前列腺相關抗原分子來源的人類白細胞抗原結合肽及其使用方法
【專利摘要】本發明公開了前列腺癌免疫治療的方法和組合物。更具體地說,公開了前列腺癌患者的治療方法,包括與免疫佐劑聯合使用或單獨使用含前列腺相關抗原分子來源HLA結合肽的組合物的給藥方法。
【專利說明】前列腺相關抗原分子來源的人類白細胞抗原結合肽及其使用方法
發明領域
[0001]本發明公開了前列腺癌免疫治療的方法和組合物。更具體地說,公開了前列腺癌患者的治療方法,包括與免疫佐劑聯合使用或單獨使用含前列腺相關抗原分子來源人類白細胞抗原(HLA)結合肽的組合物的給藥方法。
[0002]背景
[0003]前列腺癌是男性最常見惡性腫瘤之一,2006年歐洲報告的發病人數為346,000人,死亡人數約為87,000人。在美國,前列腺癌是男性最常見的癌癥診斷,也是癌癥相關死亡的第二大原因。由于前列腺特異性抗原(Prostate specific antigen, PSA)監測分析的靈敏度提高,前列腺癌可以在早期和臨床局灶階段檢測出,可以使用根治療法如手術和放射法進行治療。然而,這些患者在10年內有10 - 60%的幾率會出現PSA無癥狀增高,稱為“生化復發”。生化復發通常是指隱藏的局部癌癥復發或尚未的轉移灶發病。
[0004]在這種情況下,治療方法有外照射和雄激素剝奪(也稱為激素去除)。但是,兩種方法都沒有被證明是有效的,特別是延長患者長期存活時間方面。而且,這兩種治療方法因為多種副作用而受到限制,副作用包括心血管問題、骨質疏松癥、體重增加、神經認知衰退、形成尿道狹窄、性欲減退及陽痿風險增加,骨質疏松癥骨骼鈣鹽減少的風險、以及病理性骨折風險顯著增加。此外,有人擔心雄激素剝奪能讓雄激素非依賴性腫瘤克隆在早期形成,最終導致長期腫瘤進展進一步加快。而且,啟動雄激素剝奪治療的最佳時機存有爭議,特別是特征為低PSA值或長平均倍增時間(DT)的生化復發。鑒于這些風險,雄激素剝奪治療和外照射對早期生化復發患者的治療價值都尚有疑問。
[0005]腫瘤相關抗原(“TAA”)已被確定為潛在的癌癥免疫治療劑。已經確定了各種不同類型腫瘤和組織特異性 的大量TAA,包括那些與前列腺相關的TAA。癌癥患者前列腺腫瘤組織、腫瘤引流淋巴結和周圍循環系統中的TAA特異性T細胞鑒定以及免疫治療后特異性T細胞反應增加均表明,使用TAA控制免疫系統可能有助于治療前列腺癌。
[0006]在臨床試驗中已經對前列腺特異性TAA體內抗原提呈的各種系統進行了檢驗,包括:(1)用自體或異體腫瘤細胞進行疫苗治療;(2)構建表達粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的自體腫瘤細胞;(3)用HLA I和HLA II結合肽對樹突狀細胞進行體外沖激;(4)腫瘤-mRNA轉染的樹突狀細胞;(5)表達TAA的重組痘苗病毒。但是,這些研究多數是在雄激素抵抗型前列腺癌患者中進行的。關于雄激素剝奪治療前化學復發的雄激素敏感型患者疫苗治療的信息很少。
[0007]因此,前列腺癌患者,特別是早期生化復發患者需要有新的治療方法。
[0008]摘要
[0009]本公開涉及用于免疫治療的組合物及其使用方法。特別是,本公開涉及癌癥,尤其是前列腺癌,更具體地說是沒有接受雄激素剝奪治療、早期化學復發患者的雄激素敏感型前列腺癌的免疫治療。本公開還涉及HLA I類或II類HLA結合肽的組合物,所述HLA結合肽來源于前列腺相關抗原分子,如前列腺特異性抗原、前列腺干細胞抗原、前列腺特異性膜抗原、生存素、前列腺特異性蛋白和瞬時受體電位-p8 (“TRP-p8”)。
[0010]一方面,本公開涉及包含至少一種HLA結合肽的組合物,其中所述HLA結合肽包含來自前列腺相關抗原分子的表位。
[0011]另一方面,本公開涉及包含至少一種HLA結合肽的組合物,其中所述HLA結合肽包含來自由選自以下一組抗原中的前列腺相關抗原分子的表位:前列腺特異性抗原、前列腺干細胞抗原、前列腺特異性膜抗原、生存素、前列腺特異性蛋白和瞬時受體電位-P8。
[0012]本發明特別優選方面涉及包含至少兩種HLA結合肽的組合物,其中:(a)至少兩種HLA結合肽中有至少一種肽含序列編號:23的表位或序列編號:23的融合蛋白,該融合蛋白含有HLA-DR抗原相關不變鏈N端的80個氨基酸。(b)至少兩種肽中有至少一種肽含從下列一組中選出的表位,包括:序列編號:1至11、13至22、24至42。
[0013]優選情況是,本發明的組合物包含至少兩種由b)組氨基酸序列組成的肽。
[0014]優選組合物為本發明的組合物,其中所述組合物包含至少兩種肽,優選為至少4種肽,更優選為10種肽,由序列編號:23的氨基酸序列組成,一種肽是從下列一組序列編號中選出:序列編號:1、2、5、7、9至11、13和14,以及至少一種肽是從下列一組序列編號中選出:序列編號:15至22,24至42。
[0015]同樣,優選 組合物是本發明的組合物,其中,額外的肽是根據待治療受試者HLA組而選擇。
[0016]優選組合物為本發明的組合物,其中所述組合物包含至少4種由序列編號:23的氨基酸序列組成的肽,一種肽是從下列一組序列編號中選出:序列編號:1、2、5、7、9至11、13和14,至少一種肽是從下列一組序列編號中選出:序列編號:15至22和序列編號:24至42。
