專利名稱：Ephrin B2抗體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫學和生物技術領域并且涉及能夠阻止血管(血管發生)和淋巴管(淋巴管生成)形成的一種新的ephrin B2特異性抗體。此外，本發明涉及提到的抗體的應用，例如，用于制備藥物。
背景技術：
血管發生，或由已經存在的血管形成新血管在胚胎發育和出生后的生命期間在許多生理過程中(繁殖，結瘢和發炎)起到重要作用。盡管將內皮細胞轉變成血管原性表型的分子機制還不完全知道，但是它是一種復雜過程，涉及內皮細胞的增殖、遷移和裝配，隨后募集其他血管周細胞(例如周細胞或肌肉細胞)以及細胞外基質的重塑(Risau，W.Naturel997, 386:671-674)。在很多病癥中血管不受控制的增長是一種潛在的紊亂，例如類風濕性關節炎或糖尿病性視網膜病變，并且特別是腫瘤過程。腫瘤生長依賴于通過形成新血管網來連續供應氧氣和營養物，從而在缺乏足夠的血管形成時，細胞經歷壞死和/或凋亡過程，這抑制或減緩腫瘤體積的增加。除了血管以外，脊椎動物的循環系統包含淋巴管，它們在生物體發育和病理期間也起到關鍵作用。淋巴系統引流組織的間隙液并將其運輸到血液系統中，還從消化系統中吸收脂類，淋巴系統是免疫系統的單獨的免疫防御運輸細胞的一部分，例如在炎癥中，以及在各種病理狀態誘導多種類型的淋巴水腫，炎性疾病，并且涉及癌癥的侵入和轉移(Tammela, T.and Alitalo, K.Ce 112010，140:460-76)。由以前存在的淋巴管的淋巴管生成或形成淋巴管的研究依然落后了幾十年，并且直到最近幾年才描述了生物分子機制和特異性標記，最近使用它們來研究腫瘤傳播和轉移過程。在胚胎發育期間，血管源于由中胚層衍生的內皮前體(在稱為血管發生的過程中)，然而淋巴管的形成似乎起始于來自頸部區域和中腎周圍的一組靜脈內皮細胞。因為它們的共同胚胎來 源，兩種維管系統具有調節其發育和成熟的相似的分子機制。已經鑒定了數種信號通路，其中酪氨酸激酶受體在形成心血管系統的這些機制中起到非常重要的作用，尤其是，通過其相應的受體(VEGFR)與通過血管生成素調節的Tie-1和Tie-2受體的活性結合的血管內皮生長因子(VEGF)信號通路(Thurston, G.，Cell TissueRes2003; 314:61-68)。此外，已經顯不出另一組分子，ephrins (是 “producing hepatomaerythropoietin receptor interactors”(“產生肝細胞瘤的促紅細胞生成素受體相互作用因子”)的首字母簡稱)連同它們相應的受體(Eph)—起，還涉及血管系統(Adams，RHand Klein, R.Trends Cardiovasc Med2000, 10:183-188)和淋巴系統(MSkinen，T etal.Genes Dev2005, 19:397-410)的重塑。該家族包含已知最大組的酪氨酸激酶(含有14個受體及8個配體)，并且根據它們的序列同源性以及與相應配體的結合特性再細分成兩種受體類型(Eph A和Eph B)。Eph A受體結合亞組ephrin A的配體(其特征在于通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)分子將其錨定在膜上)，而Eph B受體結合亞組印hrin B的配體(其通過跨膜區域緊接著胞質區域將其錨定在膜上)。已有報道動脈表達跨膜配體ephrin B2而靜脈表達 Eph B4 受體(Adams, RH and Alitalo K.Nat Rev Mol.Cell Biol2007, 8:464-478)。該組分子通過改變細胞骨架的組織及影響整聯蛋白和其他胞內粘附分子的活性來負責調控各種細胞功能，例如形態、遷移、排斥、細胞粘附和侵入。(PaSquale，EB.Cell2008, 133:38-52)。這些活性依賴于細胞內表達的Eph受體與在其他細胞內表達的相應ephrin的相互作用，從而產生影響所涉及的每個細胞的雙向信號。來自Eph受體的信號稱為“正向”(“forward”)并依賴于位于其胞質區內的酪氨酸激酶結構域(它能夠磷酸化自身并且能夠磷酸化其他蛋白)，并且依賴于受體與其他效應分子的結合。對于配體ephrinB的部分，它產生另一個信號(稱為“反向”(“reverse”))，一方面其依賴于磷酸化其胞質區中的數個酪氨酸(通過Src家族激酶和其他酪氨酸激酶受體來進行)，并且另一方面依賴于其他相關蛋白。此外，大多Eph受體和ephrins B在它們的胞質區中具有與PDZ結構域的結合位點，其對于進行生理功能是很重要的，尤其是ephrins BCMakineil , T et al.GenesDev2005;19:397-410)。在轉基因小鼠中對編碼Eph B4和ephrin B2的基因失活的研究顯示兩種蛋白在管道系統的發育中起重要作用。這些基因的缺陷小鼠具有改變的血管生成，在胚胎期這是致死的(Wang, HU et al.Cel11998，93:741-753; Adams, RH et al.GenesDevl999, 13:295-306)，然而表達在信號活性位點中具有突變的^)hrin B2的小鼠的研究，顯示該蛋白通過調節VEGF信號通路來控制淋巴管和血管的生長(Wang, Y et al.Nature2010, 465:483-6;Sawamiphak S et al.Nature2010, 465:487-91)。在TO2007/127506和TO2010/019565 中描述了 ^hrin B2 抗體。在TO2007/127506中顯示了描述的抗體阻斷ephrin B2和Eph B4之間的信號傳導并且在血管生成中具有抑制作用，能夠減小動物模型中腫瘤體積。然而，始終存在對于能夠控制血管生成的新型治療劑的需要。
發明內容
本發明提供能夠控制血管生成的新型治療劑并且涉及抗ephrin B2的新型抗體，具有與迄今為止所描述的抗體不同的序列并且具有高特異性，能夠抑制新血管和淋巴管的形成以及顯著地阻止腫瘤的生長。W02007/127506中描述的印hrin B2抗體能夠抑制血管生成但是它沒有描述對淋巴管生成的抑制作用。本發明基于識別并且特異性地結合印hrin B2的抗體并且涉及基于它們的所述抗體、方法和組合物，它們組成了針對與ephrin B2相關的那些病癥的重要的診斷和治療工具。在第一個方面中，本發明涉及抗ephrin B2的新型抗體，該抗體具有抗血管生成和抗淋巴管生成的活性并且能夠抑制實體腫瘤的生長。本發明提供控制疾病(包括血管生成失調，例如，癌癥)問題的新解決方案。如本發明人所證明的，本文中描述的Bll抗體特異性地識別ephrin B2從而抑制它結合至Eph B4受體，在體外測定中，其抑制小管形成和內皮細胞(HUVEC)的遷移能力并且，在體內測定中，使用胰臟癌細胞、肺癌細胞和結腸癌細胞，引起了腫瘤中血管和淋巴管數量的顯著減少 。此外，本發明人發現本發明的抗體能夠顯著地延遲腫瘤生長并且誘導其尺寸減小。本發明人已經顯示在體外和培養的細胞中Bll抗體阻斷ephrin B2與Eph B4的相互作用，還顯示了抗體如何通過其受體能夠抑制ephrin信號傳導(參見本文中圖5)。在體內測定中2B1抗體還能夠抑制小管形成和內皮細胞(HUVEC)的遷移能力并且減少腫瘤中血管和淋巴管的數量。如本文中圖5所示，在Biacore 測定中2B1抗體并不與Eph B4受體競爭并且在Eph B4阻斷的細胞測定中也并不競爭。因此，本發明的第一個方面涉及分離的多肽，即:a.包含與SEQ ID NO:1具有至少76%序列一致性的氨基酸序列，以及b.特異性地識別并結合至ephrin B2。優選地，該多肽包含與SEQ ID NO:1具有至少80%，85%，90%, 95%，99% 一致性的氨基酸序列。更優選地，該多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:1。如本說明書中使 用的，術語“分離的”是指一種多肽，該多肽是指已經從自然環境中鑒定和分離和/或提取的多肽。術語相對于多肽的“ ％序列一致性”是指所討論的氨基酸序列與比較的氨基酸序列相一致的百分比，如果需要，在比對序列并且導入間隔后，用來獲得序列一致性的最大百分t匕，而不必考慮保守性替換。比對能夠以本領域技術人員已知的不同方法進行，例如使用公共工具例如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign (DNASTAR)。本領域技術人員可以確定用于測量比對的合適參數，包括用于獲得所比較的序列的最大比對的任何需要的算法。