以通過適合待預防或治療的病況并適合所述化合物(此處待施用的肽或多肽)的任何路徑來施用。可能的路徑包括區域，全身，口服(固態或吸入)，直腸，鼻內，局部(包括眼，頰和舌下)，陰道和腸道外(包括皮下，肌肉內，靜脈內的，真皮內，動脈內，鞘內和硬膜外)。優選的施用途徑可以隨例如接受者的狀況或待預防或治療的病況而變化。
[0106]該制劑可以方便地以單位劑型呈現，并且可以通過藥學領域熟知的任何方法制備。適于口服施用的本發明制劑可以作為離散單元呈現，例如均含有預定量的活性成分的膠囊、扁膠囊或片劑；作為粉末或顆粒呈現；作為水性液體或非水性液體中的溶液或懸浮體呈現；或作為水包油液體乳液或油包水液體乳液呈現。活性成分也可作為大丸劑、藥糖劑或糊劑呈現。片劑可以通過壓縮或模制來制備，并且任選地具有一個或多個輔助成分。通過在合適機器中將活性成分壓縮成自由流動形式如粉末或顆粒，并任選地與粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、表面活性或或分散劑混合，可以制備壓縮片劑。通過在合適機器中，模塑由惰性液體稀釋劑潤濕的粉狀化合物的混合物，可以制作模制片劑。片劑可以任選地被涂布或刻痕，并且可以經配制而提供其中活性`成分的緩釋或受控釋放。
[0107]對基因療法或基因接種來說，病毒載體非常適合藉由重組核苷酸技術來修飾。鑒于以上所述，技術人員將進一步容易地設想出，本發明的肽或多肽及其用途中應用的病毒載體NKT細胞表位的消除可以立即適用于病毒載體本身。因此，本發明進一步涵蓋修飾的病毒載體，其定義為分離的病毒載體，其特征在于CDld結合基序已經通過氨基酸取代或刪除消除。
[0108]現在將通過以下實施例說明本發明，無任何限制意圖地提供所述實施例。此外，本文所述的所有參考資料明確地以引用方式包括在本文中。
實施例
[0109]實施例1:凝血閔子VIII
[0110]罹患血友病A的患者缺乏足夠量的VIII因子(FVIII)，這是出血傾向不受控制的原因。這種患者通過輸注FVIII來治療，所述FVIII純化自血漿來源或通過重組技術產生。FVIII的施用導致特定抗體的形成，其在幾乎30%的病例中抑制FVIII作為凝血輔因子的功能。
[0111]使用算法，我們在FVIII分子的序列內鑒別出攜帶CDld結合序列的3個序列，其與[FWTHY]-X2X3-[ I LMV]-X5X6-[FWTHY]序列基序匹配。這些基序分別位于Al域和A3域中:
[0112]Al 域中的 ECHISSH(氨基酸 309-315，SEQ ID I)
[0113]A3 域中的 EWKYQHH(氨基酸 1816-1822，SEQ ID 2)
[0114]A3 域中的 EHAINGK 氨基酸 1918-1924，SEQ ID 3)
[0115]這些序列共同地具有(下劃線)位置I中的芳族殘基(苯丙氨酸，F)，位置4中的脂族殘基(異亮氨酸，I，或纈氨酸，V)，和位置7中的芳族殘基(組胺酸，H，或酪氨酸，Y)。
[0116]為確定這些序列是否可以在體內激活NKT細胞，間隔I周地4次將FVIII (2IU)靜脈內地注射至血友病A小鼠。由于引入外顯子16中FVIII基因內的終止密碼子，血友病A小鼠不產生FVIII。
[0117]最后注射10天之后，處死小鼠，去除脾臟并且通過磁珠分選制備⑶4+T細胞。NKT細胞特征為CD4的表達和CDld分子呈現的抗原的識別。CDld的四聚物得自供應商，并且加載有15個氨基酸長的FVIII肽，其包括含有SEQ ID K SEQ ID 2和SEQ ID 3的肽。觀察到加載有這些肽的⑶Id四聚物的顯著結合，表明這3種肽能夠結合至⑶Id并且FVIII的注射誘出NKT細胞的激活。代表性結果示于凰！中。
