用于從重組大腸桿菌純化人粒細胞集落刺激因子的方法

專利名稱：用于從重組大腸桿菌純化人粒細胞集落刺激因子的方法
技術領域：
本發明涉及用于從重組大腸桿菌純化人粒細胞集落刺激因子(hG-CSF)的方法。更具體地，本發明涉及用于以高純度和產率從重組大腸桿菌純化人粒細胞集落刺激因子(hG-CSF)的方法，其包括以下步驟:(a)培養表達hG-CSF的重組大腸桿菌以通過離心得到細胞沉淀；(b)將含hG-CSF的上清液與步驟(a)中得到的細胞沉淀分離；(c)用酸處理步驟
(b)中得到的上清液以通過過濾分離所得沉淀；(d)將步驟(C)中得到的濾出液用于陽離子交換色譜；(e)將步驟(d)中得到的洗脫液用于疏水相互作用色譜；以及(f)將步驟(e)中得到的洗脫液用于陰離子交換色譜。
背景技術：
集落刺激因子(CSF)由T細胞、巨噬細胞、成纖維細胞和內皮細胞產生，并且這些細胞廣泛分布于機體中。已知的CSF包括GM-CSF、M-CSF和G-CSF。其中，GM-CSF是粒細胞巨噬細胞集落刺激因子，并且作用于粒細胞或巨噬細胞的干細胞以誘導它們的增殖和分化，從而刺激粒細胞或巨噬細胞的集落形成。M-CSF (巨噬細胞-CSF)是巨噬細胞集落刺激因子，并用主要行使刺激巨噬細胞集落形成的功能。G-CSF (粒細胞-CSF)是粒細胞集落刺激因子，并且刺激粒細胞的集落形成和誘導最終分化。通常而言，為了分離和純化G-CSF，培養細胞并從培養上清液中分離G-CSF蛋白。但是，該方法存在G-CSF產率低的問題，并且因此不適于大量生產。另外，ChugaiPharmaceuticals C0.,Ltd.(日本)開發了一種通過使用包含編碼hG_CSF之多核苷酸的基因組DNA或cDNA在哺乳動物細胞中產生糖基化hG-CSF的方法(韓國專利N0.47178,53723和57582)。但是，已知糖基化hG-CSF的糖鏈對于hG-CSF的活性而言不是必需的，并且使用哺乳動物細胞產生糖基化hG-CSF需要`昂貴的材料和設備，因此，這樣的方法在經濟上不可行。進行了許多嘗試來通過使用原核細胞產生非糖基化hG-CSF。在這些研究中，產生了因ATG起始密碼子而在其N末端連接有甲硫氨酸殘基的hG-CSF，但該形式與其天然形式不同。此外，在微生物中產生的hG-CSF可以被來自宿主細胞或培養材料的雜質污染，并且就應用于高純度藥物而言，需要復雜的純化過程。此外，當使用大腸桿菌作為宿主細胞時，大多數hG-CSF作為不溶性包涵體沉積在細胞中，而且必須使它們通過重折疊過程轉化為活性形式，產率顯著損失。在該過程中，誘導了部分還原、分子內二硫鍵形成或錯誤二硫鍵形成，因此需要繁瑣的過程來將它們除去并且引起了效力的損失。一個半胱氨酸殘基不參與形成二硫鍵，并且因此以游離形式存在，導致額外的效力損失和蛋白質溶液穩定性的下降。因此，需要開發一種用于大量產生在其N-末端沒有甲硫氨酸殘基并因此即使使用微生物也與天然形式相同的hG-CSF的方法。為了解決這些問題，本發明人在之前已報道，通過修飾大腸桿菌耐熱腸毒素II的已知信號肽制備了具有高表達率的新的分泌信號肽(韓國專利N0.316347)，并且用于產生天然hG-CSF。此外，本發明人已制備了包含重組基因的表達載體，通過連接hG-CSF基因(而非腸毒素基因)靠近大腸桿菌耐熱腸毒素II的經修飾信號肽制備，并且他們已使用該表達載體轉化了腸桿菌，從而通過使用微生物分泌系統在周質中表達生物活性hG-CSF(韓國專利 N0.356140)。通過使用將蛋白質分泌入周質的微生物系統，可以得到可溶形式的在N-末端沒有甲硫氨酸殘基的天然hG-CSF。此外，周質蛋白質通常小于總細胞蛋白質的10%，因此，與位于細胞質中的蛋白質相比，需要不那么大量的重組蛋白純化。此外，無需細胞破碎步驟，并且可以使存在于細胞質中的糖類和核酸污染最小化。但是，因為周質產生中的低表達水平，其難以工業化。因此，迫切需要開發用于以高產率和純度純化表達蛋白的高效方法。

發明內容