[0017]同時,優選組合物是本發明的組合物,其中,至少一種肽是II類肽。
[0018]那么,另一方面涉及本發明的組合物,進一步包括免疫佐劑或兩種或三種免疫佐劑的混合物,諸如GMCSF和咪喹莫特。
[0019]優選組合物為本發明確的組合物,其中,該免疫佐劑含有Toll樣受體激動劑,如Toll樣受體-7激動劑。
[0020]同時,優選組合物是本發明的組合物,含有至少一種抗原提呈細胞,例如樹突狀細胞,有如肽沖激或肽負載的自體樹突狀細胞。
[0021]那么,另一方面涉及本發明組合物在前列腺癌治療中的應用。
[0022]優選組合物為本發明的組合物,其中,所述前列腺癌是雄激素敏感型的并且患者沒有接受雄激素剝奪治療。
[0023]進一步優選的組合物是本發明的組合物,其中,所述前列腺癌是雄激素不敏感型的。
[0024]那么,另一方面涉及治療前列腺癌的方法,包括給予患者有效劑量的本發明組合物。
[0025]優選方法為本發明的方法,其中,所述前列腺癌是雄激素敏感型的并且患者沒有接受雄激素剝奪治療。
[0026]進一步優選的方法是本發明的方法,其中,所述前列腺癌是雄激素不敏感型的。
[0027]另一方面,本公開的組合物包含下列序列編號的表位:序列編號:24、7、1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、13、14、或序列編號:15至23或序列編號:25至40。
[0028]在另一方面,組合物至少包括兩種含有前列腺相關抗原分子來源表位的HLA結合肽,其中至少兩種HLA結合肽中有至少一種是HLA I類肽;至少兩種HLA結合肽中有至少一種是HLA II類肽。
[0029]本公開的再一方面涉及包含至少兩種HLA結合肽的組合物,其中HLA結合肽中至少有一種是HLA I類肽,它含有從下列一組中選出的表位:序列編號:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11, HLA結合肽中至少有一種是HLA II類肽,它含有從下列一組中選出的表位:序列編號:13和14。
[0030]本公開的再一方面涉及包含至少兩種HLA結合肽的組合物,其中(a)至少兩種HLA結合肽中至少有一種肽含有從下列一組中選出的表位:序列編號:24、序列編號:15至23和序列編號:25至37 ; (b)至少兩種HLA結合肽中至少有一種肽含有從下列一組中選出的表位:序列編號:7、I至6、8至11、13、14,以及序列編號:38至42。
[0031]本公開的再一方面還涉及包含至少兩種HLA結合肽的組合物,其中HLA結合肽中至少有一種是HLA I類肽,它主要含有從下列一組中選出的表位:序列編號:1、2、3、4、5、6、
7、8、9、10和11 ;HLA結合肽中至少有一種是HLA II類肽,它主要含有從下列一組中選出的表位:序列編號:13和14。
[0032]本公開的再一方 面還涉及包含至少兩種HLA結合肽的組合物,其中HLA結合肽中至少有一種是HLA I類肽,它含有從下列一組中選出的表位:序列編號:1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10和11 ;HLA結合肽中至少有一種是HLA II類肽,它含有從下列一組中選出的表位--序列編號:13和14。
[0033]本公開的再一方面還涉及包含至少兩種HLA結合肽的組合物,其中HLA結合肽中至少有一種是與等位基因而非HLA-A*02結合的HLA I類肽。
[0034]本公開的再一方面涉及包含至少兩種HLA結合肽的組合物,其中HLA結合肽中至少有一種是與選自HLA-A*24、HLA-A*11、HLA_B*41、HLA_B*51或HLA-C —組的等位基因結合的HLA I類肽。
[0035]本公開的再一方面還涉及包含至少6種HLA結合肽的組合物,其中:(a)至少一種HLA結合肽含有來自前列腺特異性抗原的表位;(b)至少一種HLA結合肽含有來自前列腺干細胞抗原的表位;(c)至少一種HLA結合肽含有來自前列腺特異性膜抗原的表位;(d)至少一種HLA結合肽含有來自生存素的表位;(e)至少一種HLA結合肽含有來自前列腺特異性蛋白的表位;(f)至少一種HLA結合肽含有來自瞬時受體電位_p8的表位。
[0036]本公開的另一方面涉及上述組合物,其中該組合物包含至少兩種由b)組氨基酸序列組成的肽。
[0037]本公開的另一方面涉及包含下列序列編號的HLA結合肽的上述組合物:序列編號:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41 和 42。
[0038]本公開的另一方面涉及上述組合物,其中所述組合物包含由下列序列編號的氨基酸序列組成的肽:序列編號:1、序列編號:2 ;序列編號:5、序列編號:7,序列編號:9至序列編號:11,序列編號:13和序列編號:14,以及至少一種肽是從下列一組序列編號中選出(可選):15至序列編號:42。[0039]本公開的另一方面涉及一種上述的組合物,其中所述組合物包含至少兩種肽,優選是至少4種肽,更優選是10種肽,由下列序列編號的氨基酸序列組成:序列編號:1、2、5、
7、9至11、13和14,至少一種肽是從下列一組序列編號中選出:序列編號:15至42。