[0118]此外，采用含有CDld基序的肽(SEQ ID USEQ ID 2或SEQ ID 3的肽)的直接免疫足以誘出NKT細胞的激活并且產生對FVIII的抗體。用SEQ ID I的肽，觀察到突出的激活。代表性結果示于里！中。
[0119]構造骨髓嵌合體，其中血友病A小鼠首先被輻射，并且與缺乏NKT細胞的小鼠(即敲除⑶Id的小鼠)的骨髓重構。在缺乏NKT細胞的情況下，小鼠不能產生顯著量的對FVIII的抗體，并且實際上沒有抑制FVIII的功能的抗體(圖3)。
[0120]FVIII的Al域通過重組技術在其天然序列中產生，或用絲氨酸取代F309和H315(SEQ ID 4的多肽)來產生。將天然序列中的FVIII Al域或SEQ ID 4用于使小鼠的單獨組免疫。該結果表明，根據如上所述的脾臟⑶4+T細胞評估，通過S取代F309和H315 (SEQID 4)足以阻止NKT細胞的激活。
[0121]FVIII的A3域通過重組技術在其天然序列中產生，或用絲氨酸取代F1816和H1822(SEQ ID 5的多肽)來產生。將天然序列中的FVIII A3域或SEQ ID 5用于使小鼠的單獨組免疫。該結果表明，根據如上所述的脾臟⑶4+T細胞評估，通過S取代F1816和H1822(SEQ ID 5)足以阻止NKT細胞的激活。
[0122]在其天然序列中刪除B域的FVIII分子誘出NKT細胞的激活(參見上文)。制備具有4個氨基酸取代的FVIII分子，其含有F309S、H315S、F1816S和F1918S(SEQ ID 6)。在血友病A小鼠中靜脈內注射這種突變FVIII未導致對FVIII的抗體的形成，因而，無抑制FVIII功能的抗體形成。
[0123]因此推斷出:
[0124](I)FVIII天然地含有若干⑶Id結合基序；
[0125](2)這些⑶Id基序是功能性的并且誘出NKT細胞的激活；[0126](3)NKT細胞的激活對產生對FVIII的抗體是必不可少的；
[0127](4)通過氨基酸取代消除⑶Id基序足以消除抗FVIII抗體的產生。
[0128]本領域技術人員應該清楚的是，本發明也適用于用于產生凝血因子如IX因子的轉基因動物。
[0129]附圖詳沭
[0130]圖1
[0131]NKT細胞識別由CDld呈現的VIII因子表位
[0132]隔一周地4次用2IUVIII因子使血友病A小鼠免疫。隨后移除脾臟并且通過磁珠分選制備CD4+T細胞。CDld的熒色物標記的四聚物得自供應商，并且加載有15個氨基酸長的FVIII肽，其包括含有SEQ IDUSEQ ID2和SEQ ID3的肽。在室溫下黑暗中過夜進行加載。隨后，在4°C下用⑶4+T細胞群培育四聚物30分鐘，并且通過Facs分析細胞懸液。
[0133]該圖顯示加載有SEQ IDl的肽(圖中44p印t)的⑶Id四聚物被NKT細胞識別。CDld ctl (-)示出識別未加載的四聚物的NKT細胞百分比。CDld ctl (+)示出識別加載有a -gal神經酰胺的四聚物的NKT細胞的百分比，所述a -gal神經酰胺補充所有NKT細胞。至多45%的NKT細胞識別44pept，這與⑶Id水平下多態性的的缺乏和NKT T細胞受體水平下十分有限的多態性不矛盾。
[0134]圖2
[0135]用⑶Id限制性肽使血友病A小鼠免疫誘出抗VIII因子抗體