技術問題因此，本發明人努力解決了現有技術的這些問題。結果他們發現可以通過以下來以高純度大量產生天然人粒細胞集落刺激因子:培養重組大腸桿菌以得到分泌蛋白質，然后以下列順序將蛋白質用于酸沉淀一陽離子交換色譜一疏水相互作用色譜一陰離子交換色譜，從而完成本發明。問題的解決方案本發明的一個目的是提供用于以高純度和產率從重組大腸桿菌純化人粒細胞集落刺激因子(hG-CSF)的方法，其包括以下步驟:(a)培養表達hG-CSF的重組大腸桿菌以通過離心得到細胞沉淀；(b)將含hG-CSF的上清液與步驟(a)中得到的細胞沉淀分離；(c)用酸處理步驟(b)中得到的上清液以通過過濾分離所得沉淀；(d)將步驟(C)中得到的濾出液用于陽離子交換色譜；(e)將步驟(d)中得到的洗脫液用于疏水相互作用色譜；以及(f)將步驟(e)中得到的洗脫液用于陰離子交換色譜。本發明的另一目的是提供通過上述方法從重組大腸桿菌分離和純化的具有高純度的生理活性無變體hG-CSF。本發明的有利作用根據本發明的方法，可以容易地以高產率和純度純化與在人體中表達的天然形式相同的人粒細胞集落刺激因子而無需其他活化過程。具體地，根據本發明的方法，高效地除去在大腸桿菌中表達的hG-CSF變體以得到具有高純度的生理活性hG-CSF。附圖簡述

圖1示出了得自根據本發明的純化方法從重組大腸桿菌的周質純化的hG-CSF的滲透提取(osmotic extraction)、酸沉淀、陽離子交換色譜和疏水相互作用色譜步驟之各溶液的SDS-PAGE結果，其中泳道1:標準品泳道2: 步驟(b)首次離心的上清液泳道3:步驟(b) 二次離心的上清液泳道4:通過步驟(C)的酸沉淀得到的上清液
泳道5:通過步驟(C)的過濾得到的濾出液泳道6:步驟⑷的SP-瓊脂糖柱的柱流泳道7:步驟(d)的SP-瓊脂糖柱的柱洗脫液I流泳道8:步驟⑷的SP-瓊脂糖柱的柱洗脫液2流泳道9:步驟(e)的丁基-瓊脂糖柱的柱流2流泳道10:步驟(e)的丁基-瓊脂糖柱的柱洗脫液2流；圖2示出通過本發明純化方法的陰離子交換色譜得到的柱洗脫液的SDS-PAGE結
果O圖3示出通過本發明純化方法的陰離子交換色譜得到的柱洗脫液的反相高壓色
並奸里5口術。圖4示出通過本發明純化方法的陰離子交換色譜得到的柱洗脫液的大小排阻高壓色譜結果。用于實施本發明的最佳方式本發明提供了用于以高純度簡單地從重組大腸桿菌純化大量人粒細胞集落刺激因子(hG-CSF)而無需其他活化過程的方法。具體地，根據本發明的純化方法可包括以下步驟:(a)培養表達hG-CSF的重組大腸桿菌以通過離心得到細胞沉淀；(b)將含hG-CSF的上清液與步驟(a)中得到的細胞沉淀分離；(c)用酸處理步驟(b)中得到的上清液以通過過濾分離所得沉淀；(d)將步驟(C)中得到的濾出液用于陽離子交換色譜；(e)將步驟(d)中得到的洗脫液用于疏水相互作用色譜；以及(f)將步驟(e)中得到的洗脫液用于陰離子交換色譜。根據本發明的純化方法，其特征在于在酸沉淀之后，將得自重組大腸桿菌的hG-CSF用于一系列色譜步驟(陽離子交換色譜、疏水相互作用色譜和陰離子交換色譜)，從而分離適于藥用的高純度hG-CSF。在下文中，將對根據本發明的純化方法的各步驟進行詳細描述。步驟(a)是培養表達hG-CSF的重組大腸桿菌以通過離心獲得細胞沉淀的步驟。用于該步驟的重組大腸桿菌是表達hG-CSF的任一重組大腸桿菌，優選在周質中表達hG-CSF的任一重組大腸桿菌，而沒有限制。更優選地，本發明的hG-CSF是在大腸桿菌中表達的可溶性hG-CSF。在本發明中，在周質中表達hG-CSF的重組大腸桿菌是用包含編碼分泌信號序列與hG-CSF之融合蛋白的融合基因的表達載體轉化的重組大腸桿菌。重組大腸桿菌的有代表性的實例包括在本發明人的韓國專利N0.356140中公開的HM10310、HM10311 (KCCM-10154)、HM10409、HM10410 (KCCM-10151)、HM10411 (KCCM-10152)、HM10413、HM10414、HM10415、HM10510(KCCM-10153)、HM10511 和 HM10512，在該專利中，重組大腸桿菌通過大腸桿菌耐熱腸毒素II的經修飾信號肽與hG-CSF的融合制備的表達載體來轉化，但不限于此。為了在重組大腸桿菌的周質中表達hG-CSF，可以通過分批培養將重組大腸桿菌培養在含有補充有以下成分之LB培養基的發酵器中:1至300g/L作為碳源的葡萄糖、2至15g/L ΚΗ2Ρ04、0.5 至 3g/L (NH4)2HPO4,2 至 10g/L NaCl 和 0.5 至 10g/L 作為礦物質的 MgCl2、多種微量元素、酵母提取物和胰蛋白胨。該培養基組成適合用于重組大腸桿菌的高密度培養以及hG-CSF在大腸桿菌周質中的高表達。