[0040]本公開的另一方面涉及一種上述的組合物,其中所述組合物包含至少兩種肽,優選是至少4種肽,更優選是10種肽,由下列序列編號的氨基酸序列組成:序列編號:1、2、5、
7、9至11、13和14,至少一種肽是從下列一組序列編號中選出:序列編號:15至42,其中,額外的肽是根據待治療受試者HLA組而選擇。
[0041]那么,本公開的另一方面涉及上述組合物,其中,所述組合物包含至少4種由下列序列編號的氨基酸序列組成的肽:序列編號:1、2、5、7,序列編號:9至11,序列編號:13、14和序列編號:15至42。
[0042]本公開的另一方面涉及上述任一種組合物,其中,至少一種肽是II類肽。
[0043]本公開的另一方面涉及上述任一種組合物,進一步包含免疫佐劑或兩種或三種免疫佐劑的混合物,諸如GMCSF和咪喹莫特。免疫佐劑可以是任何已知的免疫佐劑,包括Toll樣受體-7激動劑咪喹莫特和粘蛋白-Ι-mRNA/精蛋白復合物,以及細胞因子_粒細胞_巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。
[0044]那么,本公開的另一方面涉及治療前列腺癌的方法,包括與免疫佐劑聯合使用或單獨給予患者此文中公開的任一種組合物。該前列腺癌可以是雄激素敏感型的,并且患者可能沒有接受過雄激素剝奪治療。
[0045]那么,本公開的另一方面還涉及治療患者雄激素敏感型或不敏感型前列腺癌的方法,該方法包括與免疫佐劑聯合使用或單獨給予患者上述任一種組合物。
[0046]附圖簡要說明
[0047]圖1顯示了實施例1所用的HLA結合肽混合物中HLA結合肽含有的各種表位,包括前列腺相關抗原分子來源的13種表位。序列編號:1至序列編號:12的表位是HLA I類表位,即HLA-A*201-限制性表位。序列編號:13至序列編號:14的表位是HLA II類表位。
[0048]圖2提供了作為一個整體的研究組的DT統計。DT用月數表示。“η”是指統計資料包含在每一類中的患者的數量。“%”是指劃分到每一類中的患者的百分比。研究結束時,由于5號患者的倍增時間是負的,所以其倍增時間沒有納入幾何平均值或范圍計算中。
[0049]圖3顯示了患者使用實施例1中所用的HLA結合肽混合物治療前、治療期間和治療后的DT變化。正值表示PSA倍增時間,是指患者的PSA水平在升高。負值表示PSA半衰期,是指患者的PSA水平在下降。
[0050]圖4顯示了按免疫佐劑類型分類的治療臨床反應。無臨床反應用符號表示。PSA加速升高之前的臨時PSA下降或穩定用符號表示。PSA下降和PSA DT增加之前的臨時PSA升高用符號表示。PSA DT增加用“ + ”符號表示。
[0051]圖5顯示了接受在montanide中的肽、但沒有接受佐劑或高溫患者的PSA水平。
[0052]圖6顯示了接受在montanide中的肽和粘蛋白-liRNA/精蛋白復合物患者的PSA水平。
[0053]圖1顯示了接受在montanide中的肽和高溫患者的PSA水平。
[0054]圖8顯示了接受在montanide中的肽和GM-CSF患者的PSA水平。
[0055]圖9顯示了接受在montanide中的肽和咪喹莫特患者的PSA水平。[0056]圖10顯示了在第84天自基準值(用百分比表示)起的PSA值的變化。
[0057]圖11顯示了接種期間PSA值(用百分比表示)的變化。
[0058]圖12顯示了接種后有T細胞對每種肽產生反應的患者數量。
[0059]圖13顯示了來自15和26號患者PBMC的⑶4+T細胞對PSMA459-473表位和生存素97-111表位的特異性。PSMA:PSMA459-473表位。生存素:生存素97-111表位。
[0060]圖14顯示了克隆Pro26_lC.PM/離子霉素的肽反應性=非抗原依賴性非特異性激活;生存素(II):用生存素97-111表位刺激;PSMA(II):用PSMA459-473表位刺激。所有反應細胞為⑶4陽性。
[0061]圖15顯示了克隆Prol5_100.PMA/離子霉素的肽反應性=非抗原依賴性非特異性激活;生存素(II):用生存素97-111表位刺激;PSMA(II):用PSMA459-473表位刺激。所有反應細胞為⑶4陽性。
[0062]圖16描述了⑶4+生存素特異性T細胞克隆Prol5_ “D”對用全長生存素或生存素97-111表位刺激的樹突狀細胞的反應特征。如胞內細胞因子染色所示,與重組生存素蛋白或生存素97-111表位孵育的未成熟樹突狀細胞可被接種患者的生存素特異性T細胞識別。這些結果表明,生存素在樹突狀細胞內被蛋白酶自然分解,分解過程不能破壞生存素97-111表位。此外,這些⑶4+T細胞是多功能的,因為它們分泌細胞因子IFN-Y、TNF-α和IL-2,具有表面表達的⑶4 0配體(⑶154),并進行⑶107a表面表達所示的脫粒。所顯示的T細胞反應具有抗原特異性,因為T細胞不被與無關蛋白RAP80或HIV-001肽孵育的樹突狀細胞激活。
[0063]圖17顯示了⑶4+生存素特異性T細胞克隆Pro26-10_C對用全長生存素、生存素97-111表位或PSMA459-473表位刺激的樹突狀細胞的反應。如胞內細胞因子染色所示,與重組生存素蛋白、生存素97-111表位和PSMA459-473表位孵育的未成熟樹突狀細胞可被接種患者的抗原特異性T細胞識別。盡管對生存素和PSMA表位都有反應,但是T細胞對生存素表位刺激的反應更強烈。這些CD4+T細胞是多功能的,因為它們分泌細胞因子IFN- Y、TNF-α和IL-2,具有表面表達的⑶40配體(⑶154),并進行⑶107a表面表達所示的脫粒。所顯示的T細胞反應是抗原特異性的,因為T細胞不被與無關蛋白RAP80孵育的樹突狀細胞激活。
