導致萜烯生物合成增強的1-脫氧-d-木酮糖5-磷酸合酶等位基因的制作方法

導致萜烯生物合成增強的1-脫氧-d-木酮糖5-磷酸合酶等位基因的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種增強植物或細菌的1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS)活性以增加細胞中萜烯產生的方法。本發(fā)明還涉及可通過該方法得到的增強的DXS序列。本發(fā)明還涉及在包含增強的DXS酶的宿主細胞中增加萜烯產生的方法。最后，本發(fā)明涉及表達該多膚的轉基因細菌或植物。
【專利說明】導致萜烯生物合成增強的1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶等位基因
[0001]發(fā)明背景發(fā)明領域
[0002]本發(fā)明涉及與典型植物或細菌的1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS)蛋白質相比具有增強的DXS活性的新多肽。該多肽導致細胞中萜烯大量積累。
[0003]本發(fā)明還涉及表達該多肽的轉基因植物、細菌或酵母，并且所述轉基因植物、細菌或酵母與表達典型DXS基因的植物、細菌或酵母相比能夠大大增強萜烯積累。
[0004]本發(fā)明還涉及通過培養(yǎng)表達該多肽的轉基因植物、細菌或酵母來生產萜烯的方法。
[0005]最后，本發(fā)明涉及表達該多肽并且抵抗異惡草酮的轉基因植物。
【背景技術】
[0006]類異戊二烯(也稱為萜類或萜烯)被認為是天然存在的最大的天然產物家族，迄今已經(jīng)鑒定到超過29000種的不同化合物。在化學上，其結構和復雜度上具有相當高的多樣性。類異戊二烯涉及許多基本生物學功能，因此其對于所有生物體的正常生長和發(fā)育過程是必需的。例如，類異戊二烯包括真核生物膜穩(wěn)定劑(固醇)、動物和植物激素(類固醇、類視黃醇、赤霉素和脫落酸)、光合作用色素(類胡蘿卜素和葉綠素的葉綠醇側鏈)和電子傳遞的載體(甲基萘醌、質體醌和泛醌)。
[0007]因此，類異戊二烯 是一大組多種多樣的具有相當大商業(yè)利益的復雜天然產物。現(xiàn)今主要從植物提取或化學合成類異戊二烯以用于作為藥物(例如，紫杉醇、沒藥醇和青蒿素)、動物飼料補充劑和食物色素(多種類胡蘿卜素，例如番茄紅素和β -胡蘿卜素)或調料和香料(例如，薄荷醇、藿香醇和圓柚酮)。
[0008]根據(jù)類異戊二烯含有的碳的數(shù)目將其分組，主要的感興趣的組是單萜(Cltl)、倍半職(C15)、二職(C20)和三職(C30)。
[0009]所有類異戊二烯通過共同的代謝前體異戊烯基二磷酸(isopentenyldiphosphate, IPP, C5)合成。之前假設IPP僅由甲輕戍酸通過所謂的“甲輕戍酸途徑”合成。但是最近研究表明，在真細菌(eubacteria)、綠藻和植物中，IPP還通過不同的途徑合成，該途徑被稱為2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP)途徑。因此，植物具有甲羥戊酸和MEP兩條途徑，其分別負責細胞溶膠和質體中IPP的生物合成。
[0010]MEP途徑的第一個中間物是1-脫氧木酮糖-5-磷酸(1-deoxyxyIu I οse-5-phosphate, DXP),其由甘油醒-3-憐酸(glyceraldehyde-3-phosphate, G3P)和丙酮酸在硫胺素依賴性酶1-脫氧木酮糖_5_磷酸合酶(l-deoxyxylulose-5-phosphate synthase, DXS)的催化下生物合成。已經(jīng)表明在細菌和植物中DXS催化類異戊二烯形成的限速步驟。實際上，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)和番爺(Lycopersicon esculentum)中,DXS的過表達導致質體來源的類異戍二烯(如類胡蘿卜素)水平提高。在芳香植物如寬葉薰衣草(Lavandula latifolia)中也是這種情況，DXS的過表達導致精油產生的顯著增加。
[0011]萜類包含在很多植物來源產物的香氣和香料中，在這之中，單萜醇對于食用葡萄和葡萄酒的香味有極大貢獻。描述為玫瑰或鈴蘭的花香涉及如香樟醇、香葉醇、橙花醇、α-松油醇或香茅醇等分子的存在。這些分子的最大濃度發(fā)現(xiàn)于“麝香葡萄(Muscat)”類的變種或瓊瑤楽:(Gewurztraminer)中，導致這些變種非常典型的芳香。與磨香葡萄類無關的基因型中自發(fā)出現(xiàn)了花香.[0012]現(xiàn)有技術的不足
[0013]已在商業(yè)上對某些二萜進行了探索，特別是制藥業(yè)。對于來源于紫杉烷類的二萜紫杉醇和多烯紫杉醇尤其如此，其用于治療乳腺或卵巢癌。紫杉醇是從紫杉(Taxus sp.)中提取的天然分子，多烯紫杉醇是來源于紫杉醇前體的半合成分子，10-脫乙酰巴卡亭III (或10-DAB III)，也提取自紫杉。紫杉醇的大多數(shù)紫杉醇生物合成基因已經(jīng)被描述。這些分子的生產相對昂貴，這是由于10-DAB III以及特別是紫杉醇(paclitaxel)在紫杉提取物中相對低的豐度以及由于分子結構復雜導致的缺乏可工業(yè)化按比例放大的合成方法。
[0014]因此，特別需要用于低成本地生產感興趣的萜烯的方法，以及用于生產尚不能容易合成的萜烯衍生物的方法。
[0015]通過常規(guī)化學過程生產有機分子的化學工業(yè)越來越轉向利用微生物細胞工廠的生產過程。這種向綠色化學發(fā)展的關鍵動因是這種所謂的“生物技術工藝”更加環(huán)境友好，通過微生物生產的許多化合物過于復雜而無法通過有機合成得到，以及微生物細胞工廠代表了特定化合物的無限制供應。當前，通過從植物提取或通過化學合成大規(guī)模生產類異戊二烯。這兩種方法的主要缺點是低產率和高成本。第三種選擇是通過體外酶轉化生產期望的類異戊二烯，但是這種方式受到可用前體的限制，因此大多數(shù)情況下在經(jīng)濟上是不可行的。
[0016]用于類異戊二烯生產的微生物的代謝工程可使得在發(fā)酵過程中從便宜的碳源生產大量類異戊二烯，因此解決了當前工業(yè)化生產類異戊二烯的許多問題，同時允許對類異戊二烯的天然化合物類群中存在的巨大多樣性進行生物技術上的探索。
[0017]已經(jīng)通過基因工程改造的微生物生產了許多類異戊二烯，包括檸檬烯、類胡蘿卜素、柏木腦(ep1-cedrol)、紫杉烯等。為了增強大腸桿菌(Escherichia coli)中類異戍二烯的生產，已經(jīng)過表達基因dxs (編碼DXP合酶)、dxr(DXP還原異構酶)和idi (IPP異構酶)，多種上述類異戊二烯的生產具有良好結果(MAURY等，2005中的綜述)。通過在大腸桿菌的青蒿素生產菌株中表達來自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甲輕戍酸途徑，已經(jīng)實現(xiàn)了大腸桿菌生產青蒿素的進一步提高。還已經(jīng)在酵母中生產了一些類異戊二烯化合物，包括在釀酒酵母中生產ep1-雪松醇,在釀酒酵母和產朊假絲酵母(Candida utilis)中生產番茄紅素和β_胡蘿卜素。在一些情況下，在酵母中生產的異戊二烯表現(xiàn)為通過過表達HMGl (編碼HMG-COA還原酶)來增強(MAURY等，2005中的綜述)。
[0018]盡管具有以上描述的 背景，依然需要生產萜烯和萜類的另一些方法，特別是，以比之前已知的方法更高產量、更低成本和更少時間的方式在微生物中積累萜烯的方法。因此，本發(fā)明的一個目的是提供滿足該需求的生產萜烯和萜類的方法。[0019]本發(fā)明的一個特定目的是產生積累和/或向周圍培養(yǎng)基中分泌大量萜烯的微生物。通過這樣的微生物生產萜烯優(yōu)選地隨時間的推移是穩(wěn)定的。
[0020]另外，本發(fā)明的一個目的是改造得到具有增強的類異戊二烯產生的植物，其目的在于純化異戊二烯組分以作為增加食用作物的營養(yǎng)價值的方式，或者通過增加對食草動物、昆蟲或病原體的抵抗來增強植物自身的健康。
