專利名稱：用于治療hiv的抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及能夠特異性結合于趨化因子受體(CXCR)的新抗體，特別是嵌合的和人源化的鼠單克隆抗體，以及編碼此抗體的氨基酸和核酸序列。從一方面講，本發明涉及能夠特異性結合于CXCR4并具有對抗人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的強活性的新抗體、功能性片段或衍生物。本發明還包括這種抗體、功能性片段或衍生物作為預防和/或治療性治療HIV感染的藥物的用途。
背景技術：
趨化因子是小的、分泌肽，其控制著(特別是免疫反應期間)白細胞沿配體化學梯度(被稱為趨化因子梯度)的遷移(Zlotnick A.等人，2000)。基于其NH2-端半胱氨酸殘基的位置、及與G蛋白偶聯受體(其兩個主要亞家族被命名為CCR和CXCR)的結合，將趨化因子分為兩個主要的亞家族，CC和CXC。到目前為止，發現了超過50個人趨化因子和18個趨化因子受體。趨化因子受體 家族的若干成員作為主要受體CD4的共受體發揮作用，使得HIVl型的不同株能夠進入細胞，主要的共受體是CCR5和CXCR4。T細胞向性X4HIV-1使用⑶4和CXCR4進入細胞，而巨噬細胞向性R5HIV-1使用⑶4和CCR5。雙向性株能使用CXCR4和CCR5作為共受體。其它趨化因子受體中的CCR3、CCR2、CCR8、CXCR6、CXCR7、CX3CR1能作為HIV株更限制亞群的共受體發揮作用。SDF-1 (CXCR4 的天然配體)以及 CCR5 的 CCL3、CCL4、CCL4-L1 和 CCL5 配體能夠抑制HIV-1不同株引起的細胞融合和感染。這些發現促進了靶向趨化因子受體的抗HIV治療的發展，導致CCR5小分子拮抗劑馬拉維諾(maraviroc) (CELSENTRI )獲準與其它抗HIV-1試劑組合用于CCR5向性HIV-1感染的患者。然而，馬拉維諾不能用于被雙向性HIV-1感染的患者或者被CXCR4向性HIV-1感染的患者(VIDAL2009)。因此，對于通過鑒定能抑制X4向性HIV復制的CXCR4拮抗劑在X4向性和雙向性HIV感染的患者中擴展此類治療有明確的醫學需求。趨化因子受體4 (也被稱為融合素、⑶184、LESTR或HUMSTR)以包括352個或360個氣基酸的兩種同種型形式存在。殘基Asnll是糖基化的，殘基Tyr21被加入硫酸鹽基團所修飾，而Cysl09和186在受體的細胞外部分以二硫鍵橋相結合(Juarez J.等人,2004)。不同類型正常組織、初始(na'fve)、非記憶性T細胞、調節性T細胞、B細胞、中性粒細胞、內皮細胞、原代單核細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞、CD34+造血干細胞均表達此受體，而且在心臟、結腸、肝、腎和腦中以低水平表達。CXCR4在白細胞運輸、B細胞淋巴細胞生成和髓細胞生成中起關鍵作用。到目前為止所描述的CXCR4受體的唯一配體是間質細胞衍生因子I (SDF-1)或CXCL12。SDF-1在淋巴結、骨髓、肝、肺中大量分泌，而腎、腦和皮膚分泌程度較少。CXCR4還被拮抗性趨化因子，人單純皰疹病毒III型所編碼的病毒巨噬細胞炎癥蛋白II(vMIP-1I)，所識別。
如前面所提及的，CXCR4受體是T細胞向性HIV-1分離株(X4病毒)的主要共受體。干擾此受體將以很有效的方式抑制X4病毒復制。
發明內容
本發明的一個發明性方面是生成抑制HIV復制的小鼠單克隆抗體(Mab)。本發明包括能結合于CXCR4同源二聚體并具有抗HIV感染的強活性的CXCR4Mab515H7(或其片段)。發明還包括能結合于CXCR4同源二聚體并具有抗HIV感染的強活性的CXCR4Mab301aE5(或其片段)。令人吃驚的是，發明人已設法生成單克隆抗體，該抗體能夠結合于CXCR4，并且能夠誘導CXCR4同源二聚體的構象變化，而且能抑制原代分離株X4-HIV-1在PBMC中的復制。更特別的是，本發明的抗體還能夠抑制原代分離株X4/R5-HIV-1在PBMC中的復制。 優選地，CXCR4化合物是選自如下的兩個人CXCR4同種型之一:-趨化因子(C-X-C基序)受體4同種型b[人(Homo sapiens)],具有Genbank登錄號NP_003458所描述的序列SEQ ID N0.27:MEGISIYTSDNYTEEMGS⑶YDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGIVGN GLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFffAVDAVANWYFGNFLC KAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVGVWIPA LLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVWFQFQHMVGLILPGIVILSCYCI IISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFENT VHKffISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRG GHSSVSTESESSSFHSS ；-趨化因子(C-X-C基序)受體4同種型a[人]，具有Genbank登錄號NP_001008540所描述的序列SEQ ID N0.28:MSIPLPLLQIYTSDNYTEEMGS⑶YDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTGI VGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGN FLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVGVff IPALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVWFQFQHMVGLILPGIVILSC YCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFE NTVHKffISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGK RGGHSSVSTESESSSFHSS ；-可選的轉錄剪接變體或其天然變體，其與具有SEQID N0.27或28的這些b或a同種型中的一個具有至少95%的同一性；及-其片段，其能夠被其天然配體間質細胞衍生因子I(SDF-1)所特異性識別，并且具有優選至少100、150和200個氨基酸的長度。CXCR2選自如下:-白介素8受體β[人]，具有Genbank登錄號NP_001548所描述的序列SEQ IDN0.29:MEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFVVIIY ALVFLLSLLGNSLVMLVILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKVN GfflFGTFLCKVVSLLKEVNFYSGILLLACISVDRYLAIVHATRTLTQKRYLVKFIC LSIWGLSLLLALPVLLFRRTVYSSNVSPACYEDMGNNTANWRMLLRILPQSFGFI VPLLIMLFCYGFTLRTLFKAHMGQKHRAMRVIFAVVLIFLLCWLPYNLVLLADT LMRTQVIQETCERRNHIDRALDATEILGILHSCLNPLIYAFIGQKFRHGLLKILAIH GLISKDSLPKDSRPSFVGSSSGHTSTTL ；-可選的轉錄剪接變體或其天然變體，與具有SEQID N0.29的這種白介素8受體3具有至少95%的同一性；及-其片段，能夠被IL-8所特異性識別，并且具有優選至少100、150和200個氨基酸的長度。發明還包括用于選擇具有抗HIV活性的化合物或能用于制備治療HI V感染的組合物的化合物的方法，特征在于所述方法包括步驟:第一方面中，本發明的主題是用于生成和選擇根據本發明的抗體的方法。更特別的是，本發明涉及用于選擇能夠抑制HIV復制的抗CXCR4抗體或其功能性片段或衍生物之一的方法，包括下列步驟:i)篩選生成的抗體及選擇能特異結合于CXCR4的抗體；ii)檢驗步驟i)所選的抗體，并選擇能結合外周血單核細胞(PBMC)的抗體，iii)檢驗步驟ii)所選的抗體，并選擇能結合于CXCR4同源二聚體的抗體，并且隨后iv)檢驗步驟iii)所選的抗體，并選擇能抑制原代分離株X4-向性HIV-1在PBMC中復制的抗體。在另一實施方式中，發明涉及用于選擇能抑制HIV復制的抗CXCR4抗體或其功能性片段或衍生物之一的方法，包括下列步驟:i)篩選生成的抗體及選擇能特異結合于CXCR4的抗體；ii)檢驗步驟i )所選的抗體，并選擇能結合外周血單核細胞(PBMC)的抗體，iii)檢驗步驟ii)所選的抗體，并選擇能結合于CXCR4同源二聚體的抗體，并且隨后iv)檢驗步驟iii)所選的抗體，并選擇能抑制原代分離株X4-向性HIV-1在PBMC中復制和/或能抑制原代分離株X4/R5-向性HIV-1在PBMC中復制的抗體。抗體的生成可以通過本領域技術人員所知的任意方法實現，如例如，將骨髓瘤細胞與來自免疫小鼠或與所選骨髓瘤細胞兼容的其它物種的脾細胞相融合[Kohler&Milstein, 1975，Nature, 256:495-497]。免疫動物可包括帶有人類免疫球蛋白基因座其之后直接生產人類抗體的轉基因小鼠。另一可能的實施方式可以包括使用噬菌體展示技術來篩選文庫。篩選步驟i)和ii)可以通過本領域技術人員所知的任意方法或過程來實現。