在本發明的一個優選實施方案中，使用重組大腸桿菌HM10411 (KCCM-10152)進行實驗，結果發現培養基組成大大增加了重組大腸桿菌的細胞密度、hG-CSF在大腸桿菌中的表達水平和hG-CSF分泌入周質中的速率。離心所得的大腸桿菌培養肉湯以得到細胞沉淀。步驟(b)是將含hG-CSF的上清液與步驟(a)中得到的細胞沉淀分離的步驟。在本發明的一個優選實施方案中，當使用在周質中表達hC-CSF的重組大腸桿菌時，可以通過滲透提取將周質蛋白質(包括hG-CSF)與細胞分離。鑒于此，步驟(b)可包括向細胞沉淀中添加含蔗糖的緩沖溶液以通過離心得到細胞沉淀的步驟；和向細胞沉淀中添加蒸餾水以通過離心得到含周質蛋白質的上清液的步驟。在該步驟中，通過滲透壓來提取周質蛋白質(包括hG-CSF)。首先，當用含蔗糖的緩沖溶液(例如，含10%至30%蔗糖的緩沖溶液)處理細胞沉淀時，細胞收縮。然后，當再用蒸餾水處理細胞沉淀時，收縮的細胞膨脹并且細胞壁松弛。因此，細胞壁未被破壞，但存在于細胞膜與細胞壁之間的周質蛋白質(包括hG-CSF)通過松弛的細胞壁提取。在步驟(b)的滲透提取中，可以使用蔗糖、葡萄糖、MgCl2、氯化鈉等。優選地，使用蔗糖緩沖溶液。離心提取物以得到含周質蛋白質的上清液。步驟(c)是用酸處理步驟(b)中得到的含hG-CSF的上清液以通過過濾分離所得沉淀的酸沉淀步驟。在本發明的一個優選實施方案中，當使用在周質中表達hG-CSF的重組大腸桿菌時，可以通過酸沉淀來將含可溶性hG-CSF的上清液與包括周質蛋白質的上清液分離。具體地，當用酸處理步驟(b)中得到的上清液以將上清液的pH調節為5.0至5.8(優選為5.3至5.5)時，沉淀了上清液中包括周質蛋白質的不溶性材料，并通過過濾除去該沉淀以得到包含可溶性hG-CSF的上清液。適于步驟(c)的酸沉淀的酸的實例包括乙酸、磷酸、檸檬酸等，優選為乙酸。過濾可以使用適當的濾器進行，并且優選為0.45 μ m至3 μ m濾器。因為在本發明中使用了將hG-CSF分泌入周質的重組大腸桿菌，所以不需要破壞大腸桿菌，并且可以容易地從培養肉湯中獲得周質級分以提取hG-CSF。步驟(d)是將步驟(C)中得到的包含可溶性hG-CSF的濾出液用于陽離子交換色譜的步驟。通過該步驟，可以除去來自宿主細胞或培養物質的大量雜質以提高純化效率。本發明中所使用的陽離子交換色譜的柱官能團可包括弱陽離子(例如羧甲基-(CM-)和羧基(C-))和強陽離子(例如磺基(S-)、磺甲基(SM-)、磺乙基(SE-)、磺丙基(SP-)和磷酸基(P-))。可以使用多種柱樹脂，包括sepharose (瓊脂糖凝膠)、sephadex (葡聚糖凝膠)、agarose(瓊脂糖)、sephacel (球狀纖維素)、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、纖維素和toyopearL.在本發明的一個優選實施方案中，可以使用SP-sepharose (SP-瓊脂糖凝膠)柱通過陽離子交換色譜進行純化方法。在本發明中，使用含乙酸的緩沖溶液作為洗脫劑(pH范圍為4.0至6.0，優選為pH5.0至6.0，鹽濃度為500mM或更少、優選為200mM至500mM)來進行陽離子交換色譜。在加載洗脫液之前，可以用緩沖溶液來平衡待使用的陽離子交換柱。可以使用pH為5.0至
6.0(其可以根據條件適當地選擇)的水性緩沖溶液進行陽離子交換柱的平衡。在本發明的一個優選實施方案中，提前用含IOmM醋酸鈉的緩沖溶液(pH5.4)平衡陽離子交換柱。加載含hG-CSF的濾出液并吸附到經平衡的陽離子交換柱上之后，用平衡緩沖溶液沖洗柱以除去未吸附到柱上的蛋白質和雜質。 然后，將通過向平衡緩沖溶液中添加氯化鈉制備的洗脫緩沖溶液用于陽離子交換柱，以洗脫吸附到柱上的hG-CSF。對此，優選地使用3至7個柱體積的洗脫緩沖溶液。在本發明的一個優選實施方案中，將4至6個柱體積的含5至20mM醋酸鈉和300至400mM NaCl的緩沖溶液(pH5.2至5.6)用于柱以洗脫吸附到柱上的hG-CSF。在上述步驟中，來自宿主細胞的肽或培養基中的成分通過柱或者在洗滌步驟中除去，以有效地除去大量雜質。步驟(e)是將在步驟(d)中從陽離子交換色譜得到的洗脫液用于疏水相互作用色譜的步驟(e)，并且是通過進一步除去包含于從前一步驟的陽離子交換色譜得到的洗脫液中的雜質來提高純度的步驟。