[0021]本發(fā)明試圖通過提供轉基因植物、細菌或酵母來克服現(xiàn)有技術中的這些和其他固有缺點，所述轉基因植物、細菌或酵母表達這兩種基因中的一種并且與表達典型dxs基因的植物、細菌或酵母相比能夠極大增加萜烯的積累的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]附圖構成本說明書的一部分，其被包含以進一步說明本發(fā)明的某些方面。通過參考這些附圖中的一個或更多個并結合本文給出的具體實施方案的詳細描述可更好地理解本發(fā)明。
[0023]圖1示出了對應于葡萄(V.vinifera)變種奧托奈磨香(Muscat Ottonel, MO)(M0DXS1,SEQ ID N。8，和 M0DXS2，SEQ ID N。9)和瓊瑤漿(Gewurztraminer，GW) (SWDXS2，SEQ ID N0 10)中的不同DXS等位基因的cDNA核苷酸序列。對應于SNP的位點用粗體字母表示。
[0024]圖2示出了對應于MO和GW中不同DXS等位基因的蛋白質和對應于SEQ ID N。2的相關的共有序列的比較。
[0025]圖3示出了通過比較來源于不同植物物種的DXS蛋白得到的共有序列(通過其得到序列 SEQ ID N。I):
[0026]第I條線:共有序列
[0027]第2 條線:Mo_DXSl
[0028]第3 條線:Mo_DXS2
[0029]第4 條線:GW_DXS2
[0030]第5 條線:擬南芥(Arabidopsis thaliana)
[0031]第6 條線:甜椒(Capsicum annuum)
[0032]第7 條線:長春花(Catharanthus roseus)
[0033]第8 條線:大豆(Glycine max)
[0034]第9 條線:水仙(Narcissus pseudonarcissus)
[0035]第10 條線:煙草(Nicotiana tabacum)
[0036]第11 條線:水稻(Oryza sativa)
[0037]圖4示出了葡萄果皮中的萜烯醇含量(5種主要萜烯醇的匯集物:香葉醇、里哪醇、香茅醇、橙花醇、α -松油醇)和奧托奈麝香后代中的DXS基因型(2003年和2004年)(1:MoDXS1;2:MoDXS2)。
[0038]圖5示出了葡萄果皮中的萜烯醇含量(5種主要萜烯醇的匯集物:香葉醇、里哪醇、香茅醇、橙花醇、α-松油醇)和瓊瑤漿后代中的DXS基因型(2004年和2005年)(1:GwDXSl = MoDXSl;和 2:GwDXS2)。
[0039]圖6示出了共表達來自葡萄的DXS等位基因和來自羅勒的香葉醇合酶(geraniolsynthase, GES)的煙草葉中產生的職烯的GC-MS分析。A:共表達MoDXSl和GES的煙草葉的分析。B:共表達MoDXS2和GES的煙草葉的分析。
[0040]圖7示出了煙草葉中，在短暫共表達GES和DXS等位基因之后植物中(in planta)香葉醇的生物合成。農桿菌介導的轉化4天后，使用GC-MS分析了未轉化煙草葉(對照)、僅表達GES的煙草葉以及共表達GES和DXS的煙草葉。對于每一條件，香葉醇的量是9個獨立實驗的平均值(土標準誤差)。
[0041]圖8 示出了 MODXSl (SEQ ID N° 3)、M0DXS2 (SEQ ID N° 4)、具有 DXS 活性的截短的 M0DXS2(SEQ ID N° 5)以及 GWDXS2(SEQ ID N° 6)、具有 DXS 活性的截短的 GWDXS2 (SEQID N0 7)的氨基酸序列。
[0042]圖9示出了來自大腸桿菌的野生型DXS基因的核苷酸序列(Ecoli DXS)、編碼截短形式的DXS蛋白的基因序列(截短的Ecoli DXS)和編碼包含K213 — N和R306 — C突變的DXS蛋白的基因序列(分別為Ecoli DXS-K213N和Ecoli DXS-K234C)。
[0043]圖10示出對應于葡萄變種奧托奈麝香(MO) (M0DXS1，SEQ ID N。8，和M0DXS2，SEQID N。9)和瓊瑤漿(GW) (SWDXS2，SEQ ID N。10)中的不同DXS等位基因的蛋白和來自大腸桿菌的DXS蛋白的比較(Lois等，1998)。對應于M0DXS2和SWDXS2中的SNP的氨基酸和來自大腸桿菌的DXS中的對應氨基酸用粗體字母表示。
[0044]圖11示出了大腸桿菌菌株BL21_Gold(DE3)pLysS中表達的重組DXS的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。
[0045]泳道1:分子量標記
[0046]泳道2:用質粒 pHGWA-EcoIiDXS 轉化的 BL21_Gold (DE3) pLysS
[0047]泳道3:用質粒 pHGWA-截短的 EcoliDXS 轉化的 BL21_Gold(DE3)pLysS
[0048]泳道4:用質粒 pHGWA-EcoliDXS-K213N 轉化的 BL21_Gold(DE3)pLysS
[0049]泳道5:用質粒 pHGWA-EcoliDXS-K234C 轉化的 BL21_Gold (DE3) pLysS 用 ImMIPTG在28°C 24小時誘導DXS的表達
[0050]箭頭表示DXS蛋白的位置和指示標記的分子量。
[0051]圖12示出了轉化有不同DXS構建體的大腸桿菌的培養(yǎng)基中的單萜含量的框狀圖:野生型 EcoliDXS、截短的 EcoliDXS、EcoliDXS-K213N、EcoliDXS-K234C。單萜含量表示大腸桿菌培養(yǎng)基中積累的兩種主要單萜香葉醇和乙酸香葉酯的總量。數(shù)據(jù)對應于4個獨立實驗的結果。對于每一構建體，粗線條表示中值，框的界限是第I和第4四分位數(shù)，箱子外的線條表示極值。
[0052]圖 13 示出了 E.coliDXS、E.coliDXS_K213N、E.coliDXS_K234C和截短的 E.coliDXS的氨基酸序列。
[0053]圖14示出了細菌DXS序列的共有序列(顯示了保守氨基酸，點表示非保守氨基酸)。隱藏了對應于來自大腸桿菌的DXS蛋白中的K213和K234的氨基酸。
[0054]圖15不出了包括耐福射異常球菌(Deinococcus radiodurans)的細菌DXS序列的共有序列(顯示了保守氨基酸，點表示非保守氨基酸)。
[0055]圖16示出了來自 以下物種的DXS蛋白的氨基酸序列:大腸桿菌、痢疾志賀菌(Shigella dysenteriae)、朽1檬酸桿菌屬物種(Citrobacter sp.)、腸道沙門氏菌(Salmonella enterica)、腸桿菌屬物種(Enterobacter sp.)、阪崎腸桿菌(Cronobactersakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)、假結核耶爾森菌(Yersiniapseudotuberculosis)、鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis)、歐文氏菌屬物種(Erwiniasp.)、菠蘿泛菌(Pantoea ananatis)、Dickeya dadanti1、黑胚病菌(Pectobacteriumatrosepticum)、嗜線蟲致病桿菌(Xenorhabdus nematophila)、拉恩氏菌屬物種(Rahnella sp.)、氣味沙雷氏菌(Serratia odorifera)和耐福射異常球菌(Deinococcusradiodurans)。
[0056]圖17示出了植物DXS序列的其有序列(顯示了保守氨基酸，點表示非保守氨基酸)。隱藏了對應于來自葡萄的DXS蛋白中的K284和R306的氨基酸。
[0057]圖18示出了來自葡萄、擬南芥、赤松(Pinus densiflora)、萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)和鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)的 DXS 蛋白的氨基酸序列
[0058]發(fā)明詳述
[0059]本發(fā)明的第一目的涉及增強植物或細菌的1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS)活性以增加萜烯產生的方法，包括以下步驟:
[0060]a)通過將參考序列與植物或細菌具有DX5活性的多肽序列進行序列比對確定所述植物或細菌的多肽上的至少一個(優(yōu)選兩個)突變位點，所述參考序列選自包含SEQ IDN° 2,SEQ ID N° 4,SEQ ID N° 6,SEQ ID N0 19，SEQ ID N0 20,SEQ ID N° 2USEQ IDN。22 和 SEQ ID N0 23 的組；
[0061]b)在至少一個突變位點(優(yōu)選在兩個突變位點上)進行突變；
[0062]c)得到與典型DXS相比具有增強的DXS活性的多肽。
[0063]可通過進行序列比較來實施確定突變位點的步驟(a)。用于突變的植物或細菌的序列可最佳地與選自包含 SEQ ID N。2、SEQ ID N。4、SEQ ID N。6、SEQ ID N。19、SEQID N。20、SEQ ID N0 21、SEQ ID N0 22和SEQ ID N0 23之組的參考序列進行比對。
[0064]優(yōu)選地，所述參考序列選自包含SEQ ID N0 4、SEQ ID N0 6、SEQ ID N0 19和SEQ ID N。20 的組。
[0065]更優(yōu)選地，SEQ ID N0 4或SEQ ID N0 6用作參考序列以確定針對植物多肽的突變位點，以及SEQ ID N0 19或SEQ ID N0 20用作參考序列以確定針對細菌多肽的突變位點。
[0066]例如，可使用多序列比對計算機程序如Clustalff (Thompson等，1994)或MUSCLE (Edgar, 2004)在來自另一種生物的DXS蛋白質中鑒定對應于來自葡萄(Vitisvinifera)的DXS中K284和R306的氨基酸。
[0067]本文中使用的術語“DXS活性的增強”和“增強的DXS”指根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)修飾DXS，其使得在轉化了該經(jīng)修飾DXS的宿主細胞(例如植物、細菌或酵母)中與表達典型DXS基因的宿主細胞相比提高了萜烯產生和/或積累。
[0068]本文中使用的表述“典型DXS基因”為以高頻率出現(xiàn)的基因，例如DXS的野生型(MoDXSl)，也稱為 SEQ ID N。8。
[0069]本文中使用的術語“突變”對應于原始核酸序列的序列中任何修飾。這些突變包括小規(guī)模突變或大規(guī)模突變。小規(guī)模突變是在一個或幾個核苷酸中影響基因的突變，包括DNA中的點突變、一個或更多個額外核苷酸的插入或缺失。點突變可以是沉默、錯義和無義突變?；蚪M結構中的大規(guī)模突變(例如基因重復、缺失或突變)的作用是使之前分開的DNA區(qū)段并置，有可能使分開的基因集合起來形成功能上不同的融合基因。后一種突變包括染色體易位、中間缺失、染色體倒錯和雜合性喪失。
[0070]優(yōu)選地，本突變?yōu)辄c突變。點突變?yōu)閱蝹€的替換、缺失或添加，其改變、添加或缺失單一的氨基酸或小百分比氨基酸(通常小于5%，更通常小于4%、2%或1%，或者更少)。
[0071]本文中使用的術語“突變位點”指由發(fā)生如前所述突變的一個或數(shù)個核苷酸表示的多核苷酸的基因座。
[0072]進行所述突變的方法為本領域技術人員所熟知。例如，可使用QuikChange試劑盒(Stratagene, La Jolla, CA)進行定點突變。
[0073]定點突變法也由Zoller&Smith (1982) " OligonucIeotide-directedmutagenesisusing M13-derived vectors:an efficient and general procedure for the productionof point mutations in any DNA fragment" Nucleic Acids Res.10:6487-6500 進行了描述。
[0074]本文中使用的表達“增加萜烯產生”意指在轉化了該經(jīng)修飾DXS的宿主細胞(例如植物、細菌或酵母)中產生和/或積累的萜烯的量高于在表達典型DXS基因的宿主細胞中產生和/或積累的萜烯的量。
[0075]優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的萜烯產生增加了十倍。
[0076]例如，在編碼E.coli的DXS酶的多核苷酸中引入的突變K234 —C使得萜烯產生增加了至少十倍。
[0077]本發(fā)明的第二目的涉及植物或細菌的多肽，其具有與所述植物或細菌的典型DXS相比增強的DXS活性，其可通 過本發(fā)明的方法獲得。
[0078]本發(fā)明的第三目的涉及具有DXS活性的分離多肽，其包含與序列SEQ ID N。21或其片段具有至少90%同一性的序列，其中在SEQ ID N0 21的213位上的氨基酸為天冬酰胺和/或在SEQ ID N0 21的234位上的氨基酸為半胱氨酸。
[0079]SEQ ID N。21 為包括耐福射異常球菌(Deinococcus radiodurans)的細菌 DXS序列的共有序列，常常在文獻中對其進行表征。
[0080]在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的分離多肽具有序列SEQ ID N。22或其片段，其中在SEQ ID N0 22的213位上的氨基酸為天冬酰胺和/或在SEQ ID N0 22的234位上的氨基酸為半胱氨酸。
[0081]SEQ ID N0 22為細菌DXS序列的共有序列，其特征在于與SEQ ID N0 21類似，除了不包含耐輻射異常球菌的DXS序列。
[0082]在一個更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽包含序列SEQ ID N。19。
[0083]在一個更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽包含序列SEQ ID N。20。
[0084]本發(fā)明的第四目的涉及具有脫氧-D-木酮糖合酶(DXS)活性的分離多肽，其包含與序列SEQ ID N0 I或其片段具有至少90%同一性的序列，其中在SEQ ID N0 I的310位上的氨基酸為半胱氨酸和/或在SEQ ID N0 I的288位上的氨基酸為天冬酰胺。
[0085]本文中使用的術語“氨基酸”指所有天然存在的L-α-氨基酸或其殘基。通過單字母或三字母命名來識別氨基酸(Asp D天門冬氨酸；Ile I異亮氨酸；Thr T蘇氨酸；LeuL亮氨酸；Ser S絲氨酸；Tyr Y;Glu E谷氨酸；Phe F苯丙氨酸；Pro P脯氨酸；His H組氨酸；Gly G甘氨酸；Lys K賴氨酸；Ala A丙氨酸；Arg R精氨酸；Cys C半胱氨酸；Trp W色氨酸；Val V纈氨酸；Gln Q谷氨酰胺；Met M蛋氨酸；Asn N天冬酰胺)。
[0086]還應理解，天然氨基酸還可被替換為經(jīng)化學修飾氨基酸。通常，這種經(jīng)化學修飾氨基酸能夠增加多肽半衰期。
[0087]本文中使用的術語“ 1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶”(縮寫為“DXS”)意指能夠催化涉及丙酮酸和甘油醛-3-磷酸(GAP)的轉酮酶型縮合以形成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸的酶?？墒褂萌鏛ois等(1998)所述放射性標記底物簡單地測定所述酶活性。酶反應混合物由 50mMTris-HClpH = 7.5,2.5mMMgC12、lmM 二磷酸硫胺、5mM2_ 巰基乙醇、0.2mM[2_14C]丙酮酸(15.9mCi/mmol,NEN)、50mM丙酮酸、50mMDL_甘油醛3-磷酸以50 μ L的終體積組成。在37°C孵育2小時后，通過在80°C加熱3分鐘來停止反應。在13，OOOg下離心5分鐘后，將10 μ L上清液(2?5ml)加載至TLC板(硅膠60,Merck)上。通過使用正丙醇/乙酸乙酯/H20(6: I: 3)作為溶劑將標記的D-1-脫氧木酮糖5-磷酸與[2-14C]丙酮酸分開，然后通過放射自顯影或閃爍計數(shù)進行定量?；蛘?，如Querol等(2001)所述，可使用1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶的熒光測定。