[0136]用吸附在氫氧化鋁上的SEQ ID I (44pept)的肽和SEQ ID 2 (256pept)的肽的等摩爾混合物50 μ g，皮下3次，使血友病A小鼠免疫。對照組接受生理血清，而非肽。在最后免疫10天之后提取血漿，并且使用直接結合檢定，評估抗VIII因子抗體的存在。簡單來說，VIII因子(10IU/ml)在聚苯乙烯板上不溶解，將其洗滌并且用1/10稀釋的血漿培育。在進一步洗滌之后，添加HRP標記的山羊抗小鼠抗血清，隨后添加酶底物。將彩色顯影讀數為0D。
[0137]該圖顯示用SEQ ID I和SEQ ID 2的肽免疫的血友病A小鼠發展出對VIII因子的抗體。
[0138]圖3
[0139]用來自⑶Id KO小鼠的骨髓重構的血友病A小鼠不產生對VIII因子的抗體
[0140]血友病A小鼠經受致命輻射并且用⑶Id KO小鼠(5xl06/小鼠)(其缺乏NKT細胞)的骨髓重構。骨髓重構六周之后，小鼠接受相隔一周的4次2IU/mlIV注射。最后免疫10天之后，使小鼠放血，并且使用直接結合檢定，對血漿檢定抗VIII因子抗體的存在，如圖2的圖例中所述。用正常骨髓重構輻射血友病A小鼠的對照組。
[0141]該圖表明，雖然對照小鼠在第四次VIII因子注射之后產生高濃度的抗FVIII抗體(左圖)，但用貧NKT細胞的小鼠的骨髓重構的小鼠未產生高濃度抗FVIII抗體(右圖)。
[0142]實施例2:腺病毒5病毒載體
[0143]病毒載體通常用于基因療法和基因接種。這些病毒載體中最常見的一種來源于腺病毒，血清型5。腺病毒(Ad)是擁有約35kb的直鏈、雙鏈DNA基因組的非包膜病毒。人Ad5具有由3個主要結構蛋白組成的衣殼:六鄰體、五鄰體和纖維。針對六鄰體蛋白的中和抗體升高。由于病毒傳染，這種抗體是人類中十分常見的。這種抗體的存在阻斷病毒載體的進入，并因而阻止該載體攜帶的轉基因蛋白的表達。抗Ad5抗體在適應性應答的過程中產生，其取決于對在MHC II類分子的背景下呈現的表位具有特異性的CD4+T細胞的激活。
[0144]已知Ad5激活先天性免疫系統，但其發生的精確機制和其進行的位置尚不清楚。然而，先天性免疫系統的激活可能是需要用于中和待形成抗體的步驟。
[0145]使用算法，我們在六鄰體6中鑒別了與⑶Id結合序列(SEQ ID7，具有下劃線基序)的一般基序[FWTHY]-X2X3-[ILMV]-X5X6-[FWTHY]匹配的7個氨基酸序列。
[0146]間隔10天3次地用IO9PFU Ad5載體靜脈內注射小鼠。隨后通過磁珠分選由脾臟制備CD4+T細胞。用CDld四聚物培育CD4+T細胞，所述CDld四聚物加載有對應于各個被鑒別的7個序列的肽。其顯示，顯著比例(±10%)的⑶4+NKT細胞被四聚物標記，表明Ad5載體注射激活了對SEQ ID 7的肽具有特異性的NKT細胞。另外，這種小鼠產生IgG2a同種型的特異性抗體，特征為小鼠中的中和抗體。
[0147]針對各個鑒別的7個氨基酸序列，制備含有[FW]被絲氨酸S取代的病毒載體。該突變病毒載體(SEQ ID 8，具有下劃線基序)用于根據如上針對天然序列所述的相同方案使動物免疫。根據使用加載有天然序列(SEQ ID 7)的肽的四聚物評估，NKT細胞的比例< I %，并且Ad5病毒特異性抗體的濃度顯著降低(多達10倍)。
[0148]因此推斷出，⑶Id結合基序的各Pl位中F至S的取代足以降低NKT細胞激活并且因此降低抗Ad5抗體的產生。
[0149]實施例3:基因修飾的蛋白
[0150]受治療者通過吸入或攝取暴露的蛋白在易感染受治療者中頻繁誘出不希望的反應。變應性哮喘影響全世界幾百萬人。另一方面，食物過敏在一般群體中具有±2.5%的總患病率。空氣傳播的、攝取的或刺入皮膚的變應原可能共享其激活NKT細胞的性質。