[0064]圖18顯示了⑶4+生存素特異性T細胞克隆Pro26-10_C對用全長PSMA蛋白、蛋白酶K處理的PSMA蛋白或蛋白酶K處理的生存素蛋白刺激的樹突狀細胞的反應。
[0065]圖19顯示了⑶4+生存素特異性T細胞克隆Pro26-10_C對與全長生存素、生存素97-111表位、全長PSMA或PSMA459-473表位孵育的固定樹突狀細胞的反應。如胞內細胞因子染色所示,與生存素97-111表位而非全長生存素孵育的固定樹突狀細胞可被接種患者的抗原特異性T細胞識別。這證實,為了具有抗原性,全長生存素必須由抗原提呈細胞裂解。
[0066]圖20顯示了⑶4+PSMA特異性T細胞克隆Pro26-10_D對用全長生存素、生存素97-111表位、全長PSMA或PSMA459-473表位刺激的樹突狀細胞的反應。如胞內細胞因子染色所示,與PSMA459-473表位孵育的未成熟樹突狀細胞可被接種患者的抗原特異性T細胞識別。這些⑶4+T細胞是多功能的,因為它們分泌細胞因子IFN- Y、TNF- α和IL-2,具有表面表達的⑶40配體(⑶154),并進行⑶107a表面表達所示的脫粒。所顯示的T細胞反應具有抗原特異性,因為T細胞不被與生存素或生存素97-111表位孵育的樹突狀細胞激活。
[0067]圖21顯示了表達不同HLA-DR等位基因的幾個腫瘤細胞系用患者的PBMC識別(如患者Pro26和Prol5所示)。患者在用生存素97-111接種后產生多克隆T細胞反應。生存素97-111顯示與幾個HLA II類等位基因混雜結合:DR1 ;(參見Wang等的文章);DQ5 (Wang等未檢測);DR11 (參見Wang等的文章);或DRB3 (與Wang等2008年的文章表1相反)。在幾個HLA II類分子中,生存素97-111功能性展示是可能的(生成TNF-α )。至于HLA I類(HLA-A、-B、C),原則上也可以為在細胞表面表達功能性II類分子的HLA II類找到三個不同基因位點,即HLA-DQ、HLA-DP和HLA-DR。I類分子是由重鏈(_Α、-B、-C)和在三個基因中都不變的β-2-微球蛋白組成。然而,II類分子是由可變鏈的兩條鏈(α和β)組成。因此,II類分子使得復雜的基因分類變得更為復雜。在圖中,已給出基于抗體結合的所謂血清學類型。舉例來說,所以“DQ3”含有HLA-DQa和β鏈的不同等位基因,這些等位基因通常一起出現,與特定抗體反應。圖中細胞如下所示:AL=E418EBV轉化B細胞系(《人類免疫學》,1996,11,51 (I):13-22) ;LAM=B淋巴瘤細胞系(《腫瘤基因組學》,2002,9,19,21
(42):6549-6556) ;H0301=EBV 轉化 B 細胞系(《免疫學雜志》,1998,160:3363-3373) ;BM15=Drll+APC細胞系(《免疫學雜志》,2004,173:1876-1886) ;MGAR=同型結合B-LCL(《基因治療》,2004,11,1408-1415) ;LG2-EBV=自體 B 細胞系(((Cancer Immunity)),Vol.2,p.9(2002,7,19)) ;EMJ=B類淋巴母細胞系(歐洲動物細胞庫編號:8602103IHW編號9097:和《Hum Immunol)),1980,12,I (4):363-8)。
[0068]詳細說明
[0069]本公開涉及在前 列腺組織和/或前列腺腫瘤特異性抗原肽控制前列腺癌細胞免疫反應中所用的組合物及方法。
[0070]是否能刺激免疫反應取決于是否存在被宿主免疫系統視為異物的抗原。近年來,已成功鑒定了( I)在前列腺組織或前列腺腫瘤中特異表達和(2)被T細胞識別的各種抗原。當這些抗原在抗原提呈細胞(APC)中被表達為HLA分子和肽的復合物時,它們能刺激T細胞并誘導前列腺癌細胞的抗原特異性T細胞反應,最終導致腫瘤細胞裂解。例如,蛋白生存素的各種表位已被確定為前列腺TAA。現在,前列腺特異性TAA的發現和鑒定提高了運用宿主免疫系統干預腫瘤生長的可能性。對于癌癥免疫療法,目前正在探索控制免疫系統中的體液和細胞免疫的各種機制。
[0071]細胞免疫反應的特定元素是能夠特異性地識別和破壞腫瘤細胞。從腫瘤浸潤細胞群或外周血中分離出CD8+細胞毒性T細胞(“CTL”)表明,這些細胞在癌癥的天然免疫防御中發揮重要作用。特別是⑶8+T細胞,在這種反應中發揮重要作用,它能識別由主要組織相容性復合體(MHC)負載的細胞液中蛋白質或缺損核糖體產物(DRIPS)來源的8至10個殘基組成的妝的 I 類分子。(Schubert U, Anton LC, Gibbs J, Norbury CC, Yewdell Jff, BenninkJR.;Rapid degradation of a large fraction of newly synthesized proteins byproteasomes.《自然》(Nature, 2000; 404 (6779): 770-774)。