[0088]優(yōu)選地，本發(fā)明的分離多肽包含與多肽序列SEQ ID N0 2或其片段具有至少90%氨基酸序列同一性的序列，其中在SEQ ID N0 2的306位上的氨基酸為半胱氨酸和/或在SEQ ID N0 2的284位上的氨基酸為天冬酰胺。
[0089]還優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽具有酶活性，其比多肽SEQ ID N。3高出至少50%，優(yōu)選地比SEQ ID N0 3高出至少70%，以及更優(yōu)選地高出至少100%。
[0090]在一個更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽包含序列SEQ ID N。4。
[0091]在一個更優(yōu)選的實施方 案中，本發(fā)明的多肽包含序列SEQ ID N。6.[0092]本文中使用的在兩個氨基酸序列之間的“同一性百分比”意指在待比較的兩個序列之間采用所述序列之最好比對而獲得的相同氨基酸的百分比，該百分比純粹是統(tǒng)計學的，并且這兩個序列之間的差異隨機地遍布氨基酸序列。本文中使用的“最好比對”或“最佳比對”意指確定的同一性百分比(參見下文)為最高的比對。一般通過比較根據(jù)最好比對的之前比對的兩個氨基酸序列來實現(xiàn)這些序列之間的序列比較；為了鑒別并比較相似的局部區(qū)域，針對比較的片段來實現(xiàn)該比較。除了通過手工方式，通過使用由SMITH和WATERMAN開發(fā)的全局同源性算法(Ad.App.Math.，第2卷，第482頁，1981)，通過使用由NEDDLEMAN和WUNSCH開發(fā)的局部同源性算法(J.Mol.Biol.，第48卷，第443頁，1970)，通過使用由PEARSON和LIPMAN開發(fā)的相似性的方法(Proc.Natl.Acd.Sc1.USA,第85卷，第2444頁，1988),通過使用利用這種算法的計算機軟件(在Wisconsin Genetics softwarePackage 中的 GAP，BESTFIT，BLAST P，BLAST N, FASTA, TFASTA, Genetics Computer Group,575Science Dr., Madison, WI USA),通過使用 MUSCLE 多比對算法(Edgar, Robert C,Nucleic Acids Research,第32卷,第1792頁,2004)來實現(xiàn)進行比較的最好序列比對。為了得到最好的局部比對，技術人員可優(yōu)選地使用具有BL0SUM62矩陣或PAM30矩陣的BLAST軟件。通過比較最佳比對的兩個氨基酸序列來確定這兩個序列之間的同一性百分比，為了得到這兩個序列之間的最佳比對，氨基酸序列關于參考序列能夠包含添加或缺失。通過以下來計算同一性百分比:確定這兩個序列之間相同位置的數(shù)目，將該數(shù)目除以比較位置的總數(shù)目，然后將所獲得的結果乘以100，以得到這兩個序列之間的同一性百分比。[0093]根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的多肽與氨基酸序列SEQ ID N0 I或SEQ IDN。2具有至少95%、優(yōu)選至少99%和最優(yōu)選100%的同一性。
[0094]本文中使用的SEQ ID N0 I或SEQ ID N0 2的片段指具有至少300個氨基酸長度、優(yōu)選具有至少400個氨基酸長度、更優(yōu)選具有至少500個氨基酸長度的多肽。
[0095]例如，具有DXS活性的SEQ ID N0 I或SEQ ID N0 2的片段，可以是對應于截短的M0DXS2多肽的SEQ ID N0 5或對應于截短的SWDXS2多肽的SEQ ID N0 7。
[0096]例如，植物DXS序列的共有序列為SEQ ID N。23。其包含葡萄(Mo_DXSl)的DXS的序列以及擬南芥、赤松、萊茵衣藻和杜氏鹽藻的DXS的序列。
[0097]本發(fā)明的第五目的涉及編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的分離多核苷酸。
[0098]本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式，優(yōu)選DNA形式。
[0099]所述DNA可以是雙鏈或單鏈。
[0100]根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，多核苷酸包含選自包含SEQ ID N0 9 (M0DXS2)、SEQ IDN。10(GWDXS2)、SEQ ID N。15(E.coliDXS_K213N)和 SEQ ID N。16 (E.coli DXS-K234C)之組的序列。
[0101]本發(fā)明的第六目的涉及包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的載體。
[0102]所述載體可以是克隆或表達載體(優(yōu)選表達載體)并且可以是例如質粒、粘粒、噬菌粒、病毒顆粒、噬菌體等形式。
[0103]這種載體可包括細菌質粒、噬菌體DNA、桿狀病毒、酵母質粒、衍生自質粒與噬菌體DNA之組合的載體、病毒 DNA如牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒和假性狂犬病毒。大量的合適載體為本領域技術人員所知并且可市購。例如提供了下述載體。細菌:PQE70、pQE60、pQE_9 (QIAGEN)、pbs、pDIO、phagescript、psiX174、pbluescript SK> pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A (STRATAGENE)、ptrc99a、pKK223_3、pKK233_3、pDR540、pRIT5 (PHARMACIA)。真核:pWLNE0、pSV2CAT、pOG44、pXTl、pSG (STRATAGENE)、pSVK3、pBPV、pMSG.pSVL(PHARMACIA)。然而，可使用任何其他載體，只要其可在宿主中復制并存活。
[0104]將多核苷酸序列(優(yōu)選在表達載體中的DNA序列)有效地連接至適當?shù)谋磉_控制序列(啟動子)以指導mRNA合成。這種啟動子的代表性實例可以有原核或真核啟動子，例如CMV前早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、來自逆轉錄病毒的LTR以及小鼠金屬硫蛋白-1。表達載體還包含翻譯起始的核糖體結合位點和轉錄載體。載體還可包含使得表達增強的適當序列。
[0105]另外，表達載體優(yōu)選地包含一個或更多個可選擇標記基因以提供用于選擇轉化宿主細胞的表性形狀，例如對于真核細胞培養(yǎng)而言二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或者例如E.coli中的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
[0106]包含如上所述的適當多核苷酸序列以及適當啟動子或控制序列的本發(fā)明載體可用于轉化適當?shù)乃拗饕允沟迷撍拗鞅磉_該多肽。
[0107]例如，可通過將增強子序列插入到載體中來增加較高等真核生物對編碼之前所述多肽的DNA的轉錄。增強子是DNA的順式作用元件，一般有約10至300pb，其作用于啟動子以增加其轉錄。增強子的實例包括SV40增強子、CMV早期啟動子增強子和腺病毒增強子。
[0108]本發(fā)明的第七目的涉及包含之前描述的多核苷酸或載體的轉化宿主細胞。
[0109]術語“轉化宿主細胞”、“轉化的”和“轉化”指將DNA引入細胞。所述細胞被稱為“宿主細胞”，其可以是原核或真核細胞。典型的原核宿主細胞包括E.coli的各種菌株。典型的真核宿主細胞是植物細胞如玉米細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或動物細胞。來自本文中教導，認為適當宿主的選擇在本領域技術人員的范圍內。