作為非限制性實例，可以提到ELISA、BIAcore、免疫組化、使用CXCR4表達細胞膜提取物或純化的CXCR4的蛋白印跡分析、FACS分析及功能篩選。優選的方法包括通過FACS分析在CXCR4轉染子上(步驟I)和至少在PBMC上(步驟2)進行篩選以確保生產的抗體也能識別靶標細胞表面的天然CXCR4受體構象。在下列實施例中更精確描述此方法。篩選步驟iii)可以通過本領域技術人員所知的任意方法或過程來實現。作為非限制性但優選的實例，可以提及的是在來自CXCR4轉染細胞或PBMC的膜提取物上使用目標抗體進行的蛋白印跡和/或免疫沉淀技術。篩選步驟iv)可以通過本領域技術人員所知的任意方法或過程來實現。作為非限制性但優選的實例，可以提及的是包括抗體篩選的方法，通過使用Holl等人所述的規程(J.1mmunol.2004，173，6274-83)篩選有能力抑制 X4 原代 HIV-1 和 / 或 X4/R5 原代 HIV-1分離株在PBMC中復制的抗體。
在本發明方法的篩選步驟iii)的優選實施方式中，所述步驟iii)包括通過BRET分析在表達CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP的細胞上評估抗體，并且選擇能抑制至少40%、優選45%、50%、55%和最優選60%BRET信號的抗體。BRET技術是被稱為蛋白質二聚體化的代表技術[Angers等人，PNAS，2000，97:3684-89]。在方法的步驟iii)中所用的BRET技術，為本領域技術人員所熟知，并在下列實施例中有詳細描述。更特別的是，BRET (生物熒光共振能量轉移)是在生物熒光供體(海腎熒光素酶(Rluc))和熒光受體GFP (綠色熒光蛋白)或YFP (黃色熒光蛋白))突變體間發生的非輻射性能量轉移。在本案例中使用EYFP (增強型黃色熒光蛋白)。轉移效率取決于供體和受體之間的方向和距離。那么，只有當兩個分子靠近(1-1Onm)時才能發生能量轉移。此性質被用于生成蛋白質-蛋白質相互作用分析。事實上，為了研究兩個配偶體(partner)間的相互作用，一般第一個融合于海腎熒光素酶而第二個融合于GFP的黃色突變體。融合蛋白一般(但不一定)表達于哺乳動物細胞。在其膜滲透性底物(腔腸素(coelenterazine))存在時，Rluc發射藍光。如果GFP突變體距離Rluc不足10nm，會發生能量轉移并能檢測到額外的黃色信號。BRET信號被測定為受體所發射的光與供體所發射的光的比例。因此，隨著兩個融合蛋白被拉近或構象變化使得Rluc和GFP突變體更靠近的時候，BRET信號將會增強。如果在優選實施方式中包括BRET分析，可以使用本領域技術人員所知的任意方法測量CXCR4 二聚體的構象變化。可提及下列技術，不受限制:FRET (熒光共振能量轉移)、HTRF (均相時間分辨熒光)、FUM (熒光壽命成像顯微鏡)或SW-FCCS (單波長熒光交叉相關光譜)。也可使用其它經典技 術，如共免疫沉淀、a篩選、化學交聯、雙雜交、親和層析、ELISA或Far蛋白印跡。在根據發明所述方法的具體方面中，步驟iii)包括通過BRET分析在表達CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP兩者的細胞上評估抗體，并且選擇能抑制至少40%BRET信號的抗體。在第二方面中，本發明的主題是通過所述方法獲得的分離抗體或其功能性片段或衍生物之一。所述抗體或其所述片段或衍生物之一，能夠特異性結合人CXCR4，所述抗體也能誘導CXCR4同源二聚體構象變化。從文獻中可知CXCR4Mab之類(例如克隆A120)能夠抑制HIV-1實驗株(X4HIV-1NL4_3)進入 PBMC (Tanaka R.等人，J.Virol.2001，75，11534-11543)。而且，也知道CXCR4Mab能抑制HIV-1X4原代分離株進入表達CXCR4的細胞系。反過來，從未公布過能抑制在其自然環境中的此類病毒(即不只是在實驗室病毒或細胞系中)的抗體。無論如何，本發明的新穎且非顯而易見的方面是CXCR4Mab能抑制HIV-1X4原代分離株進入PBMC。表達“功能性片段及衍生物”和“抗原結合片段和衍生物”是相似的，且將隨后在本說明中詳細定義。此處應理解的是本發明不涉及天然形式的抗體，那就是說抗體并不在其天然環境中，但能夠通過自天然來源純化而將其分離或獲得，或者另外通過遺傳重組、或者通過化學合成獲得，并且因此抗體能包含此后所描述的非天然氨基酸。