如本說明書中使用的術語“印hrin B2”，除非另外地明確地或在上下文中指出，是指ephrin B2蛋白的任何天然多肽或任何變體。該蛋白的名字是“erythropoietinproducing hepatoma receptor interactors (產生肝細胞瘤的紅細胞生成素受體相互作用因子)”的首字母縮寫，但還可以稱為ephrin。天然出現的多肽可以是天然截短形式或分泌形式，例如胞外域，或任何天然出現的變體例如各種可替換的“剪接”形式或任何等位變體。優選地，該多肽是抗體。更優選地，該抗體是人類的。優選地，該人類抗體同種型是 IgGl, IgG2，IgG3，IgG4，或 IgA。術語“抗體”或“免疫球蛋白”以其最廣泛的含義使用并且包括單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性(只要它們顯示出希望的生物學活性)并且可以包括抗體片段。抗體可以是人類的、人源化的和/或親和性成熟的。“人類抗體”是指其氨基酸序列相應于人類生產的抗體序列的抗體。本發明的抗體可以是單鏈可變片段(scFv,英語是“single chain variableFragment”)。術語“可變”是指以下事實，即抗體可變區的某些部分在其序列上是相當不同的，并且是負責每種抗體特異性結合其抗原的序列。然而，該可變性并不沿著抗體的整個可變區域均勻地分布。這種可變性集中在稱為⑶R (互補決定區，英語是“complementarity-determining regions”)的三個片段或高變區(存在于輕鏈和重鏈的可變區中)中。可變區的最保守部分稱為框架(framework)。來自兩個鏈(重鏈和輕鏈)的CDR促成了抗原結合位點的形成。可變片段或“Fv”是包含完全的抗原識別和結合位點的最小的抗體片段。單鏈可變片段可以具有通過肽共價連接的重鏈可變區和輕鏈可變區，上述肽允許重鏈和輕鏈結合以形成抗原結合位點的結構。Fv還可以由兩個鏈形成。在任何情況下，即使僅具有三個CDR的單個可變區也足以識別和特異性結合抗原，雖然具有較低的親和性。
抗體或脊椎動物免疫球蛋白的輕鏈根據它們恒定區的氨基酸序列可以具有兩種類型，稱為K和λ。根據重鏈恒定區的氨基酸序列，免疫球蛋白被分成不同的組或類型。存在五種主要的類型或組:IgA，IgD, IgE, IgG和IgM。此外，它們中的一些被分成多個亞組或亞類型，例如IgGl, IgG2，IgG3，IgG4，IgAl和IgGA2。另外，不同組和免疫球蛋白的重鏈的恒定區分別稱為 α (alpha), δ (delta), ε (epsilon), y (gamma)和 μ (mu)。抗體片段可以是保持了整個抗體功能的抗體的任何部分。抗體片段的例子是Fv，Fab (抗原結合片段)，Fab2 (具有兩個抗原結合位點的片段)(都是本領域技術人員已知的)。單鏈可變片段(scFv)包括Vh區(重鏈的可變區)和\ (輕鏈的可變區)抗體，這些區域都在單個多肽鏈中。本發明抗體的其他形式可以是包含scFv和CH3型恒定區的稱為微型抗體或“微抗體”的那些，或包含scFv以及CH2和CH3恒定區的所謂的scFv-Fc。這些形式提高了 scFv分子量，避免了被腎臟快速清除并且在成像技術中可以特別地用于scFv的應用。術語“抗原”是指抗體能夠選擇性地結合到其上的預定的抗原。抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂質、半抗原或其他天然的或合成的分子。優選地，抗原是多肽。本發明的發明人還研究了抗體2B1和Bll與ephrinB2的親和力，發現Bll具有較高的抗原親和力，親和常數(Kd)為110恤，而281具有較低的親和力，其1(1)為6301^。在抗體和其抗原的識別位點和結合位點之間結合的親和力涉及兩者之間非共價相互作用的總和的強度總和。分子與其他分子的親和力通常由親和常數表示，也稱為解離常數(KD)。可以通過通常已知的方法來測定親和力，例如，但是并不限于本文描述的方法。當抗體針對其抗原具有較低親和力時，抗體通常緩慢地結合到抗原上并且很容易解離。為了提高抗體針對其抗原的親和力，可以使用文獻中已經很好描述的技術用于“使親和力成熟”(Marks et al.BioTechnologyl992.10:779:783; Barbas, CF et al.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.199426;91:3809-13)。除了別的以外，這些技術可以是Vh區和'區的“重排”(“shuffling”)，或隨機誘變。本發明的一個優選實施方式中，多肽還包括信號肽。優選地，該信號肽是SEQ ID N0:6,稱作pelB的胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)的細菌果膠酸裂解酶的信號肽。該信號肽允許scFv位于胞質中，在胞質中由于氧化環境scFv正確地折疊。信號肽是3至60個氨基酸的短序列，其引導將多肽或蛋白運輸至特定的亞細胞位置，例如內質網、線粒體或細胞核。在細胞(如大腸桿菌(Escherichia coli))的情況下,信號肽還可以引導蛋白運輸到細胞外，這與將其分泌或將其細胞運輸至胞質中是等價的。信號肽引導多肽分泌的一些例子是pelB, stli, ecotina, IamB,皰疫⑶，Ipp,堿性磷酸酶,轉化酶，α因子和蛋白A的前導序列。在本發明的一個優選實施方式中，多肽還包括至少一個標記(marker)。優選地,該標記選自以下列表，包括:c-myc，FLAG,，HA,組氨酸鏈，GST,生物素，VSV-G, HSVtk, V5，生物素、親和素，鏈霉親和素，麥芽糖結合蛋白和熒光蛋白。更優選地，標記是組氨酸鏈，c-myc或兩者。優選地，組氨酸鏈包含4至12個組氨酸。更優選地，組氨酸鏈包含6個組氨酸。在本發明的一個優選實施方式中，該多肽包含標記c-myc和組氨酸鏈。在本發明的一個優選實施方式中，該多肽氨基酸序列是SEQ ID N0:7。如在本說 明書中使用的術語“標記”是指標記肽或標記蛋白，當它們與感興趣的蛋白一起產生為融合蛋白時，它們可以鑒別該蛋白。使用標記多肽或標記蛋白來鑒定和/或定位感興趣的蛋白，因為這類標記相應于特異性分子或原子的結合位點(例如組氨酸鏈、GST、親和素或鏈霉親和素)，或者因為這些標記可以很容易通過免疫化學技術檢測(例如血球凝集素、VSV-G, HSVtk、FLAG、V5或myc)，或因為它們很容易觀察到(例如熒光蛋白)。標記肽VSV-G屬于水泡性口膜炎病毒糖蛋白。HSVtk標記肽屬于單純皰疹病毒I的胸苷激酶。FLAG肽是針對重組蛋白專門設計為標記的8氨基酸表位(印itope)。V5是存在于副粘病毒猿猴病毒5 (SV5)的P和V蛋白中小表位(epitope)。myc表位具有10個氨基酸并且是人類c-myc轉錄因子序列的一部分。本發明的另一個實施方式是其氨基酸序列包含本發明第一方面多肽的抗體。本發明的第二個方面涉及編碼本發明第一個方面的多肽的核酸。優選地，核酸是載體。更優選地，該載體是表達載體。核酸或多核苷酸是任何長度的核苷酸的聚合物，包括DNA和RNA。所述核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾的核苷酸或可以通過DNA或RNA聚合酶或通過合成反應結合到多聚體中的任何物質。術語“編碼”是指決定如何將核苷酸序列翻譯成多肽或蛋白的遺傳密碼。在序列中的核苷酸順序決定了沿著多肽或蛋白的氨基酸的順序。載體是用于將基因物質轉移至細胞中的核酸分子。除了提及的遺傳物質，載體還可以包含不同的功能元件包括控制轉錄的元件，例如啟動子或操縱子，增強子或用于結合轉錄因子的區域，以及開始和結束翻譯的控制元件。所述載體包括但并不限于:質粒、粘粒、病毒、噬菌體、重組表達盒和轉座子。一旦將其導入宿主細胞中，某些載體就能夠自主地復制或分裂，例如具有細菌復制起始位點的細菌載體或游離型哺乳動物載體。其他載體可以整合入宿主細胞基因組中并且與細胞基因組一起復制。表達載體是能夠指導所述表達載體可操作地連接到其上的基因表達的載體。表達載體用于轉錄和翻譯感興趣的基因(通常由啟動子控制)。啟動子是控制感興趣的基因轉錄的核苷酸序列。啟動子可操作地連接到感興趣的基因上。“可操作地連接”是指功能性關系，以及啟動子序列關于感興趣基因的定位，例如，啟動子或增強子可操`作地連接至編碼序列(如果它影響了序列的轉錄)。通常，可操作地連接的啟動子與感興趣的序列相鄰。然而，增強子不需要與感興趣序列相鄰以控制其表達。如本說明書中使用的，術語“復制起點”是指其中形成復制叉以及其中開始DNA復制的核苷酸序列。本發明的第三個方面涉及包含本發明第二個方面的載體的細胞。該細胞可以是原核的，例如，但并非限制性地，該細胞可以是細菌例如用于生產本發明抗體的大腸桿菌。該細胞可以是真核的，例如，但并非限制性地，用于生產本發明抗體的酵母或昆蟲細胞。真核細胞可以用于細胞治療，或可以是通過基因治療結合本發明第二個方面的載體的細胞。在本發明的一個優選實施方式中，該細胞是哺乳動物細胞。哺乳動物細胞是其種類屬于動物界、脊索動物門、脊椎動物亞門和哺乳動物綱的任何細胞。本發明的第四個方面涉及獲得本發明第一個方面的多肽的方法，包括以下步驟:(a)在細胞中表達本發明第二個方面的載體以及(b)純化步驟(a)中表達的多肽。在本發明第四個方面的一個優選實施方式中，該細胞是原核的。在本發明第四個方面的另一個優選實施方式中，該細胞是真核的。