[0151]最常見的食物變應原之一是蘋`果(Malus domesticus),并且變應原性幾乎僅僅由Mal d I蛋白攜帶,所述Mal d I蛋白是一種159個氨基酸長的蛋白，其保護植物抵抗傳染劑。序列基序用電腦算法鑒別，其對應于CDld結合序列的一般基序[FWTHY]-X2X3-[ILMV]-X5X6-[FWTHY]。
[0152]對應于Mal dl 的氨基酸 144-150 的 ￡KLIESI(SEQ ID 9)
[0153]通過基因工程產生Mal d I的重組形式，其中F144和Y150在S中突變。Mal d I的重組形式因此包含以下序列的肽:
[0154]SKLIESS (SEQ ID 10)
[0155]產生對應于SEQ ID 9和SEQ ID 10的合成肽。它們激活NKT細胞的能力是使用來源于對Mal d I敏化的個體的周圍血液單核細胞的人樹狀細胞來體內測定。加載有所述兩個肽中每一個的樹狀細胞在NKT細胞存在下培育，所述NKT細胞通過使用諸如CD4和NKG2D之類特定標記分選周圍淋巴細胞而從相同個體獲得。觀察到用SEQ ID9的肽培育的NKT細胞激活顯著比例的NKT細胞，而SEQ ID 10的突變肽則沒有如此。另外，加載有SEQID 9的肽的人⑶Id四聚物被顯著比例的NKT細胞識別，但加載有SEQ ID 10的突變肽的四聚物被小于I %的NKT細胞識別。
[0156]F144S和Y150S兩個突變通過定點誘變直接引入克隆細胞。隨后通過常規生長策略，產生完整有機體。由該GMO產生的蘋果不誘出變應性反應。
[0157]本發明的肽或多肽的一種具體應用是乳糜瀉(谷蛋白不耐受)。該疾病是人類最常見的疾病，并且涉及對在MHC II類決定簇的背景下呈現的麥醇溶蛋白表位的T細胞激活。遺傳易感性已經被描述，其中攜帶HLA-DQ2或DQ8 II類決定簇的人類易患疾病。這些II類決定簇呈現已經通過谷氨酰胺轉移酶經受脫酰胺作用的肽。然而，這些事件是腸內炎性反應的結果，可能與先天性免疫系統有關。
[0158] 麥醇溶蛋白是250至300個氨基酸殘基的單體。使用電腦算法搜索CDld結合序列的一般基序[FW]-XX-[ILM]-XX-[FWTHY]鑒別α麥醇溶蛋白中的這種序列(SEQ ID 11，參見序列表)。隨后產生α麥醇溶蛋白的突變形式，其中基序的F殘基被S殘基取代(SEQID 12，參見附錄)。
[0159]至于Mal d I的相同程序接著顯示，雖然在由呈現抗原的樹狀細胞呈現時SEQ ID11的多肽激活顯著比例的NKT細胞，但多肽(SEQ ID 12)的突變形式沒能如此。至于Mald 1，加載有表現SEQ ID 11的多肽中識別的基序的合成肽的人⑶Id四聚物被NKT細胞識另O，而加載有如SEQ ID 12中所示基序的突變形式的四聚物則未被識別。
[0160]所述突變通過定點誘變直接引入克隆細胞。隨后通過常規生長策略，產生完整有機體。含有麥醇溶蛋白的突變形式的谷物不誘出不耐受的反應。
[0161]對于本領域技術人員而言應該顯而易見的是，本發明也可應用于被加入(例如)基因修飾的有機體以增加它們對殺昆蟲劑、殺蟲劑的耐性或判斷為有益的任何其它修飾的蛋白。這種修飾具有產生新⑶Id結合基序的風險。
[0162]具有降低的變應原性/免疫原性的基因修飾的蛋白的其它實例是:
[0163].食物變應原,例如大豆、花生和薔薇科家族的果實
[0164].牛奶蛋白
[0165].空氣傳播的變應原,例如膠乳(Hevea brasiliensis),草的花粉,例如黑麥草(Lolium perenne)、梯牧草(Phleum pratense)或草地早熟禾(Poa pratensis)
[0166]?魚小白蛋白