更特別的是，根據發明的另一方面，要求保護分離的抗體或其功能性片段或衍生物之一，所述抗體特征在于:它們包括至少一個互補決定區CDR,該CDR選自包括如通過IMGT編號系統所定義的氨基酸序列SEQ ID N0.1至6和30至33的⑶R。根據第一方面，本發明涉及分離的抗體、或其功能性片段或衍生物，包括選自根據IMGT編號系統所定義的序列SEQ ID N0.1至6的⑶R的至少一個⑶R，或者其序列與序列SEQ ID N0.1至6進行最佳比對后具有至少80%、優選85%、90%、95%和98%同一性的至少一個 CDR。根據第二方面，本發明涉及分離的抗體、或其功能性片段或衍生物，包括選自根據IMGT編號系統所定義的序列SEQ ID N0.1,2和30至33的⑶R的至少一個⑶R，或者其序列與序列SEQ ID N0.1,2和30至33進行最佳比對后具有至少80%、優選85%、90%、95%和98%同一性的至少一個⑶R。抗體的“功能性片段”或“抗原結合片段”意指，特別是，抗體片段，如片段Fv、scFv(SC=單鏈)、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv_Fc或雙特異抗體、或其半衰期被延長的任意片段。此功能性片段將在隨后的 本說明中詳細描述。抗體的“衍生化合物”或“衍生物”意指，特別是，為保持其識別CXCR4的活性、由肽支架和原始抗體至少一個CDR構成的結合蛋白質。此衍生化合物，為本領域技術人員所熟知，將在隨后的本說明中更詳細描述。更優選的是，根據本發明，本發明包括通過遺傳重組或化學合成獲得的特別是嵌合或人源化的抗體、其衍生化合物或其功能性片段。根據優選的實施方式，根據本發明所述的抗體、或其衍生化合物或功能性片段，特征在于其由單克隆抗體組成。應了解“單克隆抗體”意指來自于幾乎同源抗體群的抗體。更特別指，群中的個體抗體(除一些可能以最小比例發現的天然產生的突變以外)是相同的。換句話說，單克隆抗體由來自于單個細胞克隆(例如雜交瘤、轉染有編碼同源抗體的DNA分子的真核宿主細胞、轉染有編碼同源抗體的DNA分子的原核宿主細胞等)生長的同源抗體構成，并且一般以一類且僅一類和亞類的重鏈、及僅一個類型的輕鏈為特征。單克隆抗體是高度特異的并針對單一抗原。此外，與通常包括針對各種決定簇或表位的各種抗體的多克隆抗體制備物相對比，各單克隆抗體針對單一的抗原表位。更特別的是，根據本發明的第一優選實施方式，抗體、或其衍生化合物或功能性片段，特征在于其包括含有選自⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3的至少一個⑶R的輕鏈，其中:-CDR-Ll 包括氨基酸序列 SEQ ID N0.1、-CDR-L2 包括氨基酸序列 SEQ ID N0.2、-CDR-L3 包括氨基酸序列 SEQ ID N0.3。根據另一實施方式，發明的抗體、或其衍生化合物或功能性片段之一，特征在于其包括含有序列SEQ ID N0.1、2或3的三個⑶R中至少一個、或與序列SEQ ID N0.1、2或3進行最佳比對后具有至少80%、優選85%、90%、95%和98%同一性的至少一個序列的輕鏈。發明的抗體、或其功能性片段或衍生物之一，特征還在于其包括含有⑶R-L1、CDR-L2和CDR-L3的輕鏈，其中CDR-Ll包括氨基酸序列SEQ ID N0.1，CDR-L2包括氨基酸序列SEQ ID N0.2而且CDR-L3包括氨基酸序列SEQ ID N0.3。
在另一實施方式中，本發明的抗體、或其功能性片段或衍生物之一，特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID N0.7或與序列SEQ ID N0.7進行最佳比對后具有至少80%、優選85%、90%、95%和98%同一性的至少一個序列的輕鏈序列。根據發明的第二個優選實施方式，抗體、或其衍生化合物或功能性片段，特征在于其包括含有選自⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3的至少一個⑶R的輕鏈，其中:-CDR-Ll 包括氨基酸序列 SEQ ID N0.1，-CDR-L2 包括氨基酸序列 SEQ ID N0.2，-CDR-L3 包括氨基酸序列 SEQ ID N0.30。根據另一實施方式，發明的抗體、或其衍生化合物或功能性片段之一，特征在于它們包括含有序列SEQ ID N0.1、2或30的三個⑶R中至少一個、或與序列SEQ ID N0.1、2或30進行最佳比對后具有至少80%、優選85%、90%、95%和98%同一性的至少一個序列的輕鏈。本發明的抗體、或其功能性片段或衍生物之一，特征還在于其包括含有⑶R-L1、CDR-L2和CDR-L3 的輕鏈，其中CDR-Ll包括氨基酸序列SEQ ID N0.1，CDR-L2包括氨基酸序列SEQ ID N0.2且CDR-L3包括氨基酸序列SEQ ID N0.30。在另一實施方式中，發明的抗體、或其功能性片段或衍生物之一，特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID N0.34或與序列SEQ ID N0.34進行最佳比對后具有至少80%、優選85%、90%、95%和98%同一性的至少一個序列的輕鏈序列。更特別的是，本發明的抗體、或其衍生化合物或功能性片段之一，特征在于其包括含有選自CDR-Hl、CDR-H2和CDR-H3的至少一個CDR的重鏈，其中:-CDR-Hl 包括氨基酸序列 SEQ ID N0.4，-CDR-H2 包括氨基酸序列 SEQ ID N0.5，-CDR-H3 包括氨基酸序列 SEQ ID N0.6。