本發明的第五個方面涉及用于檢測和/或定量ephrin B2的方法，包括以下步驟:(a)將分離的生物樣品與本發明第一個方面的多肽接觸，以及(b)檢測和/或定量由ephrin B2與在步驟(a)使用的樣品中的所述多肽形成的復合物。本發明的第五個方面的優選實施方式是診斷與ephrin B2的表達相關疾病的方法，包括以下步驟:(a)將分離的生物樣品與本發明第一個方面的多肽接觸，(b)檢測和/或定量由ephrin B2與在 步驟(a)使用的樣品中所述多肽形成的復合物，(c)將檢測到的ephrin B2水平與對照水平比較，以及(d)將所述比較結果與疾病的存在或不存在相關聯。與^hrin B2的表達相關的疾病可以是，除了其他的以外，具有血管生成反常的任何疾病，例如腫瘤和非腫瘤疾病。顯示血管生成失調的非腫瘤疾病包括但不限于:異常性營養過剩、關節炎、類風濕性關節炎、銀屑病、肉狀瘤病、動脈粥樣硬化、糖尿病性視網膜病變、增殖性視網膜病變、新生血管性青光眼、老年性黃斑退化癥、糖尿病黃斑水腫、角膜新生血管化、腦膜瘤、血管瘤、血管纖維瘤、甲狀腺過度增生、慢性炎癥、肺部炎癥、敗血癥、腦水腫、滑液發炎、骨形成營養過剩、骨關節炎、多囊卵巢綜合征、子宮內膜異位癥、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、出血性關節、肥厚性瘢痕、硬皮病、沙眼、滑膜炎、皮炎、先兆子癇(W02007/127506)。分離的生物樣品是由身體(例如人體或動物體)分離的樣品并且可以來自生物體的生理液體和/或任何細胞或組織。生物樣品可以是組織，例如，但不限于，生檢(活檢，biopsy)或細針抽吸活檢。在一個優選實施方式中，在步驟(a)中分離的生物樣品是生物液體。生物液體可以包括由生物體排出或分泌的液體，以及并非正常的液體。生物液體可以包含，但不限于，胎兒周圍的羊膜液、眼房水、間隙液、淋巴液、母乳、粘液(包括鼻涕和痰液)、唾液、脂肪(皮膚油)、乳清、汗液、淚液、尿液、心包液、血液和血漿。在一個更優選的實施方式中，生物液體是血液、血漿或血清。在本發明方法的步驟(a)中分離的生物樣品可以是，例如，但不限于，新鮮的、冷凍的、固定的或包埋在石蠟中。如在本說明書中使用的，術語“檢測和/或定量”由ephrin B2和在分離生物樣品中的本發明第一個方面的多肽形成的復合物，是指檢測存在和/或測量數量或濃度，優選以半定量或定量方式。該測量可以直接地或間接地進行。直接測量是指測量由ephrin B2和本發明第一個方面的多肽形成的復合物的量或濃度(基于從所述復合物直接獲得的信號并且將其與樣品中存在的復合物分子的數量直接相關聯)。這種信號(其還可以稱為強度信號)例如，可以通過測量復合物的物理或化學特性的強度值來獲得。間接測量包括從次級組分(例如，復合物的不同組分)或生物測量系統(例如，測量細胞反應、配體、“標簽”或酶反應產物)中獲得的測量值。術語“量”是指，但不限于，由ephrin B2和本發明第一個方面的多肽形成的復合物的絕對量或相對量以及與復合物相關的任何其他值或參數，或可由其得到的值或參數。這類值或參數包括通過直接測量獲得的由復合物的任何物理或化學特性獲得的信號的強度值，例如，來自質譜或核磁共振的強度值。另外地，這些值或參數包括通過間接測量獲得的那些值或參數。如本領域技術人員應當理解的，該檢測并不旨在分析樣品是100%正確。然而，需要將統計顯著數量的分析樣品正確地分類。統計顯著的數量可以由本領域技術人員使用不同的統計工具來建立，例如，但不限于，置信區間的確定、P值確定、Student’s t檢驗或Fisher判別函數。優選地，置信區間為至少90%，至少95%，至少97%，至少98%或至少99%。優選地，P值少于0.1,0.05,0.01,0.005或0.0001。優選地，本發明可以至少60%、至少70%、至少80%或至少90%正確地檢測所分析的給定組或人群的受試者的疾病。如在本說明書中使用的，術語“比較”是指，但不限于，將通過ephrin B2與有待分析的生物樣品(也稱為生物樣品問題)的本發明第一個方面的多肽形成的復合物的量與參比試樣(稱為對照)的復合物的量比較。例如，參比樣品與生物樣品問題可以同時地或連續地進行分析。可以手工地或計算機輔助地進行比較。本發明第六個方面涉及本發明第一個方面的多肽用于制備藥劑的用途。在本發明的一個優選實施方式中，使用該藥劑來抑制血管生成。優選地，用于治療性或預防性治療與血管生成相關的病癥。更優選地，用于預防性或治療性治療腫瘤或癌癥。與血管生成有關的病癥可以是任何腫瘤以及其他非腫瘤疾病，例如，但不限于，在W02007/127506中描述的那些。在本發明第六個方面的優選實施方式中，腫瘤或癌癥是實體的。優選地，是胰臟癌、結腸癌或肺癌。當是不包含空腔或液體的大量組織時，腫瘤或癌癥被說成是實體的。根據細胞類型，實體腫瘤具有不同的名稱，例如肉瘤、惡性腫瘤(carcinoma)或淋巴瘤。本發明第七個方面涉及包含本發明第一個方面的多肽、本發明第二個方面的核酸或載體、或本發明第三個方面的細胞的組合物。在本發明第七個方面的優選實施方式中，該組合物是藥物組合物。優選地，其特征還在于包含藥用賦形劑。此外，該賦形劑必須是藥理學可接受的。“賦形劑”是藥物組合物的成分，其不是活性化合物而是稀釋劑、載體或填充物，等等，當它是安全的、無毒的并且無不良反應時，其被認為是“藥用的”。術語“賦形劑”是指一種物質，其有助于化合物的吸收、穩定該化合物或在給予一致性或提供氣味(這使其更加令人愉快)方面有助于制備藥物。因此，賦形劑可以具有使多種組分(例如淀粉、糖類或纖維素)保持在一起的功能，增甜功能，染色功能，藥物保護功能例如隔離空氣和/或水分，片劑、膠囊或其他形式制劑例如磷酸氫鈣的填充功能，有助于組分溶解及其在腸道內吸收的崩解功能，而并不排除本文中未列出的其他類型載體。賦形劑術語“藥用的”是指該載體是可接受的和可評價的從而并不對所述載體施用到其上的有機體造成損害。此外，該載體必須是藥學上適合的，它必須允許藥物組合物的化合物的活性，即必須和那些組分相兼容。優選地“運載體”或載體是惰性物質。該載體的功能是有助于其他化合物的結合、允許更好地給藥和給予或為藥物組合物提供一致性和形狀。因此，載體是用于藥物中從而將本發明藥物組合物的任何組分稀釋成給定體積或重量的物質，或甚至使用非稀釋組分可以允許更好地給藥和給予或為藥物提供一致性和形狀。當該制備是液體時，該藥用載體是稀釋劑。在另一個甚至更優選的實施方式中，藥物組合物還包括其他活性物質。除了治療效果的要求以外(它可能需要使用其他治療劑，)可能存在強迫或強烈地推薦使用本發明的化合物和其他治療劑的組合的另外的基本原理 。術語“活性”是指具有作為藥物的適當活性的任何物質，而不考慮人類的、動物的、植物的、化學的或其他來源。