[0167]?蜜蜂磷脂酶A2
[0168]對于本領域技術人員而言也應該清楚的是，本發明擴展至這樣的方法，通過其產生本發明的肽或多肽，包括產生轉基因植物和動物。
[0169]實施例4:變應原Der P I
[0170]Der p I是半胱氨酸蛋白酶,其為所謂房塵螨(HDM),屋塵螨(D.pteronyssinus)的主要變應原。HDM過敏是目前全世界最常見的變應性哮喘和鼻炎觸因。如使用電腦算法鑒別的，Der P I 含有與一般 CDld 結合基序[FWTHY]-X2X3-[ I LMV]-X5X6-[FWTHY]匹配的 3個基序，它們是:
[0171]SEQ ID 13:FSGVAAT, Der p I 的氨基酸 38 至 44
[0172]SEQ ID 14:HSAIAAVI, Der p I 的氨基酸 135 至 141
[0173]SEQ ID 15:YPYVVIL, Der p I 的氨基酸 216 至 222
[0174]合成SEQ ID 13、SEQ ID 14和SEQ ID 15的肽并且用于加載CDld四聚物。
[0175]使用含有IOOygDer p I的50 μ I鹽水,使Balb/c小鼠經受Der p I的鼻內施用。間隔一周連續三天地兩次重復該挑戰程序。在最后鼻腔滴注5天之后處死該小鼠，并且移除脾臟。通過磁珠分選純化⑶4+T細胞，并且在加載有SEQ ID 13,SEQ ID 14或SEQ ID 15的肽的⑶Id四聚物存在下培育。通過熒光激活的細胞分選儀(facs)測定，觀察到顯著百分比的細胞(±10% )被四聚物著色，從而鑒定它們為⑶4+NKT細胞。因此推斷出，SEQ ID
13、SEQ ID 14和SEQ ID 15的肽在結合至⑶Id和通過NKT細胞鑒別中發揮作用。
[0176]得自上述實驗的⑶4+T細胞在表達⑶Id分子的呈現抗原的細胞存在下在培養基中培育。這種細胞是市售的，例如JAWS2細胞，其不表達MHCII類決定簇。JAWS2細胞加載有Der pi，并且通過測量作為NKT激活的標記的細胞因子例如IFN- Y和IL-4的產生，評價由⑶Id對Der p I衍生表位的呈現。可觀察到細胞因子的顯著產生，從而確認Der p I含有⑶Id分子呈現的表位。
[0177]接著，通過基因工程制備Der p I的突變形式，其中預測處于Pl位的用于SEQ ID
13、SEQ ID 14和SEQ ID 15的肽的⑶Id結合的3個氨基酸殘基被絲氨酸取代。突變DerP I (SEQ ID 16)用于鼻腔滴注，如上文對天然序列中的Der p I (SEQ ID 17)所述。在這種情況下，觀察到當用加載有SEQ ID 13的肽、SEQ ID 14的肽或SEQ ID 15的肽的四聚物培育時⑶4+T脾細胞無顯著結合，從而表明突變Der p I已經喪失其激活對這些肽特異性的NKT細胞的能力。
[0178]此外，突變Der p I (SEQ ID 16)用于加載JAWS2細胞并且測試其激活NKT細胞的能力。對于這種實驗，使用從用天然或突變結構的Der P I免疫的小鼠獲得的NKT細胞。將IFN- Y和IL-4的產生當作NKT激活的指示。觀察到，當在加載有突變Der p I的JAWS2細胞存在下培育時，從用天然序列Der P I免疫的小鼠獲得的NKT細胞未能被激活。
[0179]因此推斷出，天然序列的Der p I含有激活NKT細胞的功能性⑶Id限制性T細胞表位。此外，通過突變消除這種功能性CDld限制性表位足以消除NKT細胞激活。
[0180]實施例5:杭體