本發明中所使用的疏水相互作用色譜可以使用具有疏水的、合適地為脂肪族的或芳族的、與多種市售基質連接的不帶電荷配體的膠上進行。可以通過常規偶聯技術使配體與基質相偶聯從而提供不帶電荷配體。此類技術的實例包括使用環氧甘油醚(glycidyl-ether)偶聯的方法；用水中的環氧丙氧基三甲氧基娃燒活化瓊脂糖基質，然后在醇中固定配體的方法；用雙環氧化物(例如，1，4_ 丁二醇二環氧甘油醚)活化瓊脂糖基質，然后與配體(例如氨基烷基或烷基硫醇)偶聯的方法；1，1-羰二咪唑活化方法；和二乙烯砜活化方法。得自上述技術的凝膠在整個pH范圍內不帶電荷。脂肪族配體的實例可包括直鏈烷基(例如丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基)，支鏈烷基(例如異烷基或新烷基)，以及寡聚乙二醇。芳族配體優選為苯基。基質可以適當地選自多種強親水性基質，例如，瓊脂糖基質(例如瓊脂糖凝膠)、有機聚合物基質(例如TSK-GEL)，以及聞度多孔有機聚合物基質。優選的基質是瓊脂糖基質。合適的瓊脂糖基質是瓊脂糖凝月父(Amersham Biosciences)、Bio-Gel A (Bio-Rad Laboratories)、Minileak(Kem-En-TecDiagnostics A/S)等。在本發明的一個優選的實施方案中,本發明的疏水相互作用色譜在butyl-sepharose ( 丁基瓊脂糖凝膠)上實施。

在本發明中，使用pH范圍為pH7.0至8.5 (優選為pH7.5至8.0)、鹽濃度為IOOmM或更少(優選為O至50mM)的緩沖劑作為洗脫液來進行疏水相互作用色譜。在加載洗脫液之前，可以用緩沖溶液平衡待使用的疏水相互作用柱。可以使用pH為6.8至8.5 (其可以根據條件適當地選擇)的水性緩沖溶液進行疏水相互作用柱的平衡。在本發明的一個優選實施方案中，提前用含300mM硫酸銨和IOmM Tris的緩沖溶液(pH7.5)平衡疏水相互作用柱。將前一步驟中得到的洗脫液加載到經平衡的疏水相互作用柱上以吸附hG-CSF之后，用平衡緩沖溶液洗滌柱以除去未吸附到柱上的蛋白質和雜質。然后，將通過從平衡緩沖溶液中除去硫酸銨而制備的洗脫緩沖溶液用于疏水相互作用柱，以洗脫吸附到柱上的hG-CSF。對此，優選地施用I至4個柱體積的洗脫緩沖溶液。在本發明的一個優選實施方案中，將
1.2至2.5個柱體積的含5至20mM Tris的緩沖溶液(pH7.0至8.0)用于柱以洗脫吸附到柱上的hG-CSF。一般而言，在進行疏水相互作用色譜之前，可以向級分中添加鹽以提高級分的傳導性。其后，使用低離子強度緩沖劑從基質進行洗脫。優選地，在本發明的疏水相互作用色譜中，將硫酸銨添加到步驟(d)中得到的洗脫液中，以提高其傳導性，與平衡緩沖溶液類似。然后，將洗脫液加載到經平衡的疏水相互作用柱上。在本發明的疏水相互作用色譜中，還可以加載從前述步驟的陽離子交換色譜得到的洗脫液而無需預處理，并且hG-CSF被吸附到柱上。雜質通過柱或者在沖洗步驟過程中除去，以進一步提高純化效率。
步驟(f)是將在步驟(e)中從疏水相互作用色譜得到的洗脫液用于陰離子交換色譜的步驟，并且是完全除去從前一步驟的疏水相互作用色譜得到的洗脫液中所包含的雜質的步驟。本發明的陰離子交換色譜通常使用包含衍生有三胺基團或四胺基團(例如，二乙基氨基乙基(diethylamnoethyl)、三乙基氨基乙基、芐基-二乙基氨基乙基)的不溶性顆粒支持物的基質進行的。合適的支持物包括纖維素、瓊脂糖、葡聚糖和聚苯乙烯珠。優選地，支持物衍生有三乙基氨基乙基基團。合適的陰離子交換基質的實例包括Q-s印harose (Q-瓊月旨糖凝膠)(Amersham Biosciences)、Macro-Prep Q (Bio-Rad Laboratories)、Q-HyperD (BioSepra, Inc.) > Fractogel EMD-TMAE650 (Merck)等。在本發明的一個優選實施方案中，使用Q-瓊脂糖凝膠來實施本發明的陰離子交換色譜。在本發明中，使用pH范圍為ρΗ6.8至8.5 (優選為ρΗ7.0至8.0)、鹽濃度為300mM或更少(優選為100至250mM)的緩沖溶液作為洗脫液來進行陰離子交換色譜。在加載洗脫液之前，可以使用緩沖溶液來平衡待使用的陰離子交換色譜。可以使用pH6.8至8.5(其可以根據條件適當地選擇)的水性緩沖溶液進行陰離子交換柱的平衡。