[0072]抗原提呈是通過兩大類主要組織相容性復合體(MHC)分子MHC I類和MHC II類中的一類進行的。對于人類,MHC分子被稱為人類白細胞抗原(“HLA”)分子。MHC分子有兩類:MHC I類分子,在大多數有核細胞上都能發現此類分子,其提呈主要因內源性、細胞質或細胞核蛋白質、DRIPS和較大肽蛋白裂解產生的肽。然而,源自內體結構或外源性來源的肽也經常在MHC I類分子上發現。這種I類分子非經典提呈方式在文獻中被稱為交叉提呈。MHC II類分子,主要發現于專職抗原提呈細胞(APC)上,并主要提呈在內吞作用過程中被APC攝取并隨后進行加工的外源性蛋白肽。對于I類分子,抗原加工的其他方法描述為:其允許MHC II類分子提呈來自外源性肽(如:自吞作用)。肽和MHCI類分子的復合物被CD8+細胞毒性T淋巴細胞相應TCR識別,肽和MHC II類分子的復合物被CD4陽性輔助T細胞相應TCR識別。
[0073]HLA I類分子可在人體的每個有核細胞中找到,其功能是向CD8+細胞毒性T細胞(“CTL”)展示胞質蛋白的片段。蛋白質在蛋白酶體中裂解,產生的肽被運出胞質送入內質網腔中與HLA I類分子結合。然后,抗原和HLA I類分子的復合物被運到抗原可被提呈給CTL的細胞表面。抗原提呈給CTL引發級聯反應,最終導致直接殺死表面結合抗原/HLA復合物細胞的抗原特異性CTL擴增。該過程發生在每個有核細胞中,從而能讓免疫系統精確地監測每個細胞中異物、改變的或胚胎蛋白質的存在。盡管HLA 1-類分子提呈的肽主要來自內源性胞內蛋白分子,但是有跡象表明,細胞通過巨胞飲或吞噬作用內吞的外源性抗原也可以被提呈。因此,用含HLA I類特異性表位的多肽直接免疫宿主可以誘導抗原特異性CTL反應。
[0074]與結構性表達的HLA I類分子不同,HLA II類分子幾乎只在專職抗原提呈細胞中找到,包括巨噬細胞、樹突狀細胞和B細胞。專職APC是由專職APC內吞細胞外蛋白質并在溶酶體中消化,在分子遷移到質膜前與HLA II類分子結合。HLA II類結合肽被提呈至CD4+T輔助細胞(“T輔助細胞”)。T輔助細胞沒有任何直接細胞毒活性或吞噬活性,因此不能直接殺死受感染或功能失調的宿主細胞,但是可通過誘導或增加其他免疫系統成分對受感染或功能失調細胞的反應來起作用。舉例來說,CD4+T細胞活化可導致干擾素-Y(IFNy )水平局部升高。
[0075]CD4陽性輔助T細胞在安排抗腫瘤T細胞反應的效應子功能中發揮重要作用,因此,CD4陽性T細胞.表位來源的TAA識別可能對開發引發抗腫瘤免疫反應的藥物產品非常重要。已在哺乳動物模型中證明,即使在沒有CTL的情況下,T輔助細胞局部分泌的干擾素-Y (IFNy)也可通過抑制血管生成來抑制腫瘤發展。參閱Qin,Z.and T.Blankenstein.CD4+T-cell—mediated tumor rejection involves inhibitionof angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expression bynon-hematopoietic cells.1mmunity.2000,12:677-686。此外,識別HLA II 類分子所展不TAA的T輔助細胞可通過誘導抗體反應來抵消腫瘤進展(Kennedy, R.C.,Μ.H.Shearer, A.M.Watts, and R.K.Bright.CD4+T lymphocytes play a critical role in antibodyproduction and tumor immunity against simian virus401arge tumor antigen.CancerRes.2003,63:1040-1045)。
[0076]與HLA-1類結合TAA不同,迄今只對少量HLA II類結合TAA有過描述(胃w.cancer immunity, org, www.syfpeith1.de)。因為HLA II類分子的結構性表達通常僅限于免疫系統細胞,所以直接從原發性腫瘤中分離II類肽被認為是不可能的。但是,最近有大量MHC II類表位是直接從腫瘤中確定的。而且,在腫瘤患者中驚奇地發現腫瘤細胞表達MHCII 類分子(EP1642905,EP1760088;Dengjel J, Nastke MD, Gouttefangeas C,GitsioudisG, Schoor O, Altenberend F, Miiller M, Kramer B, Missiou A, Sauter M, HennenlotterJ,Wernet Dj Stenzl A, Rammensee HG,Klingel K,Stevanovic S.;Unexpected abundanceof HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas;Clin CancerRes.2006;12:4163-4170)。