根據另一實施方式，本發明的抗體、或其衍生化合物或功能性片段之一，特征在于其包括含有序列SEQ ID N0.4、5或6的三個⑶R中至少一個、或與序列SEQ ID N0.4、5或6進行最佳比對后具有至少80%、優選85%、90%、95%和98%同一性的至少一個序列的重鏈。根據另一具體的實施方式，抗體、或其衍生化合物或功能性片段之一，特征在于其包括含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的重鏈，其中CDR-Hl包括氨基酸序列SEQ ID N0.4，⑶R-H2包括氨基酸序列SEQ ID N0.5且⑶R-H3包括氨基酸序列SEQ ID N0.6。在另一實施方式中，本發明的抗體、或其功能性片段或衍生物之一，特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID N0.8、或與序列SEQ ID N0.8進行最佳比對后具有至少80%、優選85%、90%、95%和98%同一性的至少一個序列的重鏈序列。更特別的是，本發明的抗體、其衍生化合物或功能性片段之一，特征在于其包括含有選自CDR-Hl、CDR-H2和CDR-H3的至少一個CDR的重鏈，其中:-CDR-Hl 包括氨基酸序列 SEQ ID N0.31，-CDR-H2 包括氨基酸序列 SEQ ID N0.32， _CDR_H3 包括氣基酸序列 SEQ ID N0.33。根據另一實施方式，本發明的抗體、或其衍生化合物或功能性片段之一，特征在于其包括含有序列SEQ ID N0.31、32或33三個CDR的至少一個、或與序列SEQ ID N0.31,32或33進行最佳比對后具有至少80%、優選85%、90%、95%和98%同一性的至少一個序列的重鏈。根據另一具體實施方式
，抗體、其衍生化合物或功能性片段之一，特征在于其包括含有CDR-Hl、CDR-H2和CDR-H3的重鏈，其中CDR-Hl包括氨基酸序列SEQ ID N0.31，CDR-H2包括氨基酸序列SEQ ID N0.32且CDR-H3包括氨基酸序列SEQ ID N0.33。在另一實施方式中，本發明的抗體、或其功能性片段或衍生物之一，特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID N0.35、或與序列SEQ ID N0.35進行最佳比對后具有至少80%、優選85%、90%、95%和98%同一性的至少一個序列的重鏈序列。本發明的抗體、或其功能性片段或衍生物之一，特征在于其包括一條輕鏈和一條重鏈，其中該輕鏈包括分別含有氨基酸序列SEQ ID N0.1、2和3的⑶R-Ll、⑶R-L2和⑶R-L3，該重鏈包括分別含有氨基酸序列SEQ ID N0.4、5和6的⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3。最后，本發明的抗體、或其功能性片段或衍生物之一，特征還在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID N0.7的輕鏈和含有氨基酸序列SEQ ID N0.8的重鏈。本發明的抗體、或其功能性片段或衍生物之一，特征在于其包括一條輕鏈和一條重鏈，該輕鏈包括分別含有氨基酸序列SEQ ID N0.1、2和30的⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3，該重鏈包括分別含有氨基酸序列SEQ ID N0.31,32和33的⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3。最后，本發明的抗體、或其功能性片段或衍生物之一，特征還在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID N0.34的輕鏈和含有氨基酸序列SEQ ID N0.35的重鏈。在本說明書中，術語“多肽”、“多肽序列”、“肽”和“附著至抗體化合物或其序列的蛋白質”可互換。在此必須理解，本發明不涉及天然形式的抗體，即抗體并不取自其天然環境，但能夠通過從天然來源純化而 將 其分離或獲得，或者通過遺傳重組或化學合成獲得，并且因此抗體能攜帶下面所描述的非天然氨基酸。在第一個實施方式中，互補決定區或⑶R，意指Kabat等人所定義的免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的高可變區(Kabat等人，Sequences of proteins of immunologicalinterest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH, 1991,及以后的版本)。有三個重鏈⑶R和三個輕鏈⑶R。此處，取決于情況，術語“⑶R”和“⑶Rs”用于指示一個或多個、或甚至全部包含負責其識別的抗原或表位的抗體結合親和性的大多數氨基酸殘基的區域。