在本發明的一個優選實施方案中，提前用含IOmM Tris和IOOmM脲的緩沖溶液(pH7.5)平衡陰離子交換柱。將前一步驟中得到的洗脫液加載到經平衡的陰離子交換柱上以吸附hG-CSF之后，用平衡緩沖溶液沖洗柱以除去未吸附到柱上的蛋白質和雜質。然后，將通過向平衡緩沖溶液中添加氯化鈉而制備的洗脫緩沖溶液用于陰離子交換柱，以洗脫吸附到柱上的hG-CSF。對此，優選地施用1.5至5個柱體積的洗脫緩沖溶液。在本發明的一個優選實施方案中，將2至4個柱體積的含5至20mM Tris,50至200mM脲和150至250mM NaCl的緩沖溶液(pH7.0至
8.0)用于柱以洗脫吸 附到柱上的hG-CSF。如上所述，通過根據本發明的酸沉淀和一系列色譜純化hG-CSF，并且經純化的hG-CSF經過反相高效色譜和大小排阻色譜。結果以高產率得到了純度為99%或更高的hG-CSF。具體地，N-末端序列分析的結果示出根據本發明的方法純化的hG-CSF的具有與天然hG-CSF的序列相同的序列，并且經純化的hG-CSF包含100ng/ml或更少的來自宿主細胞的蛋白質、100pg/mg或更少的來自宿主細胞的DNA和10EU/IU hG-CSF或更少的腸毒素，并且示出極佳的生理活性。這些結果表明，當根據本發明的純化方法純化分泌到重組大腸桿菌中的周質中的hG-CSF時，可以得到高產率的具有高生理學活性和純度的hG-CSF，并且還可以克服效力的損失和柱的有限選擇。因此，根據本發明的純化方法純化的hG-CSF和包含所述的hG-CSF作為活性成分的藥物組合物也包括在本發明的范圍內。藥物組合物的制備及其作用對于本領域技術人員而言是公知的，因此，將省略其詳細描述。此外，根據本發明的純化方法的特征在于，可以以高產率和純度從重組大腸桿菌的大量培養肉湯中純化hG-CSF。如本文所使用的，術語“大量培養肉湯”是指通過在50L或更多(優選為80L或更多并且更優選IOOL或更多)的培養基中以發酵水平培養重組大腸桿菌得到的培養肉湯。在本發明的一個優選實施方案中，將重組大腸桿菌接種在IL滅菌培養基中以得到原代種子培養肉湯，并將該種子培養肉湯接種在14L的滅菌培養基中以得到二代種子培養肉湯。最后，將二代種子培養肉湯接種在120L的滅菌培養基中，然后發酵。使用其他培養基來進行補料分批培養，從而得到180L的重組大腸桿菌的培養肉湯。當根據韓國專利N0.356140中所述的方法從重組大腸桿菌的大量培養肉湯中分離和純化hG-CSF時，每升只產生了 70mg的hG-CSF。即，常規方法的限制在于其難以以高純度和產率產生期望蛋白質。但是，根據本發明的純化方法，即使培養肉湯的體積按比例增加到100L或更高，也可以通過酸沉淀和一系列色譜以110mg/L或更高的產率得到純度為99%或更高的hG-CSF。因此，根據本發明的純化方法可以有效地用于從重組大腸桿菌的大量培養肉湯中分離和純化hG-CSF。因此，可以通過其工業應用獲得較高的產率。本發明的實施方式在下文中，將參照以下實施例對本發明進行更詳細的描述。但是，這些實施例僅出于說明的目的，并且本發明不旨在受這些實施例限制。參考實施例1:在周質中表達hG-CSF的重組大腸桿菌的培養將用表達載體T017SG (具有大腸桿菌耐熱腸毒素II的經修飾信號肽與hG_CSF的融合物)轉化的大腸桿菌HM10411(KCCM-10152，韓國專利N0.356140)接種在含有ILLB培養基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L)的玻璃培養容器中以進行原代種子培養。在劇烈攪拌和通風的條件下，將培養基在37°C下培養11至13小時，然后接種在含有14L的滅菌LB培養基的培養容器中以進行二代種子培養2至3小時。將所得的培養肉湯用作用于發酵的種子，并接·種在120L的滅菌培養基(補充有1.4g/L作為碳源的葡萄糖、IOg/L KH2PO4,2.5g/L(NH4)2HP04、5g/L NaCl 和 1.2g/L 作為礦物質的 MgCl2、多種微量元素、酵母提取物和胰蛋白胨)中。在發酵過程中，添加另外的葡萄糖和酵母提取物以進行補料分批培養25小時或更長，并且完成培養以得到180L的培養肉湯。完成發酵之后，以7，OOOrpm離心經發酵肉湯，將所得細胞沉淀在_70°C儲存。實施例1:從重組大腸桿菌的培養肉湯純化hG-CSF<!