[0077]觸發細胞免疫反應的肽必須結合到MHC分子上。這一過程依賴于MHC分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特異性多態性。MHC I類結合肽長度通常為8-10個氨基酸殘基,在與MHC分子對應結合槽相互作用的序列中通常有兩個保守殘基(“錨定物”)。這樣,每個MHC等位基因都有一個決定哪些肽可以特異性結合到結合槽的“結合基序,,(Rammensee HG, Bachmann J, Stevanovic S.MHC ligands and peptide motifs, LandesBioscience, USA, 1997)。
[0078]在MHC依賴性免疫反應中,肽不僅必須能與腫瘤細胞表達的某些MHC分子結合,而且它們還必須能被T細胞的特異性T細胞受體(TCR)識別。
[0079]腫瘤特異性T淋巴細胞識別的抗原,也就是說,它們的表位,可以是所有蛋白質類中的分子,如,酶、受體、轉錄因子等。此外,腫瘤相關抗原也可以只存在于腫瘤細胞中,如突變基因產物中。另一種重要的腫瘤相關抗原是組織特異性抗原,如,表達于不同類型腫瘤和健康睪丸組織中的“癌睪丸”(CT)抗原。
[0080]近年來,已有大量TAA被成功識別和鑒定。此外,在識別其他腫瘤相關抗原方面也做了大量研究。有些腫瘤相關抗原,在本領域中也稱作腫瘤特異性抗原,具有組織特異性。實例包括(但不限于)黑色素瘤的酪氨酸酶、前列腺癌的PSA和PSMA、淋巴瘤中諸如bcr/abl的染色體交叉(易位)部位。但是,許多得到確定的腫瘤相關抗原出現于多種類型腫瘤中,有些抗原,如,實際上導致轉化事件的致癌蛋白和/或腫瘤抑制基因(腫瘤抑制基因是 Linehan WM, Walther MM, Zbar B 關于腎癌綜述 The genetic basis of cancerof the kidney.J Urol.2003Dec; 170 (6Ptl): 2163-72 中所提及的)幾乎出現于所有類型腫瘤中。例如,控制細胞生長和分化的正常細胞蛋白,如P53 (—種腫瘤抑制基因)、ras、c-met、myc、pRB、VHL和HER-2/neu可累積突變,導致這些基因產物的表達上調,從而致癌(McCartey et al.Cancer Research, 1998, 15:582601-5;Disis et al.Ciba Found.Symp.1994,187:198-211)。這些突變蛋白也可是多種癌癥的腫瘤特異性免疫反應的一個標靶。
[0081]有效或無效提呈決定了所誘導免疫反應從免疫性到耐受性的類型和程度。為了以抗原特異性方式刺激休眠、未致敏的CTL,CTL必須接收抗原提呈細胞的兩個信號。一個是通過與HLA/肽復合物相互作用的抗原特異性T細胞受體(TCR)。另一個是通過共刺激因子(B7分子、ICAM-1和其他黏附分子)或細胞因子(如IL-2)。當T淋巴細胞只收到其中一個信號時,T細胞無反應性。腫瘤細胞通常是弱APC,因為它們沒有共刺激分子,通常只顯現低HLA I類表達。此外,惡性細胞通常表達抑制針對它們免疫反應的細胞因子或表面分子。同樣地,TAA提呈給T細胞的方式對誘導腫瘤特異性免疫反應有重要意義。
[0082]對于被CTL識別為腫瘤特異性或相關抗原的蛋白質,要在治療中使用,必須滿足特定的先決條件。該抗原應主要由腫瘤細胞表達,而正常健康組織不表達或表達數量較少。更為適宜的情況是,該相應抗原不僅出現于一種腫瘤中,而且濃度(即每個細胞的相應肽拷貝數目)高。腫瘤特異性抗原和腫瘤相關抗原通常是源于由于細胞周期調控或凋亡等功能在正常細胞轉化為腫瘤細胞中直接受累的蛋白。另外,這些直接導致轉化的蛋白的下游靶標也可能會被上調,因此間接與腫瘤相關。這些間接腫瘤相關抗原也可能是預防接種方法的靶標。至關重要的是,在這兩種情況中,都存在抗原氨基酸序列的表位,所以這種來自腫瘤相關抗原的肽(“免疫原性肽”)可導致體外或體內T細胞反應。
[0083]基本上,任何能與MHC分子結合的肽都可能充當一個T細胞表位。誘導體外或體內T細胞反應的前提是存在有著相應TCR的T細胞并且沒有這個特定表位的免疫耐受性。輔助T細胞在編排抗腫瘤免疫的CTL效應子功能中發揮著重要作用。觸發Thi細胞反應的輔助T細胞表位支持CD8陽性殺傷T細胞的效應子功能,其中包括直接作用于腫瘤細胞的細胞毒性功能(該類腫瘤細胞表面顯示有腫瘤相關肽/MHC復合物)。這樣,單獨形式的或與其他腫瘤相關肽形成組合物的腫瘤相關T輔助細胞肽表位可作為刺激抗腫瘤免疫反應疫苗組合物的活性藥物成分。
[0084]對于大多數腫瘤,只有少數TAA是已知的或只定義了一特定HLA類型的TAA。與之相反,CTL識別的大量前列腺特異性抗原和前列腺癌相關抗原及肽已被成功鑒定。當這些TAA在抗原提呈細胞(APC)中被表達為HLA分子和肽的復合物時,它們能刺激T細胞并誘導抗原特異性CTL。
[0085]在免疫治療大部分經驗來自惡性黑色素瘤的研究中,表明用一個或二個TAA免疫可引起腫瘤細胞選擇,從而導致DC持續治療過程中病情發展。因為CD8和CD4依賴的兩種反應共同和協同產生抗腫瘤效果,所以⑶8+CTL (MHC I類分子)或⑶4陽性CTL (MHC II類分子)所識別的腫瘤相關抗原的識別和鑒定在研制腫瘤疫苗中很重要。