[0181]抗體作為治療性藥用于許多的指示中，從慢性炎性疾病例如類風濕性關節炎(如抗TNF- α抗體)或變應性哮喘(如抗IgE`抗體)到腫瘤(如抗CD20抗體)。超過120個治療性抗體目前在從臨床前到III期試驗的各個階段中用于臨床應用，并且為常規臨床實踐所接受。
[0182]治療性抗體是嵌合的或完全人源化的，其僅在可變部分的互補性測定區域中含有外來來源的序列。少數這種抗體來源于人所有組成部分，并因此被視為差免疫原性的。然而，即便當直接來源于人所有組成部分時，針對治療性抗體的抗體由大部分治療中的患者產生，并且，在顯著比例的病例中，抗體的產生中和治療性藥的活性。
[0183]使用電腦算法進行對與人IgG抗體序列中CDld結合基序匹配的表位的搜索。這種基序之一在4種IgG亞類(IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)每一者的CH2區域(重鏈恒定部分的第二域)中被鑒別，并且第二基序在IgGl、IgG2和IgG4的CH3環中被鑒別:
[0184]SEQ ID 18:YRVVSVL (IgGl 和 IgG4 的 CH2)
[0185]SEQ ID 19:FRVVSVL (IgG2 和 IgG3 的 CH2)
[0186]SEQ ID 20:HEALHNH(IgGK IgG2 和 IgG4 的 CH3 環)
[0187]產生對應于SEQ ID 18,SEQ ID 19和SEQ ID 20的合成肽，并且用于加載人CDld四聚物，按照上文實施例(參見例如針對變應原Der P I的實施例4)。通過對已經在前5天接受治療性抗體注射的患者靜脈穿刺，獲得周圍血液細胞。通過磁珠分選純化CD4+T細胞。隨后用加載有SEQ ID 18、SEQ ID 19或SEQ ID 20的肽的四聚物，培育所述細胞。通過facs分析鑒定由四聚物標記的顯著比例的NKT細胞(±10% )。[0188]通過用Epstein Barr病毒轉化,從周圍血液B淋巴細胞獲得IgG4同種型的單克隆人抗體。這種抗體的基因組序列得自轉化的B細胞。構造含有對應cDNA序列的病毒載體并且用于CHO細胞的轉染。所有這些方法是本領域已知的(參見例如，Jacquemin等人Blood92:496-506,1998)。
[0189]位于SEQ ID 18和SEQ ID 20的肽中I位的疏水的氨基酸殘基被突變為絲氨酸和由轉染CHO細胞產生的突變抗體。
[0190]在培養基中將如上獲得的周圍血液CD4+T細胞暴露于人樹狀細胞(通過本領域已知方法來源于人周圍血液單核細胞)并用天然結構(SEQ ID 21)的抗體或其突變對應物(SEQ ID 22)加載。在用⑶4+T細胞培養5至7天之后，評價由天然或突變抗體激活的⑶4+T細胞的群體。使用NKG2D的抗體(僅與NK或NKT細胞相關的表面標記)將⑶4+NKT細胞與⑶4+T細胞分離。
[0191]觀察到，當使用天然序列(SEQ ID 21)的抗體時，⑶4+T細胞和NKT細胞被激活，而抗體的突變形式(SEQ ID 22)僅激活II類限制性CD4+T細胞，并不激活NKT細胞。
[0192]推斷出人IgG抗體含有對應于[FWTHY]-X2X3-[ I LMV]-X5X6-[FWTHY]基序的表位，所述表位具有被NKT細胞識別并激活NKT細胞的能力。此外，這種基序中關鍵疏水的氨基酸殘基的突變足以阻止NKT細胞的激活。
[0193]應當理解的是本文提供的實施例并非詳盡無遺，并且可能想象出含有各個數量的氨基酸取代或刪除的蛋 白或肽的組合。舉例而言，在實施例1中，可以描繪疏水氨基酸的取代的各個組合。
[0194]序列表
[0195]SEQ ID I