-!>周質蛋白質的滲透提取將在參考實施例中得到的大腸桿菌沉淀懸浮在170L的蔗糖緩沖溶液(20%蔗糖、ImM EDTA、30mM Tris, pH7.5)中，攪拌90分鐘，然后以7，OOOrpm進行首次離心，從而分離沉淀。在4°C向所分離的沉淀中添加170L的蒸餾水，以7，OOOrpm進行二次離心以除去沉淀并分離包含周質蛋白質的上清液。在該過程中，提取存在于大腸桿菌周質中的蛋白質。通過SDS-PAGE分析首次離心和二次離心過程中得到的上清液(圖1的泳道2和3)。<1~2> 酸沉淀將1%的乙酸添加到在實施例〈1-1>中得到的含周質蛋白質的上清液中以將pH調節為5.6至5.7。此時，通過酸處理沉淀包含于上清液中的不溶性材料，進行過濾以將它們除去，以得到含hG-CSF的上清液。通過SDS-PAGE分析通過酸處理得到的上清液和通過過濾得到的濾出液(圖1的泳道4和5)。<1~3>陽離子奪換色譜按照如下所述使用SP-瓊脂糖凝膠進行實施例〈1-2>中得到的濾出液的陽離子交換色譜。以40cm/小時的流量加載濾出液并吸附到用緩沖溶液I (IOmM醋酸鈉，pH5.4)平衡的SP-瓊脂糖柱上，然后通過用相同的緩沖溶液沖洗來除去未吸附到柱上的蛋白質。然后，將5個柱體積的含300mM氯化鈉的緩沖溶液I (IOmM醋酸鈉，pH5.4)用于柱以從柱洗脫hG-CSF。通過SDS-PAGE分析通過陽離子交換色譜得到的流和洗脫液(圖1的泳道6至8)。
〈1-4>疏水相互作用色譜通過添加硫酸銨來將實施例〈1-3>中得到的洗脫液稀釋為終濃度為300mM，并且按照如下所述使用丁基瓊脂糖凝膠柱進行疏水相互作用色譜。以80cm/小時的流量加載洗脫液并吸附到用緩沖溶液2 (300mM硫酸銨，IOmM Tris、pH7.5)平衡的丁基瓊脂糖凝膠柱上，然后通過用相同的緩沖溶液沖洗來除去未吸附到柱上的蛋白質。然后，將1.5個柱體積的緩沖溶液2(10mM Tris，pH7.5)(硫酸銨除外)用于柱以從柱洗脫hG-CSF。通過SDS-PAGE分析通過疏水相互作用色譜得到的流和洗脫液(圖1的泳道9和10)。<1~5>陰離子奪換色譜通過添加脲來將實施例〈1-4>中得到的洗脫液稀釋為終濃度為50mM，并且按照如下所述使用Q-瓊脂糖凝膠柱進行陰離子交換色譜。以60cm/小時的流量加載洗脫液并吸附到用緩沖溶液3 (IOmM Tris, pH7.5，IOOmM脲)平衡的Q-瓊脂糖凝膠柱上，然后通過用相同的緩沖溶液洗滌來除去未吸附到柱上的蛋白質。然后，將3個柱體積的含250mM氯化鈉的緩沖溶液3 (IOmM Tris, pH7.5，IOOmM脲)用于柱以從柱洗脫hG-CSF。通過SDS-PAGE分析通過陰離子交換色譜得到的洗脫液(圖2的泳道2)。為了檢查通過實施例〈1-1>至〈1-5>的方法從重組大腸桿菌純化的hG-CSF的純度，進行SDS-PAGE、N-末端序列分析、反相高壓色譜和大小排阻高壓色譜。

實驗性實施例1 =SDS-PAGE分析首先，根據常規方法通過SDS-PAGE分析實施例〈1_1>至〈1_5>的各方法中得到的上清液、柱流和柱洗脫液和標準G-CSF (NIBSC，Code N0.88/502)。SDS-PAGE的結果示于圖1和2中。在圖1中，泳道I是標準G-CSF，泳道2是通過實施例〈1-1>的滲透提取得到的首次離心的上清液，泳道3是通過實施例〈1-1>的滲透提取得到的二次離心的上清液，泳道4是在實施例〈1-2>的酸沉淀步驟中通過酸處理得到的上清液，泳道5是在實施例〈1-2>的酸沉淀步驟中通過過濾得到的濾出液，泳道6是從實施例〈1-3>的SP-瓊脂糖凝膠柱色譜得到的柱流，泳道7和8是從實施例〈1-3>的SP-瓊脂糖凝膠柱色譜得到的柱洗脫液I和2，泳道9是從實施例〈1-4>的丁基瓊脂糖凝膠柱色譜得到的柱流，以及泳道10是從實施例<1-4>的丁基瓊脂糖柱色譜得到的柱洗脫液。在圖2中，泳道I是標準Met-hG-CSF，泳道2是實施例〈1-5>的Q-瓊脂糖凝膠柱色譜得到的柱洗脫液。SDS-PAGE分析的結果顯示，根據本發明的純化方法從重組大腸桿菌中分離和純化的hG-CSF之分子量與天然形式的分子量相等。實驗性實施例2:N-末端序列分析將通過實施例〈1_>至〈1-5>的方法純化的hG-CSF在SDS-PAGE凝膠上進行電泳，并轉染到PVDF膜上。