在第二實施方式中，通過⑶R區域或⑶R( S)，意指如MGT所定義的免疫球蛋白重鏈和輕鏈的高可變區。MGT唯一編號被規定用于比較任何抗原受體、鏈類型或物種的可變結構域[Lefranc M.-P., Immunology Todayl8,509(1997)/Lefranc M.-P., The Immunologist,7,132-136(1999)/Lefranc, M.-P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier,E.,Truong, L., Thouvenin-Contet, V.和 Lefranc, Dev.Comp.1mmunol.,27,55-77(2003)]。在IMGT唯一編號中，保守氨基酸總具有同樣位點，例如半胱氨酸23 (第一 CYS)、色氨酸41 (保守的-TRP)、疏水氨基酸89、半胱氨酸104 (第二 CYS)、苯丙氨酸或色氨酸118(J-PHE 或 J-TRP)。IMGT 唯一編號提供了框架區域(FR1-MGT:1 至 26 位，FR2-1MGT:39至 55 位，FR3-1MGT:66 至 104 位和 FR4-1MGT:118 至 128 位)和互補決定區(CDRl-MGT:27至38，CDR2-1MGT:56至65和CDR3-1MGT:105至117)的標準化劃界。因為空位代表空置的位置，⑶R-1MGT長度(顯示在括號之間并以點分開，例如[8.8.13])成為重要的信息。MGT唯一編號被用于2D圖呈現，指定為頂GT Colliers de Perles [Ruiz, M.和Lefranc, M.-P., Immunogenetics,53,857-883(2002)/Kaas, Q.和 Lefranc, M.-P., CurrentBioinformatics, 2, 21-30 (2007) ], R IMGT/3D 結構-DB 的 3D 結構中[Kaas, Q.，Ruiz’M.和 Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data.Nucl.Acids.Res.,32,D208-D210(2004)]。存在三個重鏈⑶R和三個輕鏈⑶R。根據情況，在此使用的術語⑶R目的在于指示這些區域之一或幾個、或甚至這些區域的全部，其包含負責抗體對于其識別的抗原或表位的親和性結合的大多數氨基酸殘基。為了更清晰，應該理解下列說明中及更特別在表2和3中，以MGT編號系統和Kabat編號系統定義CDR。根據如上定義的MGT系統，以MGT編號系統定義⑶R，而根據如上定義的Kabat系統，以Kabat編號系統定義⑶R。更特別的是，關于被稱為515H7的抗體，⑶R-Ll由MGT編號系統中的SEQ ID N0.1和Kabat編號系統中的SEQ ID N0.9構成。關于CDR-L2，其由頂GT編號系統中的SEQ IDN0.2和Kabat編號系統中的SEQ ID N0.10構成。⑶R-L3由兩種編號系統中的每個的SEQID N0.3構成。對于重鏈，CDR-Hl由MGT編號系統中的SEQ ID N0.4和Kabat編號系統中的SEQ ID N0.11構成。CDR-H2由MGT編號系統中的SEQ ID N0.5和Kabat編號系統中的SEQ ID N0.12構成。最后，CDR-H3包括頂GT編號系統中的SEQ ID N0.6，而其由Kabat編號系統中的SEQ ID N0.13構成。然后，關于被稱為301aE5的抗體，⑶R-Ll由MGT編號系統中的SEQ ID N0.1和Kabat編號系統中的SEQ ID N0.9構成。關于CDR-L2，其由頂GT編號系統中的SEQ ID N0.2和Kabat編號系統中的SEQ ID N0.36構成。CDR-L3由頂GT編號系統中的SEQ ID N0.30和Kabat編號系統中的SEQ ID N0.37構成。對于重鏈，⑶R-Hl由MGT編號系統中的SEQID N0.31和Kabat編號系統中的SEQ ID N0.38構成。CDR-H2由MGT編號系統中的SEQID N0.32和Kabat編號系統中的SEQ ID N0.39構成。最后，CDR-H3包括MGT編號系統中的SEQ ID N0.33，而其由Kabat編號系統中的SEQ ID N0.40構成。在本發明的含義中，兩個核酸或氨基酸序列之間的“百分比同一性”意指待比較的兩條序列間相同核苷酸或氨基酸殘基的百分比，其在最佳比對后獲得，此百分比是純粹統計上的，兩條序列間的差異沿其長度隨機分布。兩條核酸或氨基酸序列的比較傳統上通過在對其最佳比對后比較序列來進行，所述比較能通過節段(segment)或通過使用“對比窗口”來執行。