在本發明第七個方面的優選實施方式中，該藥物組合物還包括抗血管生成劑。抗血管生成劑是能夠直接地或間接地抑制血管生成、血管發生或不希望的血管通透性的分子。抗血管生成劑的例子是能夠阻斷一種血管生成劑的那些分子，像例如抗VEGF的抗體、VEGF受體或阻斷VEGF通路的小分子(所有分子都被很好地描述并且是已知的)。在本發明第七個方面的優選實施方式中，該藥物組合物還包括化療劑。化療劑是在治療癌癥中有用的化合物。化療藥物的例子是細胞毒性化合物例如蒽環類藥物(antraciclines)、柔紅霉素、亞德里亞霉素、多西紫杉醇衍生物、長春花生物堿類、長春新堿、卡莫司汀、順鉬、氟尿嘧啶、細胞生長抑制劑化合物例如多胺抑制劑、他莫昔芬或甲羥孕酮奧曲肽、或誘導凋亡的化合物例如丁酸鈉或絲裂霉素C、抗生素(例如青霉素、β內酰胺類、頭孢菌素、細胞周期蛋白類、氨基糖苷類、大環內酯類、或磺胺類)、或抗病毒劑例如ΑΖΤ、蛋白酶抑制劑或阿昔洛韋、疊氮胸苷或膦甲酸。本發明第八個方面涉及本發明第七個方面的組合物用于制備藥劑的用途。在本發明這個方面的優選實施方式中，使用藥劑來抑制血管生成。優選地，用于治療性或預防性治療與血管生成有關的病癥。更優選地，用于預防性或治療性治療腫瘤或癌癥。在一個優選實施方式中，該腫瘤或癌癥是實體的。優選地，該癌癥是胰臟癌、結腸癌或肺癌。在本發明的第八個方面的優選實施方式中，給予治療有效量。術語“治療有效量”是指以一定劑量以及在需要的時期給藥的量，其有效地實現了所期望的預防性或治療性結果。“治療有效量”的本發明的多肽或藥物組合物可以隨著個體的疾病階段、年齡、性別及重量而改變，并且是指沒有毒性或副作用并且能夠實現所期望的預防性或治療性效果的量。“個體”是脊椎動物。優選地，該脊椎動物是哺乳動物。更優選地，該哺乳動物是人類。哺乳動物中包括，但不限于，農場動物(例如母牛)、參與體育運動的動物、寵物(例如貓、狗和馬)、靈長類、小鼠和大鼠。在每種情況下，藥物的形式適合于所使用的給藥類型，因此，本發明的組合物能夠以溶液形式或臨床允許給藥的任何其他形式并且以治療有效量來提供。本發明的藥物組合物能夠以固體、半固體 、液體或氣體形式配制，例如片劑、膠囊、粉劑、顆粒、藥膏、溶液、栓齊U、注射劑、吸入劑、凝膠、微球體或氣溶膠。根據本發明的另外的優選實施方式，藥物組合物處于適合口服或腸胃外給藥的形式。適合口服給藥的形式是指能夠允許口服給藥的物理狀態。適合口服給藥的這種形式選自下面列表，包括但不限于滴劑、糖漿劑、茶劑、酏劑、懸浮劑、臨時懸浮劑、可飲用小瓶、片劑、膠囊劑、顆粒劑、扁囊劑、丸劑、片劑、錠劑、含片或凍干劑。適合腸胃外給藥的形式是指能夠允許注射給藥的物理狀態，優選液體狀態。腸胃外給藥可以通過肌肉內、動脈內、靜脈內、真皮內、皮下或骨內進行，但是并不單獨地限于這些類型的腸胃外給藥途徑。另一種可能性是藥物組合物以適合舌下、鼻內、鞘內、支氣管、淋巴管、直腸、經皮(transdermal)或吸入給藥的形式存在。貫穿整個說明書和權力要求，詞語“包括”及其變體并不旨在排除其他技術特征、添加物、組分或步驟。對于本領域技術人員，部分地由說明書以及部分地由本發明的實踐可以清楚本發明的其他目標、優點和特征。下面的實施例以說明的方式提供并且并不旨在限制本發明。
圖1.在大腸桿菌(E.coli)中選擇克隆的表達。通過丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和考馬斯亮藍染色分析在大腸桿菌中(全部提取物)針對ephrin B2選擇的scFv表達(2B1克隆，A1，B11和E4)以及通過溫和的滲透休克(胞質)分離的相應的胞質部分。分子量以kDa顯示在圖的左側。圖2.大量純化克隆2B1和B11。通過丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和考馬斯亮藍染色分析印hrin B2的scFv A1、B11、E4和2B1特異性物質的純化。在固定的Ni2+上通過親和色譜純化相應的胞質提取物中存在的scFv。該圖示出每種scFv的洗脫層析圖的不同部分。分子量以kDa顯不。圖3.克隆Bll和2B1是更特異性的物質。通過免疫印跡測定針對不同ephrin B選擇的scFv抗-ephrin B2的特異性。商業重組蛋白ephrin Bl-Fc (EBl)(小鼠)、小鼠的ephrin B2_Fc (EB2)和ephrin B3_Fc (EB3)(人類)被電泳分離并且轉移至硝酸纖維素膜。隨后，分析Bll和2B1克隆連同商業抗體抗-印hrin B2 (作為對照(C))一起的反應性。分子量以kDa顯示在圖的左側。圖4.通過Biacore 分析scFv抗-ephrin B2的親和性。感應圖表示針對對應于克隆Bll (A)與使用四種不同濃度(0.4，0.2，0.1，0.05 μ M)固定的印hrin B2的結合曲線以及在30，20，10和7.5口11濃度下的克隆281 (B)的結合曲線的時間(s)的反應，由此計算出相應的親和常數(KD)，對于克隆BI I，Kd值是IlOnM而對于克隆2B1，Kd值是630nM。圖5.阻斷ephrin B2與Eph B4結合的研究。A.該圖示出ephrin B2與Eph B4的結合百分比。在scFv抗-ephrin B2存在下通過表面等離子體共振進行ephrin B2與EphB4的結合抑制試驗。scFv Bll (.)或2B1 (〇)的連續稀釋物與^)hrin B2混合并且注射在固定在芯片上的Eph B4上。在注射每種樣品后立即測量結合至Eph B4的印hrin B2的相對量并且作為scFv濃度的函數制圖。該圖顯示scFv的每個濃度的平均值，其中誤差棒指示標準誤差(n=3)。·B.在細胞測定中scFv Bll能夠阻斷ephrin B2與Eph B4受體之間的相互作用。分析了響應于使用在HEK293細胞表面上過表達的ephrin B2進行刺激，在HUVEC細胞中Eph B4受體的酪氨酸磷酸化。將過表達ephrin B2的HUVEC和HEK293細胞在抗-印hrin B2scFv存在或不存在下共培養20分鐘。在Eph B4受體免疫沉淀后，通過免疫印跡分析蛋白的總量(下圖)及其磷酸化水平(上圖)。圖6.通過基質膠中內皮細胞HUVEC在體外在管狀結構形成上Bll和2B1的抑制作用。顯微照片(4x放大倍數)代表在B11、2B1或無關的scFv (作為負對照(C-))存在下在基質膠上培養HUVEC細胞6小時形成小管。關于正對照，我們使用VEGF。該圖示出小管形成的定量。每種處理重復至少三次并且將對應的值(均值+/_標準誤差)繪圖為相對于無任何處理的對照，在檢測的抗體存在下形成的小管的百分比。*=p〈0.0001。圖7.通過體外傷口愈合測定分析細胞側向遷移抑制。HUVEC細胞生長至匯合并且在細胞單層中形成創傷。然后，在不存在(對照)或存在VEGF (作為遷移刺激物)下在無血清培養基中孵育細胞。在scFv抗-印hrin B2、Bll或2B1或無關的scFv (作為陰性對照)存在下監控細胞的側向遷移持續24小時。該圖示出在其上用虛線標記的創傷區域(在時間為O時無細胞的起始區域)之后24小時代表性的顯微照片(4x放大倍數)。該圖定量了 24小時處細胞遷移。每種scFv測試至少三次，并且將相應的值(均值+/-標準誤差)針對相對于時間O的遷移面積的百分比繪圖。*=p〈0.001。圖8.分析體內管狀結構形成的抑制作用。在無胸腺nu/nu小鼠中進行基質膠植入并且通過定量內皮細胞和血紅蛋白在植入6天后評價管道形成。A.6天后移除的并且用內皮細胞標記物CD34染色的對應植入物的組織切片的代表性顯微照片(40x放大倍數)。B.該圖示出標記物⑶34的陽性區域的百分比(左圖)以及相對于不含VEGF的對照植入物，在植入物中血紅蛋白含量的相對改變(右圖)。圖9.具有胰腺癌細胞(BxPC3)以及用Bll或2B1治療的小鼠異種移植物中抑制腫瘤生長。該圖示出在用20mg/kg的Bll ( ▲ )、2B1 ( ■)處理或未處理(C-) ( )的每個組(n=8)的每個點的平均腫瘤體積和標準差。圖10.胰腺癌細胞(BxPC3)以及用Bll或2B1治療的異種移植腫瘤的組織病理學分析。在植入后38天以及最后劑量的抗體后I天進行分析。在福爾馬林中固定腫瘤并將其包埋在石蠟中用于隨后進行相應的免疫組織化學染色。通過活性半胱天冬酶3(caSpaSe3)染色來檢測凋亡細胞，通過Ki67染色來分析增殖活性，通過⑶34染色來標記血管分布以及通過LYVEl染色來檢測淋巴管。隨后計數細胞或將陽性區域和平均值針對連同它們相應的標準差一起計數的所有域作圖。*=Ρ〈0.0001**=〈0.001。圖11.Bll能夠抑制異種移植有結腸癌細胞(SW620) (A)和肺癌細胞(Η460) (B)的小鼠體內的腫瘤生長。該圖顯示平均腫瘤體積(上圖)和平均熒光強度(下圖)，具有在用20mg/kg的Bll治療組和對照治療組中的每個點處的標準誤差。圖12.Bll及2B1的生物分布分析和腫瘤塊定位。無胸腺nu/nu小鼠異種移植有穩定表達突光蛋白mCherry的肺癌的H460細胞。當腫瘤達到肉眼可觀察的尺寸并且在610nm處具有熒光強度時，靜脈內給予 適當的熒光染料連接的scFv AiexaFliior 750。A.在給予scFv后0.5，2，6，24和48小時的背部區域圖像。腫瘤的位置由箭頭指示。B.在給予標記有AIexaFluor 750的scFv Bll和2B1以及用PBS處理的負對照(C-)之后6小時和48小時切除在750nm處具有熒光強度的腫瘤。