使用Ponceau S溶液對經轉染的膜進行染色，然后在韓國基礎科學研究院(漢城分院)分析N-末端序列(15個氨基酸)。結果發現根據本發明的純化方法從重組大腸桿菌分離和純化之hG-CSF的N-末端序列與天然形式的N-末端序列相同，并且其包含100ng/mg或更少的來自宿主的蛋白質、100pg/mg或更少的來自宿主的DNA和10EUAU hG-CSF或更少的腸毒素。實驗性實施例3:反相高壓色譜將實施例〈1-5>中得到的洗脫液用于丁基甲硅烷基二氧化硅柱，然后向柱中添加0.1% TFA/水和0.1% TFA/乙腈作為流動相以進行反相高壓色譜。所得色譜圖示于圖3中。如圖3所示，發現根據本發明的純化方法從重組大腸桿菌分離和純化的hG-CSF通過有效除去具有類似特征的微變體(microvariants)而具有非常高的純度。實驗性實施例4:大小排阻高壓色譜將實施例〈1-5>中得到的洗脫液用于親水二氧化硅凝膠柱(分子量為20，000至200，000)，然后向柱中添加20mM磷酸鉀(pH6.0)/200mM氯化鈉作為流動相以進行大小排阻
高壓色譜。所得色譜示于圖4中。如圖4所示，發現根據本發明的純化方法從重組大腸桿菌分離和純化的hG-CSF通過有效除去具有類似特征的肽而具有非常高的純度。在實驗性實施例1至4中，證實可以根據本發明的純化方法以110mg/L重組大腸桿菌的培養肉湯的產率得到純度為99%或更高的天然hG-CSF。作為比較組，根據韓國專利N0.356140中所公開的純化方法(離子交換樹脂、吸附和凝膠過濾柱或抗體柱色譜)從重組大腸桿菌純化了 hG-CSF，并且以70mg/L培養肉湯的產率得到了純度為99%或更高的hG-CSF。該結果表明與韓國專利N0.356140中所公開的方法相比，可以通過本發明的純化方法以50%或更高的提高的產率得到純度為99%或更高的hG-CSF。實驗性實施例5:離體效力測試為了檢查根據本發明的純化方法得到的hG-CSF的生理學活性，使在實施例〈1-5>和國際標準(NIBSC)中純化的hG-CSF在來自小鼠骨髓細胞中進行離體效力測試。具體地，切開4至6周齡小鼠的股骨，獲得骨髓細胞，然后以適當的密度培養。將經純化的hG-CSF和國際標準樣本與經培養的骨髓細 胞以多種濃度(100.00,33.33、11.11,3.70、1.23,0.41、
0.14,0.05,0.02,0.01ng/ml)混合，并培養2至3天。向培養基中添加[甲基-H2]胸腺嘧啶，再將細胞培養10至20小時。然后，分離細胞，并使用β-計數器測量CPM。結果發現根據本發明的純化方法分離和純化的hG-CSF滿足0.6至1.4X 108IU/mg的國際標準。工業實用性本發明的方法可以容易地以高產率和純度純化人粒細胞集落刺激因子(與在人體中表達的天然形式相同)，而無需其他活化過程。特別地，根據本發明的方法，高效地除去在大腸桿菌中表達的hG-CSF變體以得到具有高純度的生理活性hG-CSF。
權利要求
1.用于以高產率從重組大腸桿菌(E.coli)純化人粒細胞集落刺激因子(hG-CSF)的方法，其包括以下步驟: (a)培養表達hG-CSF的重組大腸桿菌以通過離心得到細胞沉淀； (b)將含hG-CSF的上清液與步驟(a)中得到的細胞沉淀分離； (c)用酸處理步驟(b)中得到的上清液以通過過濾分離所得沉淀； (d)將步驟(C)中得到的濾出液用于陽離子交換色譜； (e)將步驟(d)中得到的洗脫液用于疏水相互作用色譜；以及 (f)將步驟(e)中得到的洗脫液用于陰離子交換色譜。
2.根據權利要求1所述的方法，其中在步驟(a)中，所述hG-CSF表達于重組大腸桿菌的周質中。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述重組大腸桿菌是選自以下的一種或更多種:大腸桿菌BL21 (DE3) /pT14SSlSG(HM10310)、大腸桿菌BL21 (DE3)/pT14SSlS17SEG(HM10311 ；登記號 KCCM-1O154)、大腸桿菌 BL21 (DE3)/pTOlSG (HM10409)、大腸桿菌 BL21 (DE3) /PT01S17SG (HM1041 0 ;登記號 KCCM-10151)、大腸桿菌 BL21 (DE3) /pT017SG (HM10411 ；登記號 KCCM-10152)、大腸桿菌 BL21 (DE3)/pT017TG (HM10413)、大腸桿菌 BL21 (DE3) /PT017AG (HM10414),大腸桿菌 BL21 (DE3)/pT017GG (HM10415)、大腸桿菌 BL21(DE3)/PBAD2M3VG (HM10510 ;登記號 KCCM-10153)、大腸桿菌 BL21 (DE3)/pBAD17SG(HM10511)以及大腸桿菌 BL21(DE3)/pBAD2M3V17SG(HM10512)。