除了手動比較之外，通過Smith和Waterman的局部同源性算法(1981) [Ad.App.Math.2:482]、通過 Neddleman 和 Wunsch 的局部同源性算法(1970) [J.Mol.Biol.48:443]、通過 Pearson 和 Lipman 的相似性搜索法(1988) [Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:2444]或通過使用這些算法的計算機軟件(Wisconsin遺傳學軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遺傳學計算組，575Science Dr.，Madison, WI，或通過比較軟件 BLAST NR 或 BLASTP)可以進行待比較的序列的最佳比對。通過比較兩個最佳比對的序列確定兩個核酸或氨基酸序列之間的百分比同一性，其中待比較的核酸或氨基酸序列，相較于用于兩條序列間最佳比對的參考序列，可以有添加或刪除。通過確定兩條序列間(優選兩條完整序列間)相同氨基酸核苷酸或殘基的位點的數目計算百分比同一性，將相同位點數除以比對窗口的總位點數并將結果乘以100以獲得兩條序列間的百分比同一性。例如，可以用缺省參數使用(特別是參數“開放空位罰分”:5，和“延伸空位罰分”:2 ;所選矩陣是例如程序提出的“BL0SUM62”矩陣)在網頁http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html 上可用的 BLAST 程序,“BLAST2 序列，，(Tatusova 等人，“Blast2sequences_anew tool for comparing protein and nucleotide sequences”,FEMS Microbiol.,1999,Lett.174:247 - 250);直接用程序計算待比較的兩條序列之間的百分比同一性。對于顯示出與參考氨基酸序列有至少80%、優選85%、90%、95%和98%同一性的氨基酸序列，優選的實例包括包含參考序列、某些修飾(特別是刪除、插入或取代至少一個氨基酸、截短或延長)的那些。在一個或多個連續或不連續的氨基酸被取代的情況下，優選在取代中所取代的氨基酸被“等價”氨基酸所代替。在此，表達“等價氨基酸”意指可能取代一個結構氨基酸、而不改變相應抗體生物學活性的任意氨基酸，以及下面定義的那些具體實施例的任意氨基酸。可以根據其與它們所取代的氨基酸的結構同源性、或者根據可能生成的各種抗體間生物活性比較檢驗的結果來確定等價氨基酸。作為非限制性實例，下面表I總結了可能執行而不導致相應修飾的抗體生物活性顯著變化的可能取代；在同一條件下自然可以做相反的取代。表I
權利要求
1.一種分離的抗體、或其抗原結合片段或衍生物之一，其中，其包括至少一個互補決定區⑶R，所述互補決定區⑶R選自包括MGT編號系統所定義的氨基酸序列SEQ ID N0.1至6和30至33的CDR0
2.根據權利要求1所述的抗體、或其抗原結合片段或衍生物之一，其中其包括一條輕鏈和一條重鏈，所述輕鏈包括分別包括氨基酸序列SEQ ID N0.1、2和3的⑶R-Ll、⑶R-L2和⑶R-L3 ;所述重鏈包括分別包括氨基酸序列SEQ ID N0.4、5和6的⑶R-Hl、⑶R-H2和CDR-H3。
3.根據權利要求2所述的抗體、或其抗原結合片段或衍生物之一，其中其包括包括氨基酸序列SEQ ID N0.7的輕鏈和包括氨基酸序列SEQ ID N0.8的重鏈。
4.根據權利要求2所述的抗體、或其抗原結合片段或衍生物之一，其中其是嵌合抗體，而且其包括選自SEQ ID N0.56,57或58的序列的重鏈，及序列SEQ ID N0.59的輕鏈。
5.根據權利要求2所述的抗體、或其抗原結合片段或衍生物之一，其中，其是人源化抗體，而且其包括由SEQ ID N0.64組成的序列的重鏈可變區，及選自SEQ ID N0.65、66、82或83的序列的輕鏈可變區。
6.根據權利要求2所述的抗體、或其抗原結合片段或衍生物之一，其中，其是人源化抗體，而且其包括人源化抗體、或其衍生的化合物或功能性片段，其包括選自SEQ ID N0.67、68或69的序列的重鏈，及選自SEQ ID N0.70、71、84或85的序列的輕鏈。
7.根據權利要求2所述的抗體、或其抗原結合片段或衍生物之一，其中，所述功能性片段由片段Fv、scFv、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv_Fc、雙特異性抗體、或通過化學修飾而延長了半衰期的任意片段組成。
8.根據權利要求7所述的抗體、或其抗原結合片段或衍生物之一，其中，其是包括氨基酸序列 SEQ ID N0.54 的 ScFv0
9.根據權利要求1所述的抗體、或其抗原結合片段或衍生物之一，其中，其包括一條輕鏈和一條重鏈，所述輕鏈包括分別包括氨基酸序列SEQ ID N0.1、2和30的⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3 ;所述重鏈包括分別包括氨基酸序列SEQ ID N0.31、32和33的⑶R-Hl、⑶R-H2和 CDR-H3。