[0110]根據(jù)本發(fā)明的轉化宿主細胞為原核或真核細胞?？捎杀绢I域技術人員通過熟知的方法影響將之前描述的多核苷酸或載體引入宿主細胞，例如磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染或電穿孔。
[0111]根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案,根據(jù)本發(fā)明的轉化宿主細胞為選自包含真細菌、古細菌和藍細菌細胞之組的原核細胞。
[0112]更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的轉化宿主細胞為原核細胞，甚至更優(yōu)選地為大腸桿菌(Escherichia coli)細胞。
[0113]原核生物也可用 作本發(fā)明初始克隆步驟的宿主細胞。它們尤其可用于快速產生大量DNA，用于產生定點突變所使用的單鏈DNA模板，用于同時篩選許多突變體，以及用于對產生的突變體進行DNA測序。合適的原核宿主細胞包括E.coli K12菌株94(ATCCN0.31,446), E.coli 菌株 W3110 (ATCCN0.27，325)、E.coliX1776 (ATCCN0.31，537)和E.coliB;然而E.coli的許多其他菌株如HBlOU JMlOU NM522、NM538、NM539和原核生物的許多其他種和屬包括桿菌(bacilli)如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、其他腸桿菌科(enterobacteriaceae)如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)或 Serratiamarcesans和多種假單胞菌屬(Pseudomonas)物種都可用作宿主。
[0114]根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方案，根據(jù)本發(fā)明的轉化宿主細胞為選自包含動物、真菌、酵母和植物細胞之組的真核細胞。
[0115]優(yōu)選地，真核細胞為真菌微生物。更優(yōu)選酵母
[0116]合適的微生物的非詳盡列表將包括以下:屬于酵母屬(Saccharomyces)的物種-例如釀酒酵母(S.cerevisiae)、貝酵母(S.bayanus)、巴氏酵母(S.pastorianus)、奇異酵母(S.paradoxus)、少抱酵母(S.exiguous)、S.servazz1、葡萄汁酵母(S.uvarum)、克魯弗酵母(S.kluyveri)和S.castelli1-;屬于克魯維酵母屬(Kluyveromyces)的物種-例如乳酸克魯維酵母(K.1actis)、馬克斯克魯維酵母(K.marxianusvar.marxianus)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolorens)、克魯雄酵母(K.waltii)、德地克魯維酵母(K.delphensis)、K.nonfermentas和K.wickerhami1-,屬于假絲酵母屬(Candida)的物種-例如產I元假絲酵母(C.utilis)、熱帶假絲酵母(C.tropicalis)、C.castellii 和 C.humilis-,屬于接合酵母屬(Zygosaccharomyces)的物種_例如魯氏酵母(Z.rouxii)、拜耳接合酵母(Z.bailii)、發(fā)酵接合酵母(Z.fermentati)、Z.bisporus 和 Z.f 1rentinus-,屬于畢赤酵母屬(Pichia)的物種-例如P.stipidis、巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)、P.sorbithophila和異常畢赤酵母(P.anomala)-,或者其他物種_例如多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)、解脂耶羅維亞酵母(Yarrowia Iipolytica)、漢森德巴利酵母(Debaromyces hansenii)、粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)、Torulaspora delbuecki1、Ashbya gossipie、黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)、產黃青霉(Penecillium chrysogenum)、米根霉(Rhizopus oryzae)和 Mucorcircenelloides-。
[0117]更優(yōu)選地，真核細胞為酵母，甚至更優(yōu)選地，微生物為釀酒酵母。例如，釀酒酵母在 2006 年 I 月 27 日儲存于 DSMZ-Deutsche Sammlung vonMikroorganismen undZellkulturen GmbH.Mascheroder Weg lb, D-38124Braunschweig, Germany,登錄號:OSMZI7900。
[0118]出于本發(fā)明的目的，異源性途徑是下述途徑，該途徑通過所限定的中間步驟并且由所限定的起始材料形成化合物的活性不存在于微生物的野生型中。更優(yōu)選地，異源性途徑是衍生自不同物種的DNA的途徑。
[0119]或者，真核細胞為植物細胞，更優(yōu)選地植物細胞選自包含葡萄、煙草(Nicotianatabacum)和擬南芥細胞的組，甚至更優(yōu)選地所述植物細胞為葡萄細胞，優(yōu)選葡萄栽培變種奧托奈磨香(Vitis vinifera Cv MuscatOttonel)或葡萄栽培變種瓊瑤衆(zhòng)(Vitisvinifera Cv Gewurztraminer)細胞,更優(yōu)選葡萄栽培變種瓊瑤衆(zhòng)的細胞。
[0120]本發(fā)明的第八目的涉及包含之前描述的多核苷酸或載體的轉基因細菌。
[0121]本發(fā)明的第九目的涉及包含之前描述的多核苷酸、載體或宿主細胞的轉基因植物。
[0122]—般通過根癌農桿菌(Agrobacterium tumifaciens)完成培養(yǎng)植物宿主細胞的轉化。因此，可例如通過以下獲得轉基因植物:將本發(fā)明的載體(即編碼1-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶)和可選擇標記基因(例如，編碼卡那霉素抗性的kan基因)轉移至包含輔助Ti質粒的根癌農桿菌中，如H0ECKEMA等(Nature，303:179-181，1983)所述，然后將根癌農桿菌細胞與待轉化的植物葉切片或者其他組織或細胞一起培養(yǎng)，如AN等(Plant Physiology,81:301-305,1986)所述。然而，可使用將DNA引入細胞的其他方法，例如聚凝胺(Kawai和Nishizawa, Mol.Cell.Biol.,4: I 172[1984])、原生質體融合(Schaffner, Proc.Natal.Acad.Sc1.USA，77:2163 [1980])、電穿孔(Neumannet 等，EMB0J.，1:841 [1982])和直接顯微注射至細胞核中(Capecchi, Cell，22:479 [1980])。
[0123]可通過可選擇標記由在包含例如卡那霉素和適當量植物激素如萘乙酸和芐基腺嘌吟(用于愈傷組織和根誘導)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)細胞來選擇轉化的植物愈傷組織。之后，可使用本領域技術人員熟知的技術使植物細胞再生并將所得植物轉移至土地。
[0124]根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的轉基因植物已經(jīng)在基因組中并入了之前所述的多核苷酸或載體。
[0125]優(yōu)選地，所述植物選自包含樹、蔬菜、肉質植物(succulent)和觀賞植物的組。
[0126]仍更優(yōu)選地，所述轉基因植物耐異惡草酮(clomazone),異惡草酮也稱為異惡草酮(dimethazone) (FMC57020; 2- (2-氯代苯基)甲基 _4，4:- 二甲基-3-1soxalidinone)。