具體實施例方式下面將通過發明人所做的實驗來說明本發明，其證明了本發明的抗ephrin B2抗體特異性及其抑制新血管和淋巴管形成的功效。實施例1:鑒定和表征抗ephrin B2的新型人類抗體。從在噬菌體M13的表面上表達的人類抗體庫并通過針對在哺乳動物細胞中表達并通過親和色譜純化的ephrin B2的胞外區域的連續多輪的選擇,通過ELISA獲得與ephrin B2抗原陽性反應的噬菌體克隆集合。用特異性引物測序這些克隆并鑒定Vh (可變重鏈)和' (可變輕鏈)中互相不同序列的4個單鏈可變片段(scFv)，稱為Al，Bll, E4和2B1。隨后，對每種選擇的scFv的表達和純化進行分析。為此，將它們亞克隆至T7RNA聚合酶啟動子下的載體pET28b中，從而提供具有組氨酸尾部的片段，以便于通過親和色譜將其純化。產生重組載體并且將其轉化入E.coli BL21 (DE3)的菌株中以便隨后使用IPTG誘導其表達。通過溫和的滲壓休克制備胞質部分并且通過SDS-PAGE測試scFv的存在(圖1)。然后，使用鎳親和色譜，緊接著通過凝膠過濾將緩沖溶液更換成PBS對存在于胞質部分中的scFv進行純化(圖2)。在克隆2B1 (其序列是SEQ ID NO:8)的情況下獲得最大產率，緊接著是克隆Bll (其序列是SEQ ID N0:7)。然而，scFv Al和E4的表達很低，使得所獲得的量不足以獲得這些抗體的進一步表征(圖2)。因此，最終選擇Bll和2B1克隆來分析其反應性。通過ELISA的功能性測定顯示抗體以功能性活性形式表達從而特異性地識別它們的靶抗原，ephrin B2。
通過免疫印跡(蛋白質印跡)和Bll和2B1與ephrins B家族的其他組分的反應性的ELISA分析確認兩個抗體的特異性:ephrin BI和ephrin B3,處于商業重組形式,與同ephrin B2的反應性比較(圖3)。作為對照，我們使用ant1-ephrin B2Commercial (R&D)。兩種抗體，Bll和2B1，僅識別印hrin B2，顯示了其對該蛋白的高特異性，甚至超過還識別ephrins BI和B3的商業抗體。這些結果通過ELISA確認。由曬菌體庫選擇來自特異性ephrin B2抗體的單鏈可變區片段(svFv)使用來自未用1.5X101(ISCFV免疫的個體的人類抗體庫在噬菌體表面上使用蛋白展示技術(噬菌體展示)。使用由哺乳動物細胞表達和純化的融合到人類IgG的Fe結構域上的印hrin B2胞外區域作為在4°C下在PBS (磷酸鹽緩沖液)中以I μ g/孔在ELISA板上(酶聯免疫吸附測定，Enzyme-linked immunosorbent assay, Maxisorp, Nunc)固定 16 小時的抗原進行第一輪篩選。在PBS三次沖洗孔之后，進行使用處于PBS中2%牛奶在37°C下封閉2小時的步驟，隨后在37°C下孵育該文庫兩個小時。非特異性結合的噬菌體通過用PBS-0.1%吐溫連續清洗而去除，而抗原特異性噬菌體用IOOul胰蛋白酶洗脫。使用洗脫的噬菌體在37°C下使用處于指數生長(在600nm波長下的光密度(OD6tltl)是0.4)的大腸桿菌菌株TGl (MRC Geneservices)感染細胞持續30分鐘。將感染的細菌涂布在補充有100ug/ml氨節青霉素和1%葡萄糖(v/v)的TYE平板上(TYE,胰蛋白胨酵母抽提物，Tryptone YeastExtract)，并且在37°C下生長16小時。接著，由具有補充有15%甘油的2xTY培養基(16g/I胰蛋白胨，10g/l酵母抽提物和5g/l NaCl)平板上收集細菌并且將50ul稀釋的細菌收集到50ml補充有100ug/ml氨芐青霉素和1%葡萄糖的2xTY培養基中，孵育培養物直到達到指數期并且用2.5 X IO11個輔助噬菌體ΚΜ13 (MRC Geneservices)感染細胞。在37°C下孵育30分鐘后，離心培養物，將球粒重懸于補充有100ug/ml氨芐青霉素、50μ g/ml卡那霉素和0.1%葡萄糖的相同量的2xTY培養基中，并在30°C下生長過夜。將來自每輪選擇的噬菌體從培養基中沉淀。為此，在3，300x g下離心培養物15分鐘并且添加IOml的聚乙二醇(PEG)/NaCl并且將40ml上清液放置冰上I小時。然后，在3，300x g下離心30分鐘并棄掉上清。將沉淀物重懸在2ml PBS中并在11，600x g下離心10分鐘。回收上清液并將噬菌體用于下一輪選擇，與上述相似，尤其是使用了降低量的抗原以提高抗體的親和性。將第二輪中結合的噬菌體擴增并將其再提交至第三輪選擇從而得到攜帶抗ephrin B2的反應性scFv的那些的富集。用于噬菌體的ELISA進行了用于噬菌體的ELISA用于評估由每輪選擇得到的ephrin B2的特異性噬菌體的富集程度。在4°C下用處于PBS中的0.3ug的印hrin-B2-Fc和不相關的蛋白(作為負對照)來包被柔韌的ELISA平板(Falcon, BD Biosciences)，持續16小時。在使用PBS清洗幾次后，在室溫下使用處于PBS中的2%牛奶封閉平板持續2小時，緊接著在室溫下用處于PBS-2%牛奶中來自每輪選擇的不同稀釋度的噬菌體孵育I小時。用PBS-吐溫20(0.1%)再次清洗這些孔并且在室溫下使用1:5000稀釋度的連接至過氧化物酶(HRP) (GEHealthcare)的單克隆抗-M13抗體孵育I小時。在用PBS-吐溫20 (0.1%)清洗4次后，使用TMB (3，3’，5，5’ -四甲基聯苯胺)(Sigma)顯影。使用IM硫酸終止顯色反應并在450nm下測量吸光度。使用各種技術來表征兩種選擇的scFv, Bll和2B1。首先,使用固定的ephrin B2的胞外區域和純化的scFv的不同稀釋度，通過在Biacore X上的表面等離子體共振技術我們測量了針對ephrin B2的抗體親和常數。Bll克隆顯示了最高的親和常數，為ΙΙΟηΜ，而克隆2B1的親和性較低，為630nM (圖4)。然后，使用相同技術分析了抗體競爭ephrin B2與其天然受體Eph B4結合的能力。為此，將Eph B4-Fc固定在芯片上并且在不同濃度Bll或2B1存在下測量其與印hrin B2的結合。Bll的存在以濃度依賴方式阻止印hrin B2與Eph B4結合，IC5tl為0.3μΜ(圖5)，表明Bll競爭Eph Β4受體相同的結合位點。然而，2Β1抗體沒有阻斷作用(圖5)。單克隆噬菌體的ELISA由第三輪選擇中挑出單個克隆并且在37°C下在攪拌下在96孔板(Sarstedt)中在補充有100 μ g/ml氨芐青霉素和1%葡萄糖的100 μ I的2χΤΥ培養基中生長過夜。第二天該培養物在相同的培養基中稀釋100倍并在37°C下在攪拌下孵育2小時。下一步，添加含有IO9個KM13輔助噬菌體的25ul培養基并在37° C下孵育I小時。將細菌離心并且將細胞球粒重懸在補充 有50 μ g/ml卡那霉素的2xTY中并在30°C下生長過夜。最后，離心培養物并使用50ul的上清液用于在上述相同條件下進行ELISA。序列分析使用寡核苷酸或peIB 正向引物(SEQ ID NO: 2) 5’ -CATAATGAAATACCTATTGCCTA-3’和 cmyc 反向引物(SEQ ID NO: 3) 5’-CTTATTAGCGTTTGCCATT-3’，通過 PCR 來擴增來自 scFv陽性的編碼序列。使用酶ExoI(USB)處理PCR產物以移除未使用的寡核苷酸，以及SAP(USB)以移除剩下的dNTP(在37°C下持續30分鐘而在80°C下持續15分鐘)，并且使用兩種寡核苷酸將這些產物測序。一旦獲得序列，使用ClustalW軟件以及翻譯工具ExPASy ProteomicsServer將這些序列彼此進行對比以便確定單一序列克隆的數量。將scFv 亞克隆至 pET28b為了向選擇的scFv提供有助于其純化的組氨酸尾部，將它們克隆到載體pET28b (Novagen)中。通過PCR使用分別含有兩個限制位點XhoI和RcaI的引物 pET28-scFvMehta5’ (SEQ ID NO:4) 5’CAGTCATCATGAAATACCTATTGCCTAC3’ 和pET28-scFvMehta3，(SEQ ID NO:5) 5’CACCGGACTCGAGTGCGGCCCCATTCAG3’ 來擴增 scFv，用于隨后克隆至pET28b載體中(預先用NcoI消化，位點與RcaI和XhoI相容)。在16°C下使用T4連接酶(Roche)設置插入序列:載體摩爾比3:1通過過夜孵育來連接消化的插入序列和載體。通過熱休克轉化大腸桿菌菌株DH5a文庫感受態細胞(Invitrogen)并且在含有50 μ g/ml卡那霉素的LB-瓊脂(LB，“溶原性肉湯”)平板上篩選。將每個構建的陽性克隆接種在補充有卡那霉素的LB中并且在37°C下培養過夜。使用Wizard kit (Promega)來純化重組載體并且通過DNA測序來驗證其序列。scFv的表達和純化