10.根據權利要求9所述的抗體、或其抗原結合片段或衍生物之一，其中，其包括包括氨基酸序列SEQ ID N0.34的輕鏈和包括氨基酸序列SEQ ID N0.35的重鏈。
11.一種分離的核酸，其中，其選自下列核酸: a)編碼如權利要求1至10中任一項所述的抗體或其抗原結合片段或衍生物的之一的核酸、DNA或RNA ； b)包括DNA序列的核酸，該DNA序列選自由SEQID N0.14至19和41至45組成的CDR序列； c)包括DNA序列的核酸，該DNA序列選自由SEQID N0.20、21、46、47、72、73、74、86和87組成的重鏈和輕鏈可變結構域序列； d)包括DNA序列的核酸，該DNA序列選自由SEQID N0.60至63、75至79、88和89組成的重鏈和輕鏈序列； e)包括由SEQID N0.55組成的DNA序列的核酸； f)如b)、c)、d)或e)中所限定的核酸的相應RNA核酸；g)如a)、b)、c)、d)和e)中所限定的核酸的互補核酸；及 h)至少18個核苷酸的核酸，其能夠在高嚴謹度條件下與SEQID N0.14至19和41至45序列的⑶R的至少一個雜交。
12.—種載體，其包括如權利要求11所要求的核酸。
13.—種宿主細胞，其包括如權利要求12所要求的載體。
14.一種除人以外的轉基因動物，其包括至少一個轉化有權利要求12所要求的載體的細胞。
15.一種用于生產如權利要求1至10的任一項所要求的抗體、或其抗原結合片段或衍生物之一的方法，其中所述方法包括下列階段: a)在基質中及合適的培養條件下培養如權利要求13所要求的細胞；及 b)從培養基質或所述培養細胞中回收由此產生的所述抗體、或其抗原結合片段或衍生物之一。
16.一種通過權利要求15所要求的方法可獲得的或獲得的抗體、或其功能性片段或衍生物之一。
17.作為藥物的根據權利要求1至10和16所述的抗體。
18.根據權利要求1 至10或16至17所述的抗體、或其功能性片段或衍生物之一，其中，其抑制HIV-1KON原代分離株在PBMC中的復制，其IC9tl為至少5 u g/ml，優選至少10 u g/ml o
19.一種組合物，其包括通過如權利要求1至10和16至18的任一項所要求的抗體、或其抗原結合片段或衍生物之一組成的化合物作為活性成分。
20.作為藥物的如權利要求19所要求的組合物。
21.根據權利要求19和20所要求的組合物，用于預防或用于治療HIV感染。
22.根據權利要求21所要求的組合物，其中所述HIV感染是X4向性HIV感染。
23.根據權利要求21所要求的組合物，其中所述HIV感染是X4/R5向性HIV感染。
24.根據權利要求19至23所述的組合物，其中，其包括選自能特異性抑制HIV進入和/或復制的化合物至少第二抗HIV化合物。
25.根據權利要求24所述的組合物，其中，所述至少第二抗HIV化合物選自抗逆轉錄病毒藥物如HIV蛋白酶抑制劑(PI )、核苷/核苷酸HIV逆轉錄酶抑制劑(NRTI/NtRTI )、非核苷HIV逆轉錄酶抑制劑(NNRTI )、HIV進入抑制劑、HIV整合酶抑制劑。
26.根據權利要求24或25所述的組合物，其中所述至少第二抗HIV化合物是抗CCR5化合物。
27.根據權利要求26所述的組合物，其中所述抗CCR5化合物是馬拉維諾。
28.用于篩選和/或鑒定作為CXCR4拮抗劑抗病毒試劑的分子的方法，包括步驟: a)選擇表達CXCR4的細胞， b)孵育所述細胞和權利要求1至10或16至18所述的抗體、或其抗原結合片段或衍生物之一，及 c)評估檢驗的分子抑制抗體、或其抗原結合片段或衍生物之一與CXCR4之間結合的能力，及 d)選擇能夠產生所述抑制的分子。
29.根據權利要求1至10和16任一項所述的抗體、或其抗原結合片段或衍生物之一，和/或根據權利要求19至27任一項所述的組合物在制備用于抑制HIV復制的藥物中的用途。
30.根據權利要求1至10和16任一項所述的抗體、或其抗原結合片段或衍生物之一，和/或根據權利要求19至27任一項所述的組合物在制備用于HIV疾病的預防或治療的藥物中的用途。
31.一種用于預防或治療HIV的方法，其中所述方法包括由向有需要的患者施用根據權利要求1至10和16任一項所述的抗體、或其抗原結合片段或衍生物之一，和/或根據權利要求19至27任一項所述的組合物組成的步驟。
32.根據權利要求31所述的方法，其中方法還包括由向所述患者施用抗CCR5化合物組成的步 驟。
全文摘要
本發明涉及能夠結合CXCR4、而且還能誘導CXCR4同源二聚體的構象改變，并能夠抑制HIV-1原代分離株在PBMC中復制的分離的抗體、或其衍生物或抗原結合片段。更特別地，本發明涉及特異于CXCR4蛋白的515H7和301aE5單克隆抗體，以及其用于治療HIV感染的用途。本發明還覆蓋包含這些抗體的藥物組合物以及用于選擇這些抗體的方法。
文檔編號C07K16/28GK103180342SQ201180052064
公開日2013年6月26日 申請日期2011年10月27日 優先權日2010年10月27日
發明者C·克林格-漢默 申請人:皮埃爾法布雷醫藥公司