[0196]VIII 因子氨基酸 309-315(人)
[0197]FCHISSH
[0198]SEQ ID 2
[0199]VIII 因子氨基酸 1816-1822(人)
[0200]FffKVQHH
[0201]SEQ ID 3
[0202]VIII 因子氨基酸 1918-1924(人)
[0203]FHAINGY
[0204]SEQ ID 4
[0205]因子Al域(突變F309S和H315S處有下劃線)(人)
【權利要求】
1.一種獲得激活NKT細胞的能力降低的分離肽或多肽的方法，其包含以下步驟: a.鑒別至少一個NKT細胞表位，其中所述表位在Pl位和/或P7位包含疏水的氨基酸殘基; b.通過用非疏水的殘基取代Pl位和/或P7位的疏水的氨基酸殘基，消除所述表位。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述疏水的殘基是F、W、T、H、Y。
3.根據權利要求2所述的方法，其中Pl位和/或P7位的至少一個F、W、T、H、Y由至少一個任意天然氨基酸、非天然氨基酸或非芳族氨基酸化合物替換，其中所述氨基酸不同于F、W、T、H、Y。
4.根據任一上述的權利要求所述的方法，其特征在于，所述至少一個NKT細胞表位在P4包含脂族殘基。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，P4中的所述脂族殘基是1、L、M。
6.根據任一上述的權利要求所述的方法，其中所述NKT細胞表位包含[FffTHY] -X2X3-[ILMV] -X5X6-[FffTHY]基序，其中 I 位和 / 或 7 位中的至少一個 F、W、T、H、Y 被刪除。
7.一種可以根據權利要求1至5獲得的分離肽或多肽，其中所述肽或多肽由化學合成或由重組表達產生。
8.可根據權利要求1至6的方法獲得的所述肽或多肽，其衍生自外源因子、病毒載體、通過食物、飼料、全身或吸入路徑發生天然暴露的蛋白質、變應原或接種中所用傳染劑，其中所述外源因子是凝血或纖維蛋白溶解因子、酶類、激素、細胞因子、細胞因子受體、增長因子或治療性抗體，其中所述病毒載體衍生自腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒或慢病毒，其中發生天然暴露的所述蛋白質是用于飼料或食物的蛋白質、酶類、抗病毒或抗細菌藥物、牧草花粉、樹或野草的花粉、接觸性致敏原、昆蟲或膜翅目毒液，其中所述變應原是空氣傳播的變應原、食物變應原、昆蟲或膜翅目毒液，并且其中所述傳染劑是病毒、細菌或寄生蟲。
9.可根據權利要求1獲得的任何肽或多肽用作藥物的用途。
10.根據權利要求7至8的任何肽或多肽用作藥物的用途。
11.根據權利要求7至8的任何肽或多肽用作藥物的用途，所述藥物用于在哺乳動物中阻止或治療針對外源因子、針對用于基因療法或基因接種的病毒載體、針對通過食物、飼料、全身或吸入路徑發生天然暴露的蛋白質的免疫應答。
12.根據權利要求7至8的任何肽或多肽用于變應性疾病中接種或用于傳染劑的用途。
13.根據權利要求7至8的任何所述肽或多肽用作藥物的用途，所述用于在哺乳動物中減少NKT細胞激活。
14.根據權利要求7至8中任一項的任何肽的用途，其中施用能夠表達所述肽或多肽的核苷酸序列。
【文檔編號】C07K14/435GK103596971SQ201180064053
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2011年11月24日 優先權日:2010年11月25日
【發明者】圣雷米·吉恩瑪麗 申請人:伊姆耐特有限責任公司