4.根據權利要求1所述的方法，其中在步驟(b)中，通過滲透提取將所述含hG-CSF的上清液與所述細胞沉淀分離。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述滲透提取通過以下來進行:用含10%至30%蔗糖的緩沖溶液處理所述細胞沉淀以通過離心得到細胞沉淀，向所述細胞沉淀中添加蒸餾水，然后進行離心。
6.根據權利要求1所述的方法，其中在步驟(c)中，通過酸處理將所述上清液的pH調節為5.0至5.8。
7.根據權利要求1所述的方法，其中步驟(c)的所述酸選自乙酸、磷酸和檸檬酸。
8.根據權利要求1所述的方法，其中通過使用選自瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、瓊脂糖、球狀纖維素、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、纖維素和toyoperl的柱來進行步驟(d)的所述陽離子交換色譜。
9.根據權利要求8所述的方法，其中使用SP-瓊脂糖凝膠柱來進行步驟(d)的所述陽離子交換色譜。
10.根據權利要求1所述的方法，其中使用pH范圍為4.0至6.0、鹽濃度為200mM至500mM的含乙酸的緩沖溶液來進行步驟(d)的所述陽離子交換色譜。
11.根據權利要求10所述的方法，其中使用pH為5.0至6.0的含200mM至500mM氯化鈉和5mM至20mM乙酸鈉的緩沖溶液來進行步驟(d)的所述陽離子交換色譜。
12.根據權利要求1所述的方法，其中使用具有選自丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基、異烷基、新烷基和寡聚乙二醇的官能團的瓊脂糖凝膠、Bio-Gel A或Minileak柱來進行步驟(e)的所述疏水相互作用色譜。
13.根據權利要求12所述的方法，其中使用丁基瓊脂糖凝膠柱來進行步驟(e)的所述疏水相互作用色譜。
14.根據權利要求1所述的方法，其中使用pH范圍為7.0至8.5、鹽濃度為OmM至IOOmM的緩沖溶液來進行步驟(e)的所述疏水相互作用色譜。
15.根據權利要求14所述的方法，其中使用pH為7.0至8.0的含5mM至20mM Tris的緩沖溶液來進行步驟(e)的所述疏水相互作用色譜。
16.根據權利要求1所述的方法，其中使用選自Q-瓊脂糖凝膠、Macro-PrepQ、Q-HyperD和Fractogel EMD-TMAE650的柱來進行步驟(f)的所述陰離子交換色譜。
17.根據權利要求16所述的方法，其中使用Q-瓊脂糖凝膠柱來進行步驟(f)的所述陰離子交換色譜。
18.根據權利要求1所述的方法，其中使用pH范圍為6.5至8.5、鹽濃度為IOOmM至300mM的緩沖溶液來進行步驟(f)的所述陰離子交換色譜。
19.根據權利要求18所述的方法，其中使用pH為7.0至8.0的包含IOOmM至300mM氯化鈉、5mM至20mM Tris和50mM至200mM脲的緩沖溶液來進行步驟(f)的所述陰離子交換色譜。
20.具有高純度的人粒細胞集落刺激因子(hG-CSF)，其根據權利要求1所述的方法從重組大腸桿菌分離 和純化。
全文摘要
本發明提供了一種用于以高產率和純度從重組大腸桿菌純化大量人粒細胞集落刺激因子(hG-CSF)的方法。根據本發明的方法，可以容易地以高產率和純度純化與在人體中表達的天然形式相同的人粒細胞集落刺激因子而無需其他活化過程。特別地，根據本發明的純化方法，高效地除去在大腸桿菌中表達的hG-CSF變體以得到具有高純度的生理活性hG-CSF。
文檔編號C07K1/16GK103228672SQ201180056986
公開日2013年7月31日 申請日期2011年10月26日 優先權日2010年10月29日
發明者崔圣喆, 金鎮基, 吳映學, 李鐘守 申請人:韓美科學株式會社