新的抗原結合蛋白的制作方法

專利名稱：新的抗原結合蛋白的制作方法
技術領域：
本發明涉及與人MAGE-A3結合的抗原結合蛋白如抗體、編碼這種抗原結合蛋白的多核苷酸、所述抗原結合蛋白的診斷應用和制備方法。背景
“癌癥-睪丸”抗原在幾 種類型的腫瘤中表達，但它們在正常組織中的表達限于睪丸，睪丸不可以將抗原遞呈給T細胞，因為它們缺乏MHC(主要組織相容性復合體)I類分子的表達。因此，癌癥-睪丸抗原被認為是腫瘤特異性抗原，并且是腫瘤免疫治療的潛在目標。已知人MAGE-A3經常在各種人腫瘤中表達，包括黑色素瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、膀胱癌、頭頸癌、鱗狀食道癌和肝癌。MAGE-A3屬于MAGE-A亞家族，其包括11個已知成員(MAGEA 1_6和8_12)。盡管已經報道了其他“MAGE A”(黑色素瘤抗原家族A)基因(如MAGE A7、A13_15)，這些基因的表達模式提示它們是假基因(參見，例如，Chomez等，Cancer Research, 61:5544 (2001))。11個MAGE-A基因具有位于最后的外顯子中的它們的整個編碼序列。與MAGE-A3基因具有最高的序列相似性的MAGE-A基因是MAGE-A6，是99 %相同的，并且這兩個基因之間的差異位于最后的外顯子內。與MAGE-A3接下來最密切相關的兩個基因是MAGE-A2和MAGE-A12。在蛋白水平上，MAGE-A6與MAGE-A3具有95%的序列同一性，MAGE-A2與MAGE-A3具有84%的序列同一性，MAGE-A12與MAGE-A3具有85%的序列同一性。(

圖1)。MAGE-N是MAGE家族的新成員，是從由人肝細胞癌細胞系分離的mRNA鑒定的(Wu等，Chin.J.Cell Mol.1mmunol.18:270-4 (2002))。已經報道 MAGE-N 與肝細胞癌密切相關(Dong 等，Cancer Biol.Ther.3(9): 891-8 (2004)。在預測蛋白水平，MAGE-N 與MAGE-A3和MAGE-A6具有〈85%的序列相似性。MAGE-N可能是MAGE-A3、A12和Al的組合-其中MAGE-N的N-末端區域(氨基酸1-129)與MAGE-A3的N-末端區域具有99%同一性，MAGE-N的中央區域與MAGE-A12的中央區域相比差異一個氨基酸，MAGE-N的C-末端區域與MAGE-Al的C-末端區域是相同的。發明簡述
本發明提供與MAGE-A3和MAGE-A6特異性結合的抗原結合蛋白。本發明提供與MAGE-A3和MAGE-A6特異性結合但不與MAGE-A2或MAGE-A12結合或特異性結合的抗原結合蛋白。本發明提供與MAGE-A3特異性結合并包含選自SEQ ID NO: 52、58和64的CDRH3或其變體的抗原結合蛋白。本發明提供與MAGE-A3特異性結合并包含選自SEQ ID N0:55、61和67的⑶RL3或其變體的抗原結合蛋白。本發明還提供與MAGE-A3特異性結合的抗原結合蛋白，其包含:
⑴SEQ ID NO:47的重鏈可變區和/或SEQ ID N0:49的輕鏈可變區；或與SEQ IDNO: 47具有75%或更高序列同一性的變體重鏈可變區；或與SEQ ID NO: 49具有75%或更高序列同一性的輕鏈可變區；
(ii)SEQ ID NO:39的重鏈可變區和/或SEQ ID NO:41的輕鏈可變區；或與SEQ IDNO: 39具有75%或更高序列同一性的變體重鏈可變區；或與SEQ ID NO: 41具有75%或更高序列同一性的輕鏈可變區；或
(iii)SEQ ID NO: 43的重鏈可變區；和/或SEQ ID NO: 45的輕鏈可變區；或與SEQ IDNO: 43具有75%或更高序列同一性的變體重鏈可變區；或與SEQ ID NO: 45具有75%或更高序列同一性的輕鏈可變區。本發明還提供編 碼本文所定義的抗原結合蛋白的核酸分子。本發明還提供包含本文所定義的核酸分子的表達載體。本發明還提供包含本文所定義的表達載體的重組宿主細胞。本發明還提供用于生產本文所定義的抗原結合蛋白的方法，所述方法包括培養如上所定義的宿主細胞和回收抗原結合蛋白的步驟。本發明還提供通過使用MAGE-A3的分歧肽(divergent peptides)免疫而產生如本文所述的抗原結合蛋白的方法。本發明還提供使用如本文所述的抗原結合蛋白在人福爾馬林固定的石蠟包埋組織中檢測MAGE-A3和/或MAGE-A6的方法。本發明還提供使用如本文所述的抗原結合蛋白在人福爾馬林固定的石蠟包埋組織中檢測MAGE-N的方法。附圖簡述