[0086]但是,激發一種CTL通常不足以去除所有的腫瘤細胞。腫瘤非常容易致突變,因而能夠通過改變它們的蛋白質圖譜來躲避CTL的識別從而快速對CTL攻擊做出反應。為了反擊腫瘤逃逸機制,在接種疫苗中,運用各種特異性肽。這樣,幾種CTL克隆可以同時對腫瘤發起大范圍地并行攻擊。這可能會減少腫瘤逃避免疫反應打擊的機會。這一假設最近已經在治療晚期黑色素瘤患者的一項臨床研究中得到證實。僅有少數例外情況,至少有三種不同T細胞反應的患者出現客觀臨床反應或病情穩定(Banchereau等,2001)及存活率升高,在此同時T細胞反應少于三種的大多數患者被診斷患有進行性疾病。
[0087]當腎細胞癌患者用含13種不同肽的疫苗治療時有類似的效果(H.Singh-Jasuja, S.Walter, T.Weinschenk, A.Mayer, P.Y.Dietrich, M.Staehler, A.Stenz I, S.Stevanovic,H.Rammen see, J.FrischjCorrelation of T — cellresponse, clinical activity and regulatory T—cell levels in renal cellcarcinoma patients treated with IMA901, a novel mult1-peptide vaccine;ASCO年會 2007Poster#3017 ;Μ.Staehler, A.Stenzlj P.Y.Dietrich, T.Eisenj A.Haferkampj J.Beck,A.Mayer, S.Walter, H.Singh, J.Frisch, C.G.Stief;An open label study toevaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccineIMA901, ASCO 年會 2007;Poster#3017)。
[0088]因此,開發一種腫瘤疫苗的主要任務不僅要識別和鑒定新型腫瘤相關抗原及其免疫原T輔助表位,而且還要組合不同抗原表位以增加每位患者對一種以上表位產生反應的可能性。
[0089]因此,提供了包含至少一種HLA結合肽的組合物,HLA結合肽包含、主要由或由前列腺相關抗原分子來源的表位組成。[0090]文中所用術語“HLA結合肽”是指能與HLA I類或HLA II類人類白細胞抗原分子結合的任何多肽。
[0091]文中所用術語“表位”是指能足以讓含有表位的分子與HLA I類或HLA II類人類白細胞抗原分子結合的氨基酸序列。識別表位的方法是此項技術中已知的方法。這些方法包括但不限于:Ca)利用單個患者的T細胞進行基因表達分析,參見van der Bruggenet al., A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes ona human melanoma, Sciencel991; 254 (5038): 1643 - 1647 ; (b)腫瘤相關妝的質譜測序,Cox et al., Identification of a peptide recognized by five melanoma-specifichuman cytotoxic T cell lines, Sciencel994; 264 (5159): 716 - 719 ; (c)“反向免疫學,,,是根據等位基因特異性肽基序用已知TAA預測表位,參見Stevanovic, Identificationof tumor-associated T-cell epitopes for vaccine development, Nat.Rev.Cancer2002;2(7):514 - 520;Celis et al., Induction of ant1-tumor cytotoxic T lymphocytesin normal humans using primary cultures and synthetic peptide epitopes, Proc.Nat’ I Acad.Sc1.USA1994;91 (6):2105 - 2109。 [0092]文中所用術語“前列腺相關抗原分子”是指含有(a)前列腺組織或(b)前列腺癌細胞差異表達分子的任何表位。典型的前列腺相關抗原分子包括:前列腺特異性抗原、前列腺干細胞抗原、前列腺特異性膜抗原、生存素、前列腺特異性蛋白和瞬時受體電位-P8。來自這些前列腺相關抗原分子的典型表位如圖1所示。而且,可以使用任何前列腺相關抗原分子來源的任何表位。
[0093]如果沒有其他說明,文中公開的HLA結合肽可以通過在肽鏈不同位點,可能是選擇性位點替換一個或多個殘基來進行修飾。此替換可能是保守性的,例如,其中一個氨基酸被具有類似結構和特點的另一個氨基酸所替換,比如其中一個疏水性氨基酸被另一個疏水性氨基酸替換。更保守的替換是具有相同或類似的大小和化學性質的氨基酸間的替換,例如,亮氨酸被異亮氨酸替換。在天然同源蛋白質家族序列變異的研究中,某些氨基酸替換比其它氨基酸替換更經常被耐受,這經常表現出同原始氨基酸與其替換物之間在大小、電荷、極性和疏水性上的相似性相關。
[0094]在本文中,保守性替換定義為在以下五種基團之一的內部進行交換:基團I一小脂肪族、非極性或略具極性的殘基(Ala,Ser,Thr,Ρι.ο,Gly);基團2—極性、帶負電荷的殘基及其酰胺(Asp,Asn,Glu,Gln);基團3—極性、帶正電荷的殘基(His,Arg,Lys);基團4一大脂肪族非極性殘基(Met,Leu, He, Val, Cys)以及基團5—大芳香殘基(Phe,Tyr, Trp)。