通過熱休克用PET28重組質粒轉化大腸桿菌菌株BL21 (DE3)感受態細胞。在含有50 μ g/ml卡那霉素的LB平板上篩選轉化的細菌。當培養物的0D_是0.6時使用IPTG(異丙基 -D-1-硫代半乳糖批喃糖苷(isopropyl-β -D-1-thiogalactopyranoside))誘導來引導scFv的表達至最終濃度為ImM。我們通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠(十二烷基硫酸鈉)，緊接著用考馬斯亮藍染色來分析scFv的表達水平。由于功能性的scFv集中在細胞胞質區域，通過溫和的滲透沖擊有效地裂解細菌外壁，將細胞重懸在補充有20 μ g/ml苯甲脒(Sigma)和10 μ g/ml大豆胰蛋白酶抑制劑(Sigma)的1/50體積的TES緩沖液(200mMTris-HCl ρΗ8.0,0.5mM EDTA，0.5M蔗糖)中并且隨后在0.2x TES緩沖液中稀釋1.5倍。將裂解物放置冰上30分鐘，在16，250x g下離心10分鐘并且收集含有胞質部分的上清液。使用Ni2+HisTrap(GE Healthcare)柱通過在固定的金屬(IMAC)上的親和色譜進行
ScFv的純化，隨后在計算機AKTAxpress上串聯偶聯的凝膠過濾HiPrep26/10Desalting(GE Healthcare)柱上脫鹽。關于親和柱的平衡緩沖液，使用20mM pH7.4的磷酸鈉、0.5MNaCl、20mM咪唑，而關于洗脫液，為余量為0.3M濃度咪唑的上述緩沖液。通過凝膠過濾將該緩沖液換成PBS。免疫印跡(蛋白質印跡)在聚丙烯酰胺_SDS10%凝膠中電泳分離重組小鼠蛋白ephrin Bl_Fc、小鼠ephrinB2-Fc以及人類B3-Fc (R&D)并且將它們轉移至硝酸纖維素膜上(GE Healthcare)。在用PBS-3%脫脂奶粉封閉該膜I小時后，在4°C下用處于PBS-3%奶粉中的1:5稀釋的胞質部分孵育16小時。使用的二抗是1:1000稀釋的抗c-Myc(Sigma)在室溫下持續2小時以及1:5000稀釋的抗小鼠過氧化物酶結合物(Sigma)在室溫下持續I小時。通過用ECL試劑(ECL, “增強化學發光”(“Enhanced Chemiluminescence”))(GE Healthcare)孵育來進行可視化。scFv的動力學常數分析為了研究 scFv的親和常數,使用BIAcore X儀器(BIAcore)的表面等離子體共振技術。通過用1:1比率的0.4M EDC (1-乙基-3-(-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺)和0.1MNHS(N-羥基琥珀酰亞胺)在10 μ I/分鐘的流速下將芯片的葡聚糖基質的羧基活化7分鐘，將ephrin B2_Fc共價結合至CM5芯片表面(GE Healthcare)。將ephrin B2_Fc蛋白稀釋至處于IOmM醋酸鈉中(pH4)10ug/ml并且以處于HBS-EP緩沖液(IOmM HEPES pH7.4,150mMNaCl,3mM EDTA，0.005% 表面活性劑 P20) (GE Healthcare)中 10 μ 1/min 的流速將 30ul 該溶液通過芯片表面。通過以10 μ I/分鐘的流速注入IM ρΗ8.5的乙醇胺持續7分鐘來封閉過量活化的酯基。使用該方案，固定了 ephrin B2的大致2，000個反應單元(RU)。為了確定scFv的親和常數，在30ul/分鐘的流速下以遞增次序連續地注入不同稀釋度的抗體。在獲得感應圖(sensorgram)后，通過Langmuirl:1模型使用評估程序BIAsoftware來計算親和常數。結合至Eph B4的競爭性分析通過表面等離子體共振競爭性結合測定來分析scFv抑制ephrin B2結合至其EphB4受體的能力。使用上述相同實驗方案將溶解的Eph B4 (R&D)結合至CM5芯片(GEHealthcare)。將每種scFv的連續稀釋物與處于HBS-EP緩沖液中恒定濃度(0.2 μ Μ)的ephrin B2_Fc混合并且將30ul的每種混合物以20 μ I/分鐘的流速注入Eph Β4的包被芯片上。結合至Eph B4上的ephrin B2的相對量代表了抗體相應濃度的函數。使用scFv Bll 抗-ephrin B2 阻斷 Eph B4 信號為了通過ephrin B2誘導的磷酸化來測試抗-ephrin B2scFv阻斷Eph B4活性的能力，進行了細胞測定，其中使用HEK293細胞短暫過表達ephrin B2來刺激HUVEC細胞(其特征是表達高水平的Eph B4但是低水平的ephrin B2)。結果顯示在圖5B中。在孵育兩種細胞類型20分鐘后，在HEK293細胞表面上表達的印hrin B2誘導了 HUVEC細胞中Eph B4的高效磷酸化。然而，在該過程中scFv Bll的存在導致幾乎完全抑制Eph B4的磷酸化，表明在細胞間直接接觸的背景下使用scFv Bll的處理阻斷了 ephrin B2與其受體Eph B4之間的相互作用。當使用scFv2Bl進行處理時觀察不到這種效果。在scFv2Bl的情況下,EphB4磷酸化水平與在缺乏抗體下觀察到的那些是相似的。
Eph B4磷酸化細胞實驗用質粒pcDNA3-印hrin B2轉染在補充有5%胎牛血清的RPMl (Sigma)中生長的HEK-293細胞。在塑料瓶T-75 (Nunc)中以4.5xl06接種HEK-293細胞。第二天，使用處于 Iml 0Ρ ΜΕΜ 培養基(Invitrogen)中的 20ug pcDNA3_印hrinB2 和 60ul FUGENE 轉染液(Roche)來制備混合物并且在室溫下孵育30分鐘。使用不含血清的0Ρ ΜΕΜ培養基(Invitrogen)洗滌細胞單層數次并添加DNA-FUGENE混合物。在37°C和5%C02下孵育5小時后，移除該培養基并且添加含有5%胎牛血清的RPMl。在48小時，使用PBS-5mM EDTA來培養轉染的細胞并將5xl06個細胞添加至PlOO平板(Falcon)，在存在或不存在20ug/ml的scFv抗-ephrin B2下在補充有10%胎牛血清的EGM Bullet Kit培養基(Lonza)中使HUVEC細胞生長至匯合。在37°C和5%C02下孵育20分鐘后，使用補充有蛋白酶抑制劑混合物(Roche)和磷酸酶(Sigma)的裂解緩沖液(IOOmM Tris HCl pH8.0,150mM NaCl, ImM EDTA,5mM DTT,0.5%Triton XlOO)來裂解細胞。在4°C下在16，OOOxg下離心裂解物25分鐘然后將上清液在4°C下孵育2小時，在4°C下經過16小時與抗Eph B4 (R&D)的特異性抗體和偶聯到Sepharose (GE Healthcare)上的G蛋白形成復合物。最后,使用裂解緩沖溶液清洗免疫復合物兩次并且在7.5%聚丙烯酰胺凝膠SDS-PAGE上電泳。通過免疫印跡進行磷酸化的Eph B4的檢測。為此，將通過抗-Eph B4免疫沉淀的并且通過電泳分離的蛋白轉移到硝酸纖維素膜Hybond-C(GE Healthcare)并且在室溫下用補充有 0.05% 的吐溫 20(Sigma)和 3% Phosphobiocker 封閉劑(Cell Biolabs, Inc.)的PBS封閉I小時。然后，在4°C下用1:2000稀釋的連接到過氧化物酶(Millipore)上的單克隆抗體4G10抗磷酸酪氨酸孵育該膜16小時。通過SuperSignal West Femto Substrate
(Thermo Scientific)使用化學發光檢測來進行可視化。為了檢測全部Eph B4,在室溫下使用Strong Plus ReBlot試劑(Chemicon)再生該膜15分鐘并且在4°C下用在PBS (含有