圖1:AMAGE-A1、A2、A3、A4、A5、A6、A8、A9、A10、A11 和 A12 的序列比較。圖2:對應于MAGE-A3 (SEQ ID NO: 3)的氨基酸66-91的MAGE-A3片段的比較。肽MA3#3 (SEQ ID NO:37)中含有的氨基酸標有下劃線。圖3:對應于MAGE-A3 (SEQ ID NO: 3)的氨基酸137-180的MAGE-A3片段的比較。肽MA3#1 (SEQ ID NO: 35)和MA3#2 (SEQ ID NO: 36)中含有的氨基酸標有下劃線。圖4A:圖示在用三種與KLH綴合的MAGE-A3肽的混合物免疫的小鼠的血清中相對抗-MAGE-A3抗體滴度(方案IMM-134)。在ELISA中對全長重組MAGE-A3蛋白(血清稀釋度為 1:1000、1:5000、1:10，000、1:50，000、1:100，000、1:200，000 和 1:500, 000)檢測方案中包括的四只小鼠中每一只的免疫前血清(Pre)和血清稀釋度。以如免疫前(Pre)血清上的順序對于小鼠1、2、3和4給出每個稀釋度的結果。圖4B:圖示在用全長重組MAGE-A3蛋白免疫的小鼠的血清中相對抗-MAGE-A3抗體滴度(方案IMM-135)。在ELISA中對全長重組MAGE-A3蛋白(血清稀釋度為1:1000、1:5000、1:10，000、1:50，000、1:100，000、1:200，000 和 1:500，000)檢測方案中包括的四只小鼠中每一只的免疫前血清(Pre)和血清稀釋度。以如免疫前(Pre)血清上的順序對于小鼠1、2、3和4給出每個稀釋度的結果。圖5:表示免疫小鼠的血清的反應性和特異性。在ELISA中對全長重組MAGE-A3、A2和A12以及對三種與KLH綴合的MAGE-A3肽測試IMM-134的小鼠#4和IMM-135小鼠#1的血清(1:1000稀釋)。對于每份測試樣品，從左到右給出下述結果:MAGE-A3、MAGE-A2、MAGE-A12、肽 MA3#1、肽 MA3#2 和肽 MA3#3。圖6:顯示與重組MAGE-A3反應的克隆上清液的特異性分析。MAb IBl顯示在6A中，16G7和23D2顯示在圖6B中。對重組MAGE-A3, MAGE-A2和MAGE-A12蛋白和對三種與KLH綴合的MAGE-A3肽中每一種測試克隆。對于測試的每份上清液樣品，從左到右給出下述結果:MAGE-A3、MAGE-A2、MAGE-A12、肽 MA3#1、肽 MA3#2 和肽 MA3#3。“Neg”表示孔中沒有抗原的陰性對照。垂直軸是通過ELISA測量的光密度，代表克隆的分泌能力。圖7:圖示在亞克隆和使雜交瘤適應在標準培養基上生長后獲得的4種雜交瘤上清液的反應性的ELISA分析的結果。對重組MAGE-A3，MAGE-A2和MAGE-A12蛋白和對三種與KLH綴合的MAGE-A3肽中每種測試每種雜交瘤上清液。使用上清液57B作為陽性對照，單獨的山羊抗小鼠HRP(二級抗體)作為陰性對照。對于測試的每份上清液樣品，從左到右給出下述結果:肽 MA3#1、肽 MA3#2、肽 MA3#3、MAGE-A3、MAGE-A2 和 MAGE-A12。圖8 =ELISA分析結果的圖表,顯示了生物素化的mAb 23D2與0.1 μδ/孔的重組MAGE-A3蛋白的反應性。生物素化mAb的稀釋曲線表明，0.032 μ g/δθμ 的抗體稀釋物提供了在未飽和情況下的強信號。圖9:顯示生 物素化的mAb 23D2和漸增量的未標記的mAbs 1B1、16G7、mAb23D2(陽性對照)和M75(陰性對照)之間進行的競爭測定的結果。對于每個濃度的未標記的mAb (水平軸)，從左到右給出下述結果:23D2、16G7、1B1和M75。圖10:顯示使用檢測MAGE-A3/A6的mAb 23D2、檢測MAGE-A4的mAb 57b和檢測MAGE-A9的mAb 14A11的腫瘤樣品的IHC分析的表格。RT-PCR分析的結果顯示為-、+、++、+++o IHC 染色的結果顯不為 _、+、++、+++、++++,分別表明 O % > 1~24% >25~49% >50-74%和75-100%的細胞被染色。IHC強度的結果顯示為+(弱)、++(中度)和+++(強)；在一些組織樣品中觀察到兩種染色強度的組合。N.D.表明無法測定。RT-PCR和IHC結果之間的差異加框表不。圖11顯示抗-MAGE-A3單克隆抗體1B1、16G7和23D2的可變輕和重鏈的核苷酸序列。圖12顯示從抗-MAGE-A3單克隆抗體1B1、16G7和23D2的可變輕和重鏈的核苷酸序列獲得的氨基酸序列。CDR標有下劃線；構架區沒有標下劃線。發明詳述