[0095]較不保守性替換可能涉及一個氨基酸被另一個具有類似特點但在大小上有所不同的氨基酸所替換,如:丙氨酸被異亮氨酸殘基替換。高度不保守性的替換可能涉及一個酸性氨基酸被另一個具有極性或甚至具有堿性性質的氨基酸所替換。然而,這種“激進”替換不能認為是無效的而不予考慮,因為化學作用是不完全可預測的,激進性替換可能會帶來其簡單化學原理中無法預見的偶然效果。
[0096]當然,這種替換可能涉及普通L-氨基酸之外的其它結構。因此,可能用D-氨基酸來替換公開的抗原肽中常見的L-氨基酸,這應包含在本公開的范圍之內。此外,具有非標準R基團的氨基酸(即,除了天然蛋白的20個常見氨基酸之外的R基團)也可以用于替換之目的,以生產根據本公開的免疫原和免疫原性多肽。[0097]如果在一個以上位置上的替換發現導致肽的抗原活性基本上等于或大于以下定義值,則對這些替換的組合進行測試,以確定組合的替換是否產生對肽抗原性的疊加或協同效應。肽內被同時替換的位置最多不能超過4個。
[0098]另一方面,提出了包含至少兩種HLA結合肽的組合物,其中HLA結合肽中至少有一種是HLA I類肽,至少有一種是HLA II類肽。
[0099]文中所用術語“HLA I類肽”是指含有能夠或預計能夠與HLA I類人類白細胞抗原分子相結合表位的任何多肽。例如,“HLA I類肽”包括與HLA-A2血清型特定等位基因結合的HLA-A2-限制肽,包括但不限于有HLA-A*0201、*0202、*0203、*0206或*0207 α鏈的HLA-A2血清型分子。典型的“HLA I類肽”為序列編號:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11,每個都是HLA-A*201限制肽。
[0100]本公開進一步提出了這樣的肽:它們來源于致瘤相關抗原并且有能力與MHC(HLA)II類分子充分結合,觸發人白細胞免疫反應,特別是淋巴細胞、T淋巴細胞、CD4陽性T淋巴細胞、介導Thl型免疫反應的⑶4陽性T淋巴細胞。文中所用術語“HLA II類肽”是指含有能夠或預計能夠與HLA II類人類白細胞抗原分子結合表位的任何多肽。典型的“HLA II類肽”按序列編號在圖1中列出:序列編號:13和序列編號:14。
[0101]發明的其他肽是:
[0102]
【權利要求】
1.一種組合物,包含至少兩種HLA結合肽,其中: (a)至少兩種HLA結合肽中有至少一種肽含序列編號:23的表位或序列編號:23的融合蛋白,融合蛋白含有HLA-DR抗原相關不變鏈N-端的80個氨基酸, 和 (b)至少兩種HLA結合肽中有至少一種肽含有從下列一組序列編號中選出的表位--序列編號:1至11、13至22、24至42。
2.根據權利要求1所述的組合物,其中,所述組合物包含至少兩種由b)組氨基酸序列組成的肽。
3.根據權利要求1所述的組合物,其中所述組合物包含至少兩種肽,優選為至少4種肽,更優選為10種肽,由序列編號:23的氨基酸序列組成,一種肽是從下列一組序列編號中選出:序列編號:1、2、5、7、9至11、13、14,至少一種肽是從下列一組序列編號中選出:序列編號:15至22、24至42。
4.根據權利要求3所述的組合物,其中,額外的肽根據待治療受試者HLA組而選擇。
5.根據權利要求1所述的組合物,其中,所述組合物包含至少4種由序列編號:23的氨基酸序列組成的肽,一種肽是從下列一組序列編號中選出:序列編號:1、2、5、7、9至11、13、14,至少一種肽是從下列一組序列編號中選出:序列編號:15至22、24至42。
6.根據權利要求5所述的組合物,其中,至少一種肽是II類肽。
7.根據權利要求1至6中任一權利要求所述的組合物,進一步包括免疫佐劑或兩三種免疫佐劑的混合物,諸如GMCSF和咪喹莫特。
8.根據權利要求7所述的組合物,其中,所述免疫佐劑含有Toll樣受體激動劑,如Toll樣受體-7激動劑。
9.根據權利要求1至6中任一權利要求所述的組合物,含有至少一種抗原提呈細胞,例如樹突狀細胞,像肽沖激或負載肽的自體樹突狀細胞。
10.權利要求1至9中任一權利要求所述的用于治療前列腺癌的組合物。
11.根據權利要求10所述的組合物,其中,所述前列腺癌是雄激素敏感型的并且患者沒有接受雄激素剝奪治療。
12.根據權利要求10所述的組合物,其中,所述前列腺癌是雄激素不敏感型的。
13.權利要求1至9中任一權利要求所述的治療前列腺癌的方法,包括給予患者有效劑量的組合物。
14.根據權利要求13所述的方法,其中,所述前列腺癌是雄激素敏感型的并且患者沒有接受雄激素剝奪治療。
15.根據權利要求14所述的方法,其中,所述前列腺癌是雄激素不敏感型的。
【文檔編號】C07K14/47GK103547283SQ201180059274
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2011年11月14日 優先權日:2010年12月14日
【發明者】托尼·懷申克, 彼得·萊維卓爾斯奇, 漢斯—宙戈·冉曼思, 斯蒂芬·斯蒂萬諾維奇, 賽瑟利·戈泰芬奇斯 申請人:伊瑪提克斯生物技術有限公司