0.05%吐溫20和5%脫脂奶)中1:1000稀釋的抗-Eph B4抗體(R&D)孵育16小時。使用含有0.05%吐溫20的PBS清洗數次后，在室溫下用過氧化物酶連接的抗山羊抗體(1:5000)(Dako)孵育該膜2小時并且使用ECL Plus試劑(GE Healthcare)來使條帶可視化。實施例2:在體外在HUVEC細胞中Bll與2B1抗體的抗血管生成活性分析了 Bll和2B1抗體在血管生成能力及內皮細胞遷移上的作用。為此，分別進行了在基質膠中管道形成實驗以及使用HUVEC細胞(人臍靜脈內皮細胞)的體外傷口愈合實驗。在基質膠上的管道形成實驗中，發現在100ug/ml的Bll抗體存在下HUVEC細胞構成小管的數量比不使用抗體或使用不相關的scFv的對照低2倍(圖6)并且，除了在處理6小時下小管數量減少之外，還有更多細胞排列成單層，證明抗體的存在阻止管道的形成。使用克隆2B1獲得了相似的結果，但是與Bll相比具有更低的抑制能力，與對照相比較為40%。為了測定對HUVEC細胞水平遷移的影響，在作為刺激遷移試劑的血管內皮細胞生長因子(VEGF)存在下進行單層愈合實驗。在形成傷口 24小時后，在該過程中如果存在VEGF或VEGF及不相關抗體，60%的單層細胞遷移到自由空間中。相比之下，用VEGF和Bll或2B1處理的那些傷口，分別通過僅25%或30%的細胞克隆，這些數據可與無遷移刺激物的負對照(20%)中遷移細胞的數量相比(圖7)。因此，可以從兩個實驗中得出，BI I和2B1抗體，并且尤其是第一個(對于印hrinB2具有特異性)，顯示抗血管生成能力并且能夠在體外抑制內皮細胞遷移。在基質膠中毛細管形(Capillary-shape)結構形成測試使用基質膠(BD Biosciences)包被24孔板并且在37°C下孵育20分鐘進行膠凝化。然后，在處于補充有10%胎牛血清的Iml完全培養基EGM-2bullet Kit(Lonza)中的基質膠層上涂布5x104HUVEC細胞，并且在不同抗生素存在下在37°C下孵育6小時至100 μ g/ml ο在6小時時,通過分析在裝備有照相機的顯微鏡AxiovertlOO (Zeiss)中獲得的數字圖像來研究管狀結構的形成程度。體外創傷愈合實驗
使用體外傷口愈合來進行細胞遷移實驗。在用補充有0.5%胎牛血清的EGM-2(Lonza)孵育I小時后，在24孔板中使HUVEC細胞生長至匯合，使用吸管尖端開始制造線性刮擦(scraping)并且拍攝該區域照片。在不存在(對照條件)或存在作為遷移刺激物的100ug/ml VEGF (血管內皮細胞生長因子,Peprotech)和100ug/ml相應的抗體下孵育細胞。在24小時后拍攝該區域照片，將水平遷移至創傷區域的細胞計數并且由進行刮擦的時間來測定遷移面積的百分比。實施例3:B11和2B1抗體對體內基質膠植入物的血管生成的作用為了證明抗體2B1和Bll能夠直接抑制體內血管生成，在每組六個動物的無胸腺裸nu/nu小鼠中進行補充有VEGF (Peprotech)的基質膠植入物的實驗。在植入相應的基質膠6天后，通過對存在于移開的植入物中的血紅蛋白定量以及通過CD34的免疫組織學染色，緊接著通過針對血管標記計算陽性區域，來估計毛細血管網的形成。在植入基質膠后(隔天)立即靜脈內開始用相應的抗體進行治療，直到最終劑量為300ug/小鼠。不使用VEGF的植入物用作陰性對照，其中并沒有產生任何血管生成(圖8A)。作為對比，VEGF植入物以及用VEGF和不相關的scFv處理的植入物顯示顯著的血管生成(視為本實驗的陽性對照)。使用抗體Bll處理的動物顯示最小的血管生成，比陽性對照低95%，可與植入不含生長因子的基質膠的動物體內存在的那些相比較，這反映在植入物中缺乏針對⑶34和血紅蛋白陽性的內皮細胞(圖SB)。使用2B1抗體處理的這組小鼠對于陽性對照顯示50%的血管形成抑制。體內管道形成測試使用4至6周齡的無胸腺nu/nu小鼠(Charles River)。對于對照組,用2%異氟烷麻醉的小鼠被注入200ul基質膠(BD Biosciences)。另一組動物在上腹部區域注入補充有50ng/ml VEGF和375 μ g/ml肝素(Sigma)的200ul基質膠。植入基質膠后,立即開始每隔一天靜脈內用scFv來治療，直到總劑量為300 μ I/小鼠。6天后，移除植入物并且根據存在的血紅蛋白的濃度以及用抗-⑶34 (—種血管標記物)染色的組織切片來測定新血管的形成。為了測量血紅蛋白，取得每個基質膠植入物的一部分，稱重并在300ul蒸餾水中勻化。在16，OOOx g下離心5分鐘后，取出IOOul上清液并用TMB底物(3，3’，5_5’ -四甲基聯苯胺)(Sigma) 1:1稀釋。15分鐘后，通過在650nm下測量光密度來評估顏色反應。最后，將這些數值標準化成植入物的重量。對于免疫組織化學分析，植入物的部分固定在10%福爾馬林緩沖液中，包埋在石蠟中并且用切片機切成2.5um厚度。使用Tris-EDTA pH9.0來進行抗原性恢復并且用1:75稀釋的大鼠單克隆抗-⑶34 (Abcam)來標記內皮細胞,隨后是標記有過氧化物酶(BiocareMedical)的抗大鼠二抗。使用3，3_ 二氨基聯苯胺四氫氯化合物plus (DAKO)進行可視化并且使用蘇木精復染。通過AxioVision系統(Zeiss)對陽性細胞計數。實施例4 =Bll和2B1抗體在無胸腺小鼠中抑制人類腫瘤的生長。假定證明的Bll和2B1抗體在體內和體外影響血管生成的能力，還研究了它們是否也能夠抑制隨著腫瘤生長高度依賴血管生成的過程。為此，使用具有胰腺癌細胞(BxPC3)、結腸直腸(癌細胞)(SW620)和肺(癌細胞)(H460)的三種小鼠異種移植模型。結腸和肺細胞組成性地表達熒光蛋白mCherry，以便通過分析發出的熒光來跟蹤腫瘤的進展。在前面，發現抗體Bll和2B1在體外在所應用的三個細胞系中對細胞存活性都沒有產生影響。將BxPC3細胞皮下植入2組8只小鼠中并且一旦檢測到肉眼可見的腫瘤塊，就隔天靜脈內用Bll和2B1開始治療，直到完成劑量為20mg/kg或PBS作為負對照。在植入腫瘤細胞60天后觀察到使用Bll抗體處理的該組小鼠顯示腫瘤尺寸明顯減小，與對照組的平均腫瘤尺寸相比顯示了 70%的生長抑制(圖9)。2B1處理的小鼠在腫瘤生長中顯示適中的減少，為大約35%。
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為了研究負責抑制腫瘤生長的機制，在用抗體治療完成后一天將幾個腫瘤移除并且分別使用抗半胱天冬酶3 (caspase3)活性、Ki67、CD34和Lyvel的抗體進行了免疫組織化學分析以便評估凋亡狀態、增殖、血管生成和淋巴管生成(圖10)。與對照相比，使用Bll處理的腫瘤中凋亡細胞的數量增加了 5倍。通過對比，在使用2B1和對照處理的腫瘤之間凋亡細胞的數量之間沒有顯著差異。關于增殖標記物Ki67，處理的和對照動物的腫瘤之間沒有典型的差異，在所有三個組中均顯示約30%的Ki67陽性細胞。當通過測量腫瘤中針對⑶34陽性的區域來分析血管的存在時，相對于對照，使用Bll處理的腫瘤中有80%的減少并且相對于對照組，使用2B1處理的腫瘤有55%的減少。最后，通過Lyvel標記分析了淋巴管的存在，在使用Bll處理的那些腫瘤中幾乎完全觀察不到淋巴管。在使用2B1處理的腫瘤中也觀察到了淋巴管數量顯著地減少，但是沒有在Bll的情況中的顯著。然后，使用上述相同步驟在其他異種移植模型中來研究Bll抗體的抗血管生成能力和抗淋巴管生成能力以及腫瘤生長抑制能力。在細胞系SW620結腸癌的情況中，在植入后23天以后觀察到腫瘤尺寸90%的減小(圖11A)，而在肺細胞的情況中有65%的減小(圖11B)。使用腫瘤細胞中存在的突光發光mCherry蛋白的類似降低來證明相應尺寸的減小。免疫組織化學分析證實在使用Bll治療的腫瘤中血管數量的減少以及淋巴管的缺乏(如在胰腺癌細胞的模型中所觀察到的)。因此，可以得出結論:印hrin B2特異性的Bll抗體具有潛在的抗血管生成能力和抗淋巴管生成能力，這將導致使用該抗體治療的那些腫瘤的生長的降低或延遲。2B1抗體還具有良好的抗血管生成能力和抗淋巴管生成能力。異種移植存在三種類型的異種移植:使用胰腺癌細胞(BxPC3)、結腸直腸(癌細胞)(SW620，穩定地表達熒光蛋白mCherry (Clontech))和肺(癌細胞)(H460，穩定地表達熒光蛋白mCherry)ο在所有三種情況中，本質上使用相同的實驗方案。將處于0.2ml PBS體積中的