GlaxoSmithKline Biologicals S.A.正在開發用于治療轉移性黑色素瘤和NSCLC的MAGE-A3抗原特異性癌癥免疫治療劑(ASCI)。該免疫治療劑組合(a)融合蛋白，其包含MAGE-A3的片段，與(b)佐劑系統，其是選擇用于增加抗腫瘤免疫反應的免疫刺激化合物的特定組合。(Brichard等.，Vaccine 25(增刊2):B61 (2007))。在登記進目前的臨床試驗中之前，篩選患者以確定他們是否具有表達MAGE-A3的腫瘤。目前，通過實時聚合酶鏈式反應(RT-PCR)進行腫瘤中MAGE-A3表達的分析。使用福爾馬林固定和石蠟包埋(FFPE)腫瘤組織(存檔組織塊)通過免疫組織化學(IHC)檢測需要對MAGE-A3特異性并且能夠檢測FFPE組織中抗原的可靠的單克隆抗體(mAb)。由于MAGE-A蛋白的高序列相似性，針對MAGE-A3的抗體可能與其他MAGE-A蛋白交叉反應。例如，Kocher等通過用重組MAGE-A3蛋白免疫小鼠產生了抗-MAGE-A3單克隆抗體(Kocher等Cancer Res, 55:2236, 1995.)。后來顯示產生的 mAb (稱為 57B)與 MAGE-A1、-A2、-A3、-A4、-A6 和-A12 交叉反應(Rimoldi等.1nt J Cancer, 86:749, 2000)。57B mAb與福爾馬林固定和石蠟包埋組織的反應性的進一步分析報道，它主要檢測MAGE-A4，因為它與表達其他MAGE-A抗原的組織無反應性，不論他們的表達水平(Landry 等 Int J Cancer, 86:835, 2000)。
抗-MAGE-A3mAb 6D10 (Abnova, GeneTex 和 Novus Biologicals)的特異性分析顯示，該mAb與MAGE-A2和MAGE-A6交叉反應(本申請人的未發表數據)。此外，在福爾馬林固定和石蠟包埋組織上的IHC(免疫組織化學)分析中使用該mAb是不成功的(本申請人的未發表數據)。已知另一種針對MAGE-A3/A6的mAb為mAb M3H67 (LICR New York,USA;參見例如 Sharma 等，Clinical Cancer Research 12:5442 (2006) ; Chitale 等，Modern Pathology 18:119 (2005))。已經將該抗體用于表征在福爾馬林固定和石臘包埋組織中MAGE-A3/A6的表達，但其特異性的分析還沒有公布(參見，例如，Chitale等.ModPathol, 18: 119，2005; Perez 等.Int J Cancer, 123: 1551，2008; Oba-Shinjo等.Cancer Immun, 8: 7, 2008; Nelson 等.Cancer Immun, 7:1, 2007 ; Luftl 等.BrJ Dermatol, 151: 1213, 2004; Lohmann,等.Melanoma Res, 13: 595, 2003;和Dhodapkar,等.Cancer Immun, 3: 9, 2003)。仍然需要mAb，其在 特異性識別高度相似的MAGE-A3和MAGE-A6蛋白的同時，不與密切相關的MAGE-A2或A12蛋白或任何其他已知的MAGE-A蛋白交叉反應。此外，還需要能夠在FFPE組織上可靠地檢測MAGE-A3和/或A6的這種抗體。本發明提供與MAGE-A3和MAGE-A6特異性結合的抗原結合蛋白。抗原結合蛋白可為抗體，例如單克隆抗體(mAb)。除非另有解釋，本文所用的所有技術和科學術語具有本發明所屬的領域中普通技術人員通常理解的含義。分子生物學中常用術語的定義可見Benjamin Lewin,Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew 等.(編輯),The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.出版,1994 (ISBN 0-632-02182-9);和 Robert A.Meyers (編輯)，Molecular Biology andBiotechnology:a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN1-56081-569-8)。