[0127]如本文所使用的，耐異惡草酮的轉基因植物對應于在ΙΟμΜ異惡草酮的存在下生長的植物(Carretero-Paulet L、Cairo A、Botella-P α ν? α P、Besumbes O、Campos N、Boronat A、Rodriguez-Concepcion Μ.(2006)、Enhanced flux through themethylerythrito 14-phosphate pathway in Arabidopsis plants overexpressingdeoxyxylulose5-phosphate reductoisomerase.Plant Mol Biol62:683-95)。
[0128]仍更優(yōu)選地，所述轉基因植物具有增強的香氣。
[0129]作為實例，所述轉基因植物選自包括以下的組:唇形科(例如，羅勒屬(羅勒)、薰衣草屬(薰衣草)、牛至屬(牛至)、薄荷屬(薄荷)、鼠尾屬(鼠尾草)、迷迭香屬(迷迭香)、百里香屬(百里香)、香薄荷屬和馬薄荷屬)；傘形科(例如，葛縷子屬(葛縷子)、蒔蘿屬(蒔蘿)、茴香屬(茴香)和胡蘿卜屬(胡蘿卜))；菊科(菊科植物)(例如，艾屬(龍蒿、艾灌叢)和艾菊屬(艾菊))；蕓香科(例如，柑橘植物)；薔薇科(例如，玫瑰)；桃金娘科(例如，按樹、千層樹)；禾本科(例如，香茅屬(香茅))；櫳牛兒苗科(天竺葵)和某些松柏類，包括冷杉屬(例如，加拿大香脂)、雪松屬(雪松)和金鐘柏屬以及刺柏屬。
[0130]本發(fā)明的第十目的涉及本發(fā)明的轉基因植物的任何代的后代，所述后代包含之前所述的多肽、多核苷酸、載體或宿主細胞。
[0131 ] 所述后代可具有植物或種子的形式。
[0132]本發(fā)明的第十一目的涉及制備如之前所述的轉基因植物的方法，其包括以下步驟:
[0133]a.用如之前所述的載體轉化植物細胞；
[0134]b.選擇表達如之前所述之多肽的經(jīng)轉化植物細胞；和
[0135]c.由所述經(jīng)轉化植物細胞產生轉基因植物。
[0136]轉化的步驟(a)可通過如之前所述的公知的方法來完成，例如電穿孔、轉染、裸DNA攝取、原生質體產生、DNA直接轉移入花粉、胚胎或多能植物細胞、農桿菌介導的轉化、粒子轟擊或微粒轟擊。
[0137]步驟(b)的選擇可通過公知方法來完成。
[0138]步驟(C)的由所述轉化植物細胞產生耐異惡草酮的轉基因植物可通過公知方法(例如，由所述轉化植物細胞 產生多能植物細胞)來完成。
[0139]根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，所述方法用于制備植物種子，所述方法還包括以下步驟:
[0140]d.從所述轉基因植物獲得種子。
[0141]根據(jù)一個特別實施方案，本發(fā)明的方法用于獲得耐異惡草酮的轉基因植物。
[0142]優(yōu)選地，所述轉基因植物通過公知的方法來獲得，例如描述于Klee H，Horsch R，Rogers S(1987), Agrobacterium-Mediated Plant Transformation and its FurtherApplications to Plant Biology.Annual Review of Plant Physiology38,467-486 和Potrykus I (1991)Gene Transfer to Plants:Assessment of Published Approaches andResults.Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology42,205-225中的那些。
[0143]根據(jù)另一特定實施方案，本發(fā)明的方法用于獲得具有增強的萜烯生物合成能力的轉基因植物。具有增強的萜烯生物合成能力的植物將合成比野生型的所述轉基因植物多至少50%的萜烯，優(yōu)選為至少70%，更優(yōu)選為至少100%。
[0144]優(yōu)選地，萜烯涉及香葉醇、里哪醇、香茅醇、橙花醇和α-松油醇。
[0145]優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽具有比多肽SEQ ID N0 3高至少50%，優(yōu)選為至少70%，并且更優(yōu)選地比SEQ ID N0 3高至少100%的酶活性。
[0146]所述具有職烯生物合成能力的植物可以是芳香植物，例如辣薄荷(Menthapiperita)、寬葉薰衣草(Lavandula latifolia)或迷迭香(Rosmarinus officinalis);和藥用植物，例如青蒿(Artemisia annua)、歐洲紅豆杉(Taxus baccata)、長春花(Catharanthus roseus)或紫草(Lithospermum erythrothizon)以及產生有價值的職烯化合物的任何植物種類，例如產生類胡蘿卜素的植物，如番爺(Lycopersicon esculentum)、木薯(Manihot esculenta)或稻(Oryza sativa)。[0147]優(yōu)選地,通過公知方法例如Klee等(1987)和Potrykus (1991)中所述的那些來選擇所述轉基因植物。
[0148]本發(fā)明的第十二目的涉及產生增強的DXS酶的方法，增強的DXS酶增加植物、細菌或酵母中的萜烯產生，該方法包括以下步驟:
[0149]a.培養(yǎng)如之前所定義的經(jīng)轉化宿主細胞；
[0150]b.獲得使得增加植物或細菌中的萜烯產生的增強的DXS酶。
[0151]優(yōu)選地，具有增強的DXS活性的多肽可能通過之前所述的方法獲得。
[0152]本發(fā)明的第十三目的涉及在宿主細胞中產生萜烯的方法，其包括以下步驟:
[0153]a.在如之前所述有效產生萜烯的條件下(例如，植物、細菌或酵母細胞)、在通過DXS2酶有效產生更多萜烯底物(單萜、二萜、三萜和/或多萜)的條件下培養(yǎng)轉化宿主細胞，所述更多萜烯底物的產生導致通過萜烯底物的酶修飾產生更多萜烯。
[0154]b.從所述宿主細胞獲得所述萜烯。
[0155]萜烯是基于異戊二烯單元(C5)或者主要由其構成的飽和的或不飽和的、任選地取代的烴。萜烯可以是無環(huán)或環(huán)狀的。如本文所使用的萜烯包括萜烯、萜烯衍生物以及被稱為萜類的化合物(其可以落在或可以不落在兩個之前類別的化合物之一)。萜烯衍生物包括已經(jīng)歷功能化的一個或更多個步驟的化合物，例如，功能化包括羥基化、異構化、氧化還原或酰化。優(yōu)選地，出于本發(fā)明的目的，萜烯是滿足上述條件的化合物，和/或其碳骨架至少部分但優(yōu)選全部來自MEP和/或MEV途徑的化合物。因此，萜烯包括萜烯醇，例如C15H26O和CltlH18O化合物,例如藿香醇(patchoulol)、柏木腦(ep1-cedrol)、蓽澄爺醇(cubebol)、里哪醇(Iinalool)、橙花叔醇(nerolidol);和二醇,例如香紫蘇醇(sclareol)。職烯還包括二磷酸化合物，例如冰片基(b ornyl)-二磷酸(單職烯)和柯巴基(copalyl) - 二磷酸(二職烯)，只是提及了廣泛類別的萜烯的幾種。
[0156]如本文所使用的，“衍生物”是從已知化合物或推定化合物獲得的任何化合物并且包含母體的必需要素。
[0157]例如，萜烯是具有碳骨架C1(l、C15, C20, C30> C40, C45等的化合物。
[0158]因此，術語“萜烯”涵蓋單萜、倍半萜、二萜、三萜、四萜和/或多萜。
[0159]優(yōu)選地，所述萜烯包括香葉醇、里哪醇、香茅醇、橙花醇和α-松油醇。
[0160]根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的微生物提供了至少30 μ g、更優(yōu)選為至少100 μ g的萜烯/g鮮重微生物的產率。微生物的萜烯產率優(yōu)選地由實施例2的方案建立。
[0161]萜烯可在細胞中積累。例如，它們可在細胞質、線粒體、細胞膜或其它細胞器中積累。許多萜烯是親脂性化合物，它們在細胞的質膜中積累。
[0162]出于本發(fā)明的目的，術語“在培養(yǎng)基中積累”還涵蓋在兩相發(fā)酵工藝過程中在溶劑中的積累。
[0163]該方法包括在有益于產生所述萜烯的條件下培養(yǎng)轉化宿主細胞的步驟。這些條件對于技術人員而言已知的條件。一般而言，可以通過選擇適當?shù)慕橘|、發(fā)酵容器、溫度和PH來調節(jié)它們。
[0164]用于產生萜烯的方法可包括以下步驟:在進行兩相發(fā)酵的情況下，從介質、細胞和/或有機溶劑分離萜烯。萜烯可通過用于本領域的任何方法來分離，所述方法包括但不限于色譜、提取和蒸餾。[0165]例如，本領域技術人員而言公知單萜通常在質體中產生，倍半萜通常在細胞溶膠中產生。
[0166]與植物相比，微生物系統(tǒng)更易于進行大規(guī)模改造項目(其中可以比較和組合許多不同的修飾)。但是，與植物相比，微生物確實具有一些技術缺點，特別是在其表達異源基因時。
[0167]本發(fā)明的第十四目的涉及選擇芳香植物的方法，其包括以下步驟:
[0168]a.通過所述植物的生物樣品中萜烯合成的增強和/或萜烯積累的分析來鑒定引起DXS等位變異的DXS的至少一個突變，
[0169]b.選擇包含所述突變的植物。
[0170]本發(fā)明的第十五目的涉及用于產生更耐異惡草酮的DXS酶的方法，其包括以下步驟:
[0171]a.培養(yǎng)如之前所述的轉化宿主細胞；b.從所述轉化宿主細胞的細胞提取物、細胞懸液、蛋白質級分、晶體級分、細胞培養(yǎng)物、細胞勻漿、細胞裂解物、細胞上清液、細胞過濾物或細胞沉淀獲得更耐異惡草酮的DXS酶。
[0172]下述實例用于示出本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領域技術人員應理解，在下述實例中公開的技術代表用以實施如由本發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的本發(fā)明的運行良好的技術，并且因此可認為構成用于其實施的優(yōu)選實施方式。
[0173]實施例
[0174]I)克隆來自葡萄栽培 變種麝香奧托奈和瓊瑤漿的DXS cDNA
[0175]使用RT-PCR擴增并克隆來自葡萄栽培變種麝香奧托奈(MO)和瓊瑤漿(Gw)的DXScDNA。對這些克隆的測序表明，MO和Gw兩者在DXS基因座處是雜合的。MO和Gw共有相同的等位基因，稱為MoDXSl (圖1)。另外，Mo和Gw分別具有MoDXS2和GwDXS2等位基因。MoDXS2和GwDXS2等位基因分別在2和I SNP中與MoDXSl不同，其修飾對應蛋白質的氨基酸序列(圖2)。對于MoDXS2和GwDXS2來說分別為特征性的K284 — N和R306 — C突變(參照SEQ ID N。2)影響數(shù)據(jù)庫中可得到的所有植物DXS序列中保守的氨基酸(圖3)。此外，氨基酸K284和R306屬于酶的活性位點(Xiang等，2007)，這表明它們可修飾MoDXS2和GwDXS2等位基因相比于MoDXSl的活性。
[0176]2)MoDXS2和GwDXS2等位基因對葡萄果實中萜烯醇含暈的影響
[0177]材料和方法:通過固相提取(SPE)分離游離和結合的單萜烯醇。
[0178]對于每個取樣點，進行萜烯醇分析的三次重復。對于每次重復，使用至少25顆果實。除去種子并將外皮與中果皮分離。稱重后在液氮下研磨外皮，然后在添加40mg亞硫酸鈉后懸于40mL水中。使離心(4°C下11400g) 15分鐘后得到的上清液通過玻璃纖維預過濾器和玻璃過濾器。添加20微升lg/L的4-壬醇溶液作為外部標準品以允許定量主要的萜烯醇。萜烯醇的提取改進自Mateo等(1997)，使用乙醇代替甲醇。使之前用5mL甲醇和15mL超純水清洗的濾液通過Ig相C18 二氧化硅鍵合的非極性SPE柱(BOND ELUT JR.)，速率為約I滴/秒。然后將樣品分為兩個相等的子樣品，一個用于分析游離的和糖苷結合的單萜烯醇，一個用于分析游離的萜烯醇。用4mL無水乙醇洗脫游離的和結合的單萜烯醇的總級分。將該總萜烯醇提取物稀釋于40mL檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液(pH4.5)中并將所得溶液與 50mg AR2000 糖酵解酶(Gist-Brocades, Seclin, France)在 37.5°C下鮮育過夜以釋放糖苷結合的職烯醇(Tamborra等.2004)。在C18柱上通過SPE分離釋放的職烯醇并在用3X5mL水沖洗后用4mL 二氯甲烷洗脫。對于游離的萜烯醇分析，不進行水解步驟，萜烯醇在用水沖洗后直接用二氯甲烷洗脫。在填充有0.5g無水亞硫酸鈉的巴斯德吸管中干燥提取物并在溫和的氮氣流下濃縮至500 μ L0將20微升lg/L間甲酚溶液添加到每個樣品中作為內部對照。在進行氣相(GC)分析之前將樣品儲存在_20°C。
[0179]結果:
[0180]實施例2示出DXS等位基因對葡萄果實中萜烯醇含量具有很大影響，如通過作為MO(圖4)和GW(圖5)后代中DXS等位基因之函數(shù)的萜烯醇含量的研究所示。MoDXSl (=GwDXSl)純合基因型表現(xiàn)出極其低水平的萜烯醇，而雜合或DXS2純合基因型累積了大量的職烯醇。
[0181]3)植物中DXS等位基因的功能性表征
[0182]為了表征DXS等位基因活性，本發(fā)明人使用農桿菌介導的煙草(本氏煙，Nicotiana benthamiana)瞬時轉化,其允許在煙草葉中實現(xiàn)快速有效的基因表達(Batoko等，2000)。已使用該方法成功地表征了葡萄次級代謝中所涉及的基因(Schmidlin等，2008;Hugueney 等，2009) 。MoDXS1、MoDXS2 和 GwDXS2 等位基因與編碼羅勒(basilicum,Ocimumbasilicum) (Ii jima 等人,2004)香葉醇合酶(geraniol synthase, GES)的 cDNA —起在煙草葉中表達。在該系統(tǒng)中，GES用作負責生物合成單萜烯醇香葉醇的報告基因，其通常不在煙草中累積。因為已示出DXS活性對于植物中的萜烯生物合成是限制性的(Estevez等，2001; Enfissi等，2005)，所以由GES活性形成的香葉醇的量直接取決于DXP底物可利用度，并因此取決于煙草葉片中的DXS活性。由此，共表達GES和DXS等位基因之煙草葉的GC-MS分析允許精確比較植物中的DXS等位基因活性。
[0183]材料和方法:
[0184]使用上游引物
[0185]5' -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGGTTCCGCGTGGATCAATGGCTCTCTG
[0186]TACGCTCTCATTTCC-3' (SEQ ID N。11)和下游引物
[0187]5' -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCACTATAACATGATCTCCAGGGCCTCC-3'
[0188](SEQ ID N。12)通過 PCR 擴增葡萄 DXS cDNA，并且使用 Gateway BP 克隆酶(clonase) (Invitrogen)根據(jù)制造商說明書克隆到pD0DR207Gateway相容性載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。對DXS cDNA進行測序以證明沒有引入突變。為了農桿菌介導的瞬時表達，隨后將DXScDNA轉移到GATEWAY雙運載體pMDC32 (Curti s和Grossniklaus.,2003)中。將來自羅勒的香葉醇合酶cDNA (Ii jima等人,2004)克隆到GATEWAY雙運載體pMDC83 (Curtis和Grossniklaus.，2003)中并表達為GFP融合蛋白。通過電穿孔將所有的構建體引入到土壤農桿菌菌株C58(pMP90)中。根據(jù)Voinnet等(2003)用土壤農桿菌培養(yǎng)物(0D6000.5)浸潤本氏煙草的葉。在土壤農桿菌浸潤96小時后分析葉片區(qū)塊的萜烯含量。
[0189]然后，從煙草葉中提取萜烯醇:
[0190]對于每個取樣點，進行萜烯醇分析的三次重復實驗。稱重后，在液氮下研磨煙草葉片區(qū)塊(約lg)，然后懸于2mL超純水中。離心(在4°C下6000g)5分鐘后，收集上清液并添加20μ Llg/L4-壬醇溶液作為外部標準品。使之前用5mL甲醇和15mL超純水清洗的上清液通過Ig相C18 二氧化娃鍵合的非極性SPE柱(Bond Elut Jr, Varian)。用2mL無水乙醇洗脫總萜烯醇。將該總萜烯醇提取物稀釋于20mL檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液(pH4.5)中并將所得溶液與25mgAR2000糖酵解酶(Gist-Brocades，Seclin，F(xiàn)rance)在37.5°C下孵育過夜。在C18柱上通過SPE分離釋放的萜烯醇并在用3X5mL水沖洗后用4mL 二氯甲烷洗脫。在填充有0.5g無水亞硫酸鈉的巴斯德吸管中干燥提取物并在溫和的氮氣流下濃縮至500 μ L0將20微升lg/L間甲酚溶液添加到每個樣品中作為內部對照。在進行氣相(GC)分析之前將樣品儲存在-20°C。
[0191]最后，使用配備有GerstelMPS2XL取樣器并與Agilent5975B惰性質譜儀(AgilentTechnologies)偶聯(lián)的Agilent6890N氣相色譜儀通過氣相色譜和質譜(GC-MS)分析職烯。氣相色譜儀安裝有DB-Wax毛 細管柱(60mX0.32mm內徑X0.5 μ m膜厚，J&WScientific)并且將氦氣用作載氣(lml/分鐘恒流)。GC箱溫是程序化的，沒有最初的維持時間，以20°C /分鐘的速率從45 °C至82 °C (維持I分鐘)，然后以2.7 °C /分鐘的速率從82 °C至235 °C (維持15分鐘)。注射器設定為250°C并以脈沖不分流模式使用(25psi，0.50分鐘)。界面、MS離子源和四極管的溫度分別為270°C、230°C和150°C。以電子轟擊離子化模式(EI，70eV)運行質譜儀并且在29_300amu的m/z范圍中掃描質量。Agilent MSD ChemStation軟件(G1701DA，RevD.03.00)用于儀器控制和數(shù)據(jù)處理。將質譜圖與威利文庫參照譜圖庫(Wiley; slibrary reference spectral bank)進--?:匕較。
[0192]結果:
[0193]農桿菌介導的單獨GES瞬時表達導致顯著量香葉醇的累積，所述香葉醇的生物合成取決于煙草中的內源性DXS活性(圖6，圖7)。GES和MoDXSl的共表達由于增強的DXP底物可利用度而導致香葉醇生物合成大量增加。但是，GES和MoDXS2或GwDXS2的共表達導致煙草葉中香葉醇累積平均增加三倍(圖7)，表明這些等位基因與MoDXSl相比具有增強的DXS活性。
[0194]因此，本發(fā)明人推斷，MO和GW中萜烯醇的大量累積是由于存在MoDXS2或GwDXS2。與MoDXSl相比，影響酶活性位點中氨基酸的K284 — N和R306 — C突變賦予了增強的DXS活性，進而成為植物中萜烯累積增加的原因。
[0195]以下實驗的目的是研究這些突變的作用是否可擴展至其他來源的DXS酶。本發(fā)明人選擇來自其酶特性被很好地表征的大腸桿菌DXS作為模型(Querol等,2001; Xiang等，2007)。
[0196]來自大腸桿菌與葡萄的DXS蛋白質序列的比對表明葡萄DXS中的氨基酸K284和R306分別對應于大腸桿菌DXS中的K213和234 (圖10)。為了評價MO-和GW-樣突變對非植物DXS活性的影響，將突變K213 — N和K234 — C引入到大腸桿菌DXS的蛋白質中。隨后研究了這些突變對大腸桿菌的萜烯生物合成能力的影響。
[0197]4)來自大腸桿菌的DXS基因的克隆和定點誘變
[0198]材料和方法:
[0199]使用上游引物
【權利要求】
1.一種增強植物或細菌的1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS)活性以增加萜烯產生的方法，其包括以下步驟: a)通過將參考序列與植物、細菌或酵母中具有DXS活性之多肽的序列進行序列比對來確定所述植物、細菌或酵母的所述多肽上的至少一個(優(yōu)選兩個)突變位點，所述參考序列選自包含以下的組:SEQ ID N。2, SEQ ID N。4、SEQ ID N。6, SEQ ID N。19，SEQ IDN。20、SEQ ID N。21、SEQ ID N。22 和 SEQ ID N。23; b)在至少一個突變位點(優(yōu)選兩個突變位點)上進行突變； c)得到具有與典型DXS相比增強的DXS活性的多肽。
2.植物或細菌的多肽，其具有與所述植物或細菌的典型DXS相比增強的DXS活性，所述多肽可通過根據(jù)權利要求1所述的方法得到。
3.具有DXS活性的分離的多肽，其包含與序列SEQID N0 21或其片段具有至少90%同一性的序列，其中SEQ ID N0 21第213位上的氨基酸是天冬酰胺和/或SEQ ID N0 21第234位上的氨基酸是半胱氨酸。
4.根據(jù)權利要求3所述的分離的多肽，其具有所述序列SEQID N0 22或其片段，其中SEQ ID N0 22第213位上的氨基酸是天冬酰胺和/或SEQ ID N0 22第234位上的氨基酸是半胱氨酸。
5.根據(jù)權利要求3或4所述的多肽，其中所述多肽包含序列SEQID N。19。
6.根據(jù)權利要求3或4所述的多肽，其中所述多肽包含序列SEQID N0 20。
7.具有DXS活性的分離的多肽，其包含與序列SEQID N0 I或其片段具有至少90%同一性的序列，其中SEQ ID N0 I第310位上的氨基酸是半胱氨酸和/或SEQ ID N0 I第288位上的氨基酸是天冬酰胺。
8.根據(jù)權利要求7所述的多肽，其中所述多肽包含與序列SEQID N0 2或其片段具有至少90%同一性的序列，并且其中SEQ ID N0 2第306位上的氨基酸是半胱氨酸和/或SEQID N0 2第284位上的氨基酸是天冬酰胺。
9.根據(jù)權利要求8所述的多肽，其中所述多肽包含序列SEQID N° 4。
10.根據(jù)權利要求8所述的多肽，其中所述多肽包含序列SEQID N0 6。
11.分離的多核苷酸，其包含編碼根據(jù)權利要求2至10中任一項所述多肽的序列。
12.載體，其包含根據(jù)權利要求11所述的多核苷酸。
13.經(jīng)轉化的宿主細胞，其包含根據(jù)權利要求11所述的多核苷酸或根據(jù)權利要求12所述的載體。
14.根據(jù)權利要求13所述的經(jīng)轉化宿主細胞，其中所述經(jīng)轉化宿主細胞是選自包含真細菌、古細菌和藍細菌細胞之組的原核細胞，優(yōu)選地所述原核細胞是大腸桿菌(Escherichia coli)細胞。
15.根據(jù)權利要求13所述的經(jīng)轉化宿主細胞，其中所述經(jīng)轉化宿主細胞是選自包含動物、真菌、酵母和植物細胞 之組的真核細胞，優(yōu)選地是選自包含葡萄(Vits vinifera)、煙草(Nicotiana tabacu)和擬南芥(Arabidopsis thaliana)細胞之組的植物細胞。
16.轉基因細菌，其包含根據(jù)權利要求11所述的多核苷酸或根據(jù)權利要求12所述的載體。
17.轉基因植物，其包含根據(jù)權利要求11所述的多核苷酸、根據(jù)權利要求12所述的載體、或者根據(jù)權利要求13、14或15中任一項所述的宿主細胞。
18.一種制備如權利要求17所述的轉基因植物的方法，其包括以下步驟: a.用權利要求12所述的載體轉化植物細胞； b.選擇表達如權利要求2至10和21中任一項所述之多肽的經(jīng)轉化植物細胞；以及 c.由所述經(jīng)轉化植物細胞產生轉基因植物。
19.一種產生增強的DXS酶的方法，所述酶增加植物或細菌的萜烯產生，所述方法包括以下步驟: a.培養(yǎng)如權利要求13至15中任一項所述的經(jīng)轉化宿主細胞； b.得到允許增加植物、細菌或酵母之萜烯產生的增強的DXS酶。
20.具有增強的DXS活性的多肽，其可通過根據(jù)權利要求19所述的方法得到。
21.一種在宿主細胞中產生萜烯的方法，其包括以下步驟: a.在有效產生所述萜烯的條件下培養(yǎng)如權利要求13至15中任一項所述的轉化宿主細胞； b.由所述宿主細胞得到所述 萜烯。
【文檔編號】C07K14/415GK103429612SQ201180061600
【公開日】2013年12月4日 申請日期:2011年10月20日 優(yōu)先權日:2010年10月20日
【發(fā)明者】弗利普·于格內, 埃里克·迪謝納, 迪迪?！っ窢柕蠆W盧 申請人:格諾普朗特-巴洛爾公司