I至5百萬人類腫瘤細胞皮下注入免疫缺陷小鼠的側面(nude或SCID，“重度聯合免疫缺陷病”)直到觀察到肉眼可見的腫瘤塊(大致30_3)。此時，隔天通過尾部靜脈經靜脈給予處于100-200ul PBS中的相應抗體持續兩周或直到達到20mg/kg的最終劑量來開始治療。使用相同的方案對照動物接受PBS。每周2-3次使用卡尺來測量腫瘤的尺寸并且，在異種移植有mCherry突光蛋白標記細胞的小鼠情況中，在IVIS imaging System Spectrum200(Caliper Life Scien ces)中在610nm下測量突光發射強度(每秒及每平方厘米的光子數)以便以mCherry蛋白發射強度的函數形式來顯示腫瘤生長。圖像的最終處理包括殘留信號扣除(移除自發熒光)及色標(colour scale)隨后是信號強度曲線。根據與使用實驗動物相關的現存法律，當腫瘤達到1500-2000_3的預設尺寸時，通過CO2窒息來處死動物。使用Student t-檢驗通過參數分析來進行腫瘤生長測量的統計分析。統計顯著性水平設置在p^0.05。組織學分析在用抗體治療完成后一天由處死的動物中提取來自異種移植的小鼠的腫瘤樣品。樣品用福爾馬林固定并且包埋在石蠟中。將來自每個腫瘤的組織切片用蘇木精及曙紅染色或制備用于免疫組織化學表征。通過用兔抗Ki67 (DAKO)的單克隆抗體染色來分析腫瘤細胞的增殖活性，使用兔多克隆抗-活性半胱天冬酶3 (R&D)來檢測凋亡細胞的存在，通過使用特異性的大鼠單克隆抗體(Abcam)在內皮細胞上針對CD34染色來測量新血管形成并且通過用兔多克隆抗-LYVEl (Abcam)染色來標記淋巴管。使用3，3-二氨基聯苯胺四氫氯化物plus (DAKO)來進行所有切片的可視化并且用蘇木精復染。通過AxioVision系統((Zeiss)對陽性細胞計數。實施例5:體內腫瘤塊的生物分布及定位為了分析動物中抗體的分布及證實其在腫瘤生長區域中的定位，設計了一個實驗，其中具有腫瘤細胞系的異種移植小鼠，在H460肺癌的情況中，使用熒光染料標記的抗體 AlexaFluor750 (Molecular Probes,分子探針)(其是近紅外發射)進行治療。為了確認腫瘤塊的位置，使用了表達熒光蛋白mCherry的細胞。將H460細胞皮下植入無胸腺裸nu/nu小鼠的背部區域中。當腫瘤達到約0.3cm3的體積時,將15ug結合有AlexaFluor 750的抗體靜脈內給藥。在給藥后0.5，2，6，24和48小時，由腹部和背部區域拍攝圖像。小鼠背部圖像的研究用于定位腫瘤塊中抗體的位置(給藥半小時(圖12A)和在6小時處的峰值(圖12B))。在6小時處在腫瘤中通過抗體Bll發射的熒光強度明顯超過通過抗體2B1顯示的熒光強度，表明與2B1相比，Bll在腫瘤區域中更有效地定位。半小時后，膀胱和腎中的信號非常強烈，表明通過腎臟抗體快速地并且積極地消除。在48小時，在這些區域中信號非常弱，其值接近于自發熒光，表明幾乎所有抗體都被完全消除。另外，在上腹部區域中在第一小時期間動物顯示熒光信號(可歸因于通過肝膽途徑消除抗體的程度)，當單獨地分析器官時可以證明該事實并且發現在6小時處肝臟顯示了大致Ixl08p/S/Cm2/Sr (光子/秒/平方厘米/立體角)的熒光。生物分布對于scFv分布的實驗,使用具有穩定表達mCherry突光蛋白的H460肺癌細胞系的異種移植裸小鼠。進行具有熒光標記的細胞的應用以明確地定位腫瘤。皮下注入5xl06個細胞并且允許生長直到腫瘤塊達到約500mm3的尺寸。類似地，根據制造商的說明通過SAIVI 快速抗體標記試劑盒(Invitrogen)將scFv連接至突光染料AlexaFluor 750。
一旦腫瘤達到預期的尺寸，每只小鼠靜脈注入15ug的標記抗體。在給予標記scFv的藥物后，使用體內成像系統IVIS Spectrum200 (Caliper Life Sciences)在749nm下激發突光染料，在0.5，2，6，24和48小時處拍攝體內熒光圖像。在移除自發熒光后，我們根據信號強度曲線給出色標(colour scale)。·
權利要求
1.一種分離的多肽，其特征在于 (a)包含與SEQID NO: I至少76%序列一致性的氨基酸序列并且 (b)特異性地識別并結合至ephrinB2。
2.根據前面權利要求所述的多肽，其中所述氨基酸序列是SEQID NO: I。
3.根據前面權利要求任一項所述的多肽，其中所述多肽是抗體。
4.根據前一權利要求所述的多肽，其中所述抗體是人類的。
5.根據前一權利要求所述的多肽，其中所述人類抗體的同種型是IgGl，IgG2，IgG3，IgG4,或 IgA0
6.根據前面權利要求任一項所述的多肽，其特征在于還包含信號肽。
7.根據前一權利要求所述的多肽，其中所述信號肽是SEQID N0:6。
8.根據前面權利要求任一項所述的多肽，其特征在于還包含至少一個標記。
9.根據前一權利要求所述的多肽，其中所述標記選自以下列表，包括c-myC、FLAG、HA、組氨酸鏈、GST、生物素、VSV-G、HSVtk、V5、生物素、親和素、鏈霉親和素、麥芽糖結合蛋白和熒光蛋白。
10.根據前一權利要求所述的多肽，其中所述標記是組氨酸鏈，c-mvc或兩者。
11.根據前一權利要求所述的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列是SEQID N0:7。
12.—種抗ephrin B2抗體,其氨基酸序列包含根據前面權利要求任一項所述的多肽。
13.一種核酸，編碼根據權利要求I至11中任一項所述的多肽或根據權利要求12所述的抗體。
14.一種載體,包含根據前一權利要求所述的核酸。
15.根據前一權利要求所述的載體，其中所述載體是表達載體。
16.—種細胞，包含根據權利要求14或15中任一項所述的載體。
17.根據前一權利要求所述的細胞，其中所述細胞是原核的。
18.根據權利要求16所述的細胞，其中所述細胞是真核的。
19.根據前一權利要求所述的細胞，其中所述細胞是哺乳動物細胞。
20.一種用于獲得根據權利要求I至11中任一項所述的多肽或根據權利要求12所述的抗體的方法，包括以下步驟Ca)在細胞中表達根據權利要求15描述的所述載體，以及(b)純化步驟(a)中表達的所述多肽。
21.根據前一權利要求所述的方法，其中所述細胞是原核的。
22.根據權利要求20所述的方法，其中所述細胞是真核的。
23.一種檢測和/或定量ephrin B2的方法，包括如下步驟(a)將分離的生物樣品與根據權利要求I至11中任一項所述的多肽或與根據權利要求12所述的抗體接觸，以及(b)檢測和/或定量通過所述ephrin B2與(a)中使用的樣品中的所述多肽或所述抗體形成的復合物。
24.—種診斷與ephrin B2表達相關疾病的方法,包括如下步驟(a)將分離的生物樣品與根據權利要求I至11中任一項所述的多肽或與根據權利要求12所述的抗體接觸，(b)檢測和/或定量通過所述ephrin B2與(a)使用的樣品中的所述多肽或所述抗體形成的復合物，(c)將檢測到的ephrin B2水平與對照水平進行比較，并且(d)將這種比較結果與疾病的存在或不存在相關聯。
25.根據權利要求I至11中任一項所述的多肽或根據權利要求12所述的抗體用于制備藥物的應用。
26.根據前一權利要求所述的應用，用于抑制血管生成。
27.根據前面兩項權利要求中任一項所述的應用，用于預防性或治療性治療與血管生成相關的病理狀態。
28.根據前面三項權利要求中任一項所述的應用，用于預防性或治療性治療腫瘤或癌癥。
29.根據前一權利要求所述的應用，其中所述腫瘤或癌癥是實體的。
30.根據前一權利要求所述的應用，其中所述癌癥是胰腺癌、結腸癌或肺癌。
31.一種組合物，包含根據權利要求I至11中任一項所述的多肽、根據權利要求12所述的抗體、根據權利要求13所述的核酸、根據權利要求14或15所述的載體或根據權利要求17至19中任一項所述的細胞。
32.根據前一權利要求所述的組合物，其中所述組合物是藥物組合物。
33.根據前一權利要求所述的組合物，其特征在于還包括藥用賦形劑。
34.根據權利要求31或32中任一項所述的組合物，其特征在于還包括抗血管生成劑。
35.根據權利要求31或32中任一項所述的組合物，其特征在于還包括化療劑。
36.根據前面五項權利要求中任一項所述的組合物用于制備藥物的應用。
37.根據前一權利要求所述的應用，用于抑制血管生成。
38.根據前面兩項權利要求中任一項所述的應用，用于預防性或治療性治療與血管生成相關的病理狀態
39.根據前一權利要求所述的應用，用于預防性或治療性治療腫瘤或癌癥。
40.根據前一權利要求所述的應用，其中所述腫瘤或癌癥是實體的。
41.根據前一權利要求所述的應用，其中所述癌癥是胰腺癌、結腸癌或肺癌。
全文摘要
本發明涉及新的抗-ephrin-B2抗體并且涉及其用于檢測這種蛋白的應用以及作為在治療涉及所述過程的疾病，例如癌癥，中用于抑制血管生成和淋巴管生成的藥物。
文檔編號C07K16/28GK103237812SQ201180053464
公開日2013年8月7日 申請日期2011年9月20日 優先權日2010年9月21日
發明者喬治·路易斯·馬丁內斯托雷夸德拉達, 瑪麗亞·安赫萊斯·阿本格扎爾因方特斯 申請人:國家腫瘤學研究中心基金會(Cnio)