單數術語“一(a)”、“一(an)”和“該(the) ”包括復數對象，除非上下文清楚地另有指明。類似地，詞語“或”意在包括“和”，除非上下文清楚地另有指明。術語“多個”是指兩個或更多個。應當進一步理解的是，對于核酸或多肽給出的所有分子量或分子質量值是近似的，提供用于說明。氨基酸在本文中縮寫如下:丙氨酸(Ala或A);精氨酸(Arg或R);天冬酰胺(Asn或N);天冬氨酸(Asp或D);半胱氨酸(Cys或C);谷氨酸(Glu或E );谷氨酰胺(Gln或Q);甘氨酸(Gly或G);組氨酸(His或H);異亮氨酸(lie或I);亮氨酸(Leu或L);賴氨酸(Lys或K)；甲硫氨酸(Met或M);苯丙氨酸(Phe或F);脯氨酸(Pro或P);絲氨酸(Ser或S);蘇氨酸(Thr或T);色氨酸(Trp或W);酪氨酸(Tyr或Y)和纈氨酸(Val或V)。本文所用術語"抗原結合蛋白"指能夠與MAGE-A3特異性結合的抗體、抗體片段和其他蛋白構建體，例如結構域或區域。本文所用術語"抗體"以其最廣泛的意義指具有免疫球蛋白樣結構域的分子，并包括:單克隆抗體、重組抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、雙特異性抗體和異源綴合物抗體；單可變結構域或區域、結構域抗體、抗原結合片段、免疫學有效片段、單鏈Fv、雙抗體、TANDABS 等(對于可替換的〃抗體〃形式的綜述,參見Holliger和Hudson, NatureBiotechnology, 2005，第 23 卷，第 9 期，1126-1136)。
本文所用修飾語“單克隆的”是指從抗體的基本上同質群體獲得的抗體，不表明該抗體是通過任何具體方法產生的。例如，可以通過雜交瘤方法(Kohler和Milstein,yVaiure256:495 (1975))，或通過重組DNA方法制備，或者從噬菌體文庫分離本發明的單克隆抗體(mAbs)ο根據由其分離它們的雜交瘤命名本發明的單克隆抗體，例如，mAb IBl是從雜交瘤細胞IBl獲得的。短語〃單可 變區〃指抗原結合蛋白可變區(例如VH、VHH、')，其可特異性結合抗原或結合獨立于不同的可變區的表位。可認為〃結構域抗體〃或"dAb"與〃單可變結構域〃相同，其能夠結合抗原。單可變結構域可為人抗體可變結構域，但還包括來自其他物種的單抗體可變結構域，例如嚙齒動物(例如如WO 00/29004中所公開的)、絞口鯊(nurse shark)和駱駝科{Camelid) VhhdAb。駱騎科Vhh為源自包括駱騎、美洲騎(llama)、羊騎(alpaca)、單峰駱騎(dromedary)和原騎(guanaco)在內的物種的免疫球蛋白單可變結構域多肽,所述物種產生天然缺乏輕鏈的重鏈抗體。這種Vhh結構域可根據本領域可獲得的標準技術人源化，認為這種結構域為〃結構域抗體"。本文所用Vh包括駱駝科Vhh結構域。 本文所用術語"結構域"指具有獨立于蛋白的其余部分的四級結構的折疊蛋白結構。結構域通常負責蛋白的不相關的功能性質，在很多情況下可將其加入、移走或轉移到其他蛋白，而不丟失蛋白和/或結構域的剩余部分的功能。"單可變結構域"(或“單可變區”)為包含抗體可變結構域特征序列的折疊多肽結構域。因此，其包括完全抗體可變結構域和經修飾的可變結構域，例如，其中一個或多個環被以下序列取代:所述序列不是抗體可變結構域的特征，或已經被截短或包含N-或C-末端延伸的抗體可變結構域，以及保留至少全長結構域的結合活性和特異性的可變結構域的折疊片段。結構域可結合抗原或結合獨立于不同的可變區或結構域的表位。本文所用“ MAGE-A ”是指從人MAGE-A獲得的或與人MAGE-A具有相同的序列的MAGE-A，除非另有說明。因此，本文所用MAGE-A3是指具有人MAGE-A3序列的多肽，除非另有說明。本發明人使用下列方案來產生單克隆抗體(在表I中顯示)。用分歧MAGE-A3肽的組合或用全長重組MAGE-A3免疫小鼠。使用酶聯免疫吸附測定(ELISA)測試來自免疫小鼠的血清針對全長重組MAGE-A3的反應性，以選擇用于在雜交瘤產生的動物。針對MAGE-A3篩選由獲得的雜交瘤產生的單克隆抗體，然后測試選擇的mAb針對MAGE-A3、MAGE-A12和MAGE-A2 ;和針對表達MAGE-A3的組織的反應性。可以使用該方案以產生與MAGE-A3和MAGE-A6特異性結合但不與MAGE-A2和/或MAGE-A12交叉反應的額外的mAb。可以任選地測試產生的mAb針對免疫中使用的肽的反應性。表I
權利要求
1.抗原結合蛋白，其與MAGE-A3和MAGE-A6特異性結合，但其不與MAGE-A2或MAGE-A12特異性結合。
2.抗原結合蛋白，其與MAGE-A3和MAGE-A6特異性結合，但其不與MAGE-A亞家族的任何其他成員特異性結合。
3.根據權利要求1所述的抗原結合蛋白，其包含具有選自SEQID NO:52, SEQ IDNO: 58、SEQ ID NO:64的氨基酸序列的⑶RH3。
4.根據權利要求3所述的抗原結合蛋白，其進一步包含選自如下的一個或多個或所有CDR:CDRH1 (SEQ ID NO:50)、CDRHl (SEQ ID NO:56)、CDRHl (SEQ ID NO:62)、CDRH2 (SEQID NO:51)、CDRH2 (SEQ ID NO:57),CDRHl (SEQ ID NO:63),CDRLl (SEQ ID NO:53),CDRLl(SEQ ID NO:59)、CDRLl (SEQ ID NO:65)、CDRL2 (SEQ ID NO:54)、CDRL2 (SEQ ID NO:60)、CDRL2 (SEQ ID NO:66)、CDRL3 (SEQ ID NO:55)、CDRL3 (SEQ ID NO:61)、CDRL3 (SEQ IDNO:67)。
5.根據前述權利要求中任一項所述的抗原結合蛋白，其中CDRHl是SEQID NO:50,CDRH2 是 SEQ ID NO: 51，并且 CDRH3 是 SEQ ID NO: 52。
6.根據前述權利要求中任一項所述的抗原結合蛋白，其中CDRHl是SEQID NO:56,CDRH2 是 SEQ ID NO: 57，并且 CDRH3 是 SEQ ID NO: 58。
7.根據前述權利要求中任一項所述的抗原結合蛋白，其中CDRHl是SEQID NO:62,CDRH2 是 SEQ ID NO:63，并且 CDRH3 是 SEQ ID NO:64。
8.根據前述權利要求中任一項所述的抗原結合蛋白，其中CDRLl是SEQID NO:53,CDRL2 是 SEQ ID NO: 54，并且 CDRL3 是 SEQ ID NO: 55。
9.根據前述權利要求中任一`項所述的抗原結合蛋白，其中CDRLl是SEQID NO:59,CDRL2 是 SEQ ID NO:60，并且 CDRL3 是 SEQ ID NO:61。
10.根據前述權利要求中任一項所述的抗原結合蛋白，其中⑶RLl是SEQID NO:65,CDRL2 是 SEQ ID NO:66，并且 CDRL3 是 SEQ ID NO:67。
11.根據前述權利要求中任一項所述的抗原結合蛋白，其進一步包含下列中的至少一個: (a)與SEQID NO:39的構架區具有75%或更高的序列同一性的重鏈可變區受體抗體構架； (b)與SEQID NO:43的構架區具有75%或更高的序列同一性的重鏈可變區受體抗體構架； (c)與SEQID NO:47的構架區具有75%或更高的序列同一性的重鏈可變區受體抗體構架； (d)與如SEQID N0:41中所示的構架區具有75%或更高的序列同一性的輕鏈可變結構域受體抗體構架； (e)與如SEQID NO:45中所示的構架區具有75%或更高的序列同一性的輕鏈可變結構域受體抗體構架；或 (e)與如SEQ ID N0:49中所示的構架區具有75%或更高的序列同一性的輕鏈可變結構域受體抗體構架。
12.根據權利要求1所述的抗原結合蛋白，其包含:(i)SEQ ID NO: 47的重鏈可變區或與SEQ ID NO: 47具有75%或更高的序列同一性的變體重鏈可變區，和SEQ ID NO: 49的輕 鏈可變區或與SEQ ID NO:49具有75%或更高的序列同一性的輕鏈可變區； (ii)SEQ ID NO: 39的重鏈可變區或與SEQ ID NO: 39具有75%或更高的序列同一性的變體重鏈可變區，和SEQ ID NO: 41的輕鏈可變區或與SEQ ID NO:41具有75%或更高的序列同一性的輕鏈可變區；或 (iii)SEQ ID NO: 43的重鏈可變區或與SEQ ID NO: 43具有75%或更高的序列同一性的變體重鏈可變區；和SEQ ID NO: 45的輕鏈可變區或與SEQ ID NO:45具有75%或更高的序列同一性的輕鏈可變區。
13.根據權利要求1所述的抗原結合蛋白，包含: (a)SEQ ID NO: 52 (GGNNGFAY)的CDRH3或具有在SEQ ID NO: 52的氨基酸殘基2處的Trp取代Gly的變體； (b)SEQ ID NO:50 (SDYVffN)的CDRHl或具有在SEQ ID NO:50的氨基酸殘基4處的Ala取代Val的變體；(c)SEQ ID NO: 51 (YIGHSGRTSY NPSLKS)的 CDRH2，或包含在 SEQ ID NO: 51 的第 2 個氨基酸殘基處的Met或Val取代He、在SEQ ID NO: 51的第4個氨基酸殘基處的Tyr取代His或在SEQ ID NO: 51的第10個氨基酸殘基處的Leu取代Tyr的變體；(d)SEQ ID NO: 53 (KSSQSLLNSG NQKNYLT)的 CDRLl，或包含在 SEQ ID NO: 53 的第 5個氨基酸殘基處的Asn、Asp、Thr或Glu取代Ser、在SEQ ID NO: 53的第7個氨基酸殘基處StJ Asp>Tyr>Val> IIe>Ser>Asn Phe、His、Gly 或 Thr 取代 Leu、在 SEQ ID NO:53 的第 14 個氨基酸殘基處的Ser、Thr、Lys或Gly取代Asn ;在SEQ ID NO: 53的第15個氨基酸殘基處的Phe、Asn、Ala、His、Ser或Arg取代Tyr ;或在SEQ ID NO: 53的第16個氨基酸殘基處的Met、Val、Ile或Phe取代Leu的變體；(e)SEQ ID NO:54 (WTSTRDS)的 CDRL2 ;和(f)SEQ ID NO: 55 (QNDYSYPPT)的 CDRL3，或包含在 SEQ ID NO: 55 的氨基酸殘基 I 處的Ser、Gly、Phe或Leu取代Gin、在SEQ ID NO: 55的氨基酸殘基2處的Gln或His取代Asn ;在 SEQ ID NO: 55 的氛基酸殘基 3 處的 Asn、Phe、Gly、Ser、Arg、His、Thr、Tyr 或 Val 取代 Asp、在 SEQ ID NO: 55 的氛基酸殘基 4 處的 Asn、Trp Thr、Ser、Arg、Gln、His、Ala 或 Asp取代Tyr;或在SEQ ID NO: 55的氨基酸殘基5處的Glu、Asn、Gly、His、Thr、Arg、Ala取代Ser、在 SEQ ID NO: 55 的氛基酸殘基 6 處的 Asp、Thr> Val、Leu、His、Asn、lie、Trp> Pro 或Ser取代Tyr ;或在SEQ ID NO: 55的氨基酸殘 基8處的Leu、Tyr、Arg、Ile、Trp或Phe取代Pro的變體； 所述抗原結合蛋白結合MAGE A3。
14.權利要求13的抗原結合蛋白，其包含:(a)SEQ ID NO:52 的 CDRH3 ；(b)SEQ ID NO:50 的 CDRHl ；(c)SEQ ID NO:51 的 CDRH2 ；(d)SEQ ID NO:53 的 CDRLl ；(e)SEQ ID NO:54 的 CDRL2 ；(f)SEQ ID NO:55 的 CDRL3 ； (g)重鏈構架，如SEQID NO:39中所述，包含第2個氨基酸殘基處的Val ;第20個氨基酸殘基處的Leu ;第22個氨基酸殘基處的Cys ;第24個氨基酸殘基處的Val ;第26個氨基酸殘基處的Gly ;第29個氨基酸殘基處的Ile ;第36個氨基酸殘基處的Trp ;第47個氨基酸殘基處的Trp或Tyr ;第48個氨基酸殘基處的Met ;第69個氨基酸殘基處的Ile或Met ;第71個氨基酸殘基處的Arg、Lys或Val ;第76個氨基酸殘基處的Asn ;第78個氨基酸殘基處的Phe ;第80個氨基酸殘基處的Leu ;或第92個氨基酸殘基處的Cys，其中氨基酸殘基使用Kabat方案編號；和 (h)輕鏈構架，如SEQID NO:41中所述，包含第2個氨基酸殘基處的Ile、Leu或Val ；第3個氨基酸殘基處的Val、Gin、Leu或Glu ;第4個氨基酸殘基處的Met或Leu ;第23個氨基酸殘基處的Cys ;第35個氨基酸殘基處的Trp ;第71個氨基酸殘基處的Tyr或Phe ;第88個氨基酸殘基處的Cys，或第98個氨基酸殘基處的Phe，其中氨基酸殘基使用Kabat方案編號; 并且其中所述抗原結合蛋白結合MAGE A3。
15.權利要求14的抗原結合蛋白，其中 (a)所述重鏈構架包含第2個氨基酸殘基處的Val;第20個氨基酸殘基處的Leu ;第22個氨基酸殘基處的Cys ;第24個氨基酸殘基處的Val ;第26個氨基酸殘基處的Gly ;第29個氨基酸殘基處的Ile ;第36個氨基酸殘基處的Trp ;第47個氨基酸殘基處的Trp ;第48個氨基酸殘基處的Met ;第69個氨基酸殘基處的Ile ;第71個氨基酸殘基處的Arg ’第76個氨基酸殘基處的Asn ;第78個氨基酸殘基處的Phe ;第80個氨基酸殘基處的Leu ;和第92個氨基酸殘基處的Cys ;其中氨基酸殘基使用Kabat方案編號；和 (b)所述輕鏈構架包含第2個氨基酸殘基處的Ile;第3個氨基酸殘基處的Val ;第4個氨基酸殘基處的Met ;第23個氨基酸殘基處的Cys ;第35個氨基酸殘基處的Trp ;第71個氨基酸殘基處的Phe ;第88個氨基酸殘基處的Cys，和第98個氨基酸殘基處的Phe，其中氨基酸殘基使用Kabat方案編號。
16.根據權利要求1所述的抗原結合蛋白，包含: (a)SEQ ID NO:58 (QDYFDY)的CDRH3或具有在SEQ ID NO:58的氨基酸殘基6處的His、Val、lie、Ser> Asp 或 Gly 取代 Tyr 的變體； (b)SEQ ID NO: 56 (TNAMS)的CDRHl，或具有在SEQ ID NO: 56的氨基酸殘基2處的lie、His、Tyr、Phe、Thr、Cys、Glue 或 Asp 取代 Asn ;在 SEQ ID NO: 56 的氨基酸殘基 3 處的Tyr、Trp、Gly、Thr、Leu 或 Val 取代 Ala ;在 SEQ ID NO: 56 的氨基酸殘基 4 處的 Ile、Val 或Trp取代Met ;或在SEQ ID NO: 56的氨基酸殘基5處的Hi S、Glu、Asn、Gin、Tyr或Thr取代Ser的變體；(c)SEQ ID NO: 57 (TITSGGGSTY YPVSVKG)的 CDRH2，或包含在 SEQ ID NO: 57 的第 I個氨基酸殘基處的Gly、Tyr、Phe、Ile、Glu或Val取代Thr;在SEQ ID NO: 57的第2個氨基酸殘基處的Leu、Val、Thr、Ser或Asn取代lie ^SEQ ID NO:57的第3個氨基酸殘基處的Ser、Phe、Trp或His取代Thr ;在SEQ ID NO: 57的第4個氨基酸殘基處的Asp、Ser或Asn取代Gly ;在SEQ ID NO: 57的第5個氨基酸殘基處的Ser取代Gly ;在SEQ ID NO: 57的第8個氨基酸殘基處的Tyr、Thr、Asn、Asp或Arg取代Ser ;或在SEQ ID NO: 57的第10個氨基酸殘基處的Gly、His、Phe、Asp或Asn取代Tyr的變體；(d)SEQ ID NO: 59 (RSSTGAVTST NYAN)的 CDRLl，或包含在 SEQ ID NO: 59 的第 6 個氨基酸殘基處Thr取代Ala;或在SEQ ID NO: 59的第12個氨基酸殘基處His取代Tyr的變體；(e)SEQ ID NO:60 (GTNNRAP)的 CDRL2 ;和(f)SEQ ID NO: 61 (ALffYSNHWV)的 CDRL3，或包含在 SEQ ID NO: 61 的氨基酸殘基 5 處Asn取代Ser ;或在SEQ ID NO:61的氨基酸殘基7處Leu取代His的變體； 所述抗原結合蛋白結合MAGE A3。
17.權利要求16的抗原結合蛋白，其包含:(a)SEQ ID NO:58 的 CDRH3 ；(b)SEQ ID NO:56 的 CDRHl ；(c)SEQ ID NO:57 的 CDRH2 ；(d)SEQ ID NO:59 的 CDRLl ；(e)SEQ ID NO:60 的 CDRL2 ；(f)SEQ ID NO:61 的 CDRL3 ； (g)重鏈構架，如SEQID NO:43中所述，包含第2個氨基酸殘基處的Val、Ile或Gly ;第4個氨基酸殘基處的Leu或Val ;第20個氨基酸殘基處的Leu、Ile、Met或Val ;第22個氨基酸殘基處的Cys ;第24個氨基酸殘基處的Thr、Ala、Val、Gly或Ser ;第26個氨基酸殘基處的Gly ;第29個氨基酸殘基處的lie、Phe、Leu或Ser ;第36個氨基酸殘基處的Trp ；第47個氨基酸殘基處的Trp ;第48個氨基酸殘基處的He、Met、Val或Leu ;第69個氨基酸殘基處的Ile、Leu、Phe、Met或Val ;第71個氨基酸殘基處的Arg ;第78個氨基酸殘基處的Ala、Leu Val、Tyr或Phe ;第80個氨基酸殘基處的Leu或Met ;第90個氨基酸殘基處的Tyr或Phe ;第92個氨基酸殘基處的Cys ;和第94個氨基酸殘基處的Arg、Lys> Gly、Ser、His或Asn，其中氨基酸殘基使用Kabat方案編號；和 (h)輕鏈構架，如SEQID NO:45中所述，包含第2個氨基酸殘基處的Ala或Gln ;第3個氨基酸殘基處的Val ;第4個氨基酸殘基處的Val ;第23個氨基酸殘基處的Cys ;第35個氨基酸殘基處的Trp ;第48個氨基酸殘基處的Ile ;第66個氨基酸殘基處的Leu ;第71個氨基酸殘基處的Ala ;第88個氨基酸殘基處的Cys，和第98個氨基酸殘基處的Phe，其中氨基酸殘基使用Kabat方案編號； 并且其中所述抗原結合蛋白結合MAGE A3。
18.權利要求17的抗原結合蛋白，其中 (a)所述重鏈構架包含第2個氨基酸殘基處的Val;第4個氨基酸殘基處的Val ;第20個氨基酸殘基處的Leu ;第22個氨基酸殘基處的Cys ;第24個氨基酸殘基處的Ala ;第26個氨基酸殘基處的Gly ;第29個氨基酸殘基處的Phe ;第36個氨基酸殘基處的Trp ;第47個氨基酸殘基處的Trp ;第48個氨基酸殘基處的Val ;第69個氨基酸殘基處的Ile ;第71個氨基酸殘基處的Arg ;第78個氨基酸殘基處的Leu ;第80個氨基酸殘基處的Leu ;第90個氨基酸殘基處的Tyr ;第92個氨基酸殘基處的Cys ;和第94個氨基酸殘基處的Arg ;其中氨基酸殘基使用Kabat方案編號；和 (b)所述輕鏈構架包含第2個氨基酸殘基處的Ala ;第3個氨基酸殘基處的Val ;第4個氨基酸殘基處的Val ;第23個氨基酸殘基處的Cys ;第35個氨基酸殘基處的Trp ;第48個氨基酸殘基處的Ile ;第66個氨基酸殘基處的Leu ;第71個氨基酸殘基處的Ala ;第88個氨基酸殘基處的Cys ;和第98個氨基酸殘基處的Phe，其中氨基酸殘基使用Kabat方案編號。
19.根據權利要求1所述的抗原結合蛋白，包含:(a)SEQ ID NO: 64 (GGGVLLRLPL FAY)的 CDRH3 或具有在 SEQ ID NO: 64 的氨基酸殘基13 處的 His、Val、lie、Ser、Asp 或 Gly 取代 Tyr 的變體； (b)SEQ ID NO: 62 (SYTMS)的CDRHl，或具有在SEQ ID NO: 62的氨基酸殘基2處的lie、His、Phe、Thr、Asn、Cys、Glu 或 Asp 取代 Tyr ;在 SEQ ID NO:62 的氨基酸殘基 3 處的Tyr、Ala、Trp、Gly、L eu 或 Val 取代 Thr ;在 SEQ ID NO:62 的氨基酸殘基 4 處的 He,Val 或Trp取代Met ;或在SEQ ID NO: 62的氨基酸殘基5處的Hi S、Glu、Asn、Gin、Tyr或Thr取代Ser的變體；(c)SEQ ID NO: 63 (TITSGGGSSY YPDSVKG)的 CDRH2，或包含在 SEQ ID NO: 63 的第 I個氨基酸殘基處的Gly、Tyr、Phe、Ile、Glu或Val取代Thr;在SEQ ID NO:63的第2個氨基酸殘基處的Leu、Val、Thr、Ser或Asn取代Ile ;在SEQ ID NO:63的第3個氨基酸殘基處的Ser、Phe、Trp或His取代Thr ;在SEQ ID NO: 63的第5個氨基酸殘基處的Asp、Ser或Asn取代Gly ;在SEQ ID NO:63的第6個氨基酸殘基處的Ser取代Gly ;在SEQ ID NO:63的第8個氨基酸殘基處的Tyr、Thr、Asn、Asp或Arg取代Ser ;或在SEQ ID NO:63的第10個氨基酸殘基處的Gly、His、Phe、Asp或Asn取代Tyr的變體；(d)SEQ ID NO: 65 (RSSTGAVTAS NYAN)的 CDRLl，或包含在 SEQ ID NO: 65 的第 6 個氨基酸殘基處Thr取代Ala;或在SEQ ID NO:65的第12個氨基酸殘基處His取代Tyr的變體； (e)SEQ ID NO:66 (GINNRAP)的CDRL2或在SEQ ID NO:66的第2個氨基酸殘基處具有Thr取代Ile的變體；(f)SEQ ID NO: 67 (ALffYNNHWV)的 CDRL3，或包含在 SEQ ID NO: 67 的氨基酸殘基 5 處Ser取代Asn ;或在SEQ ID NO:67的氨基酸殘基7處Leu取代His的變體； 所述抗原結合蛋白結合MAGE A3。
20.權利要求19的抗原結合蛋白，其包含:(a)SEQ ID NO:64 的 CDRH3 ；(b)SEQ ID NO:62 的 CDRHl ；(c)SEQ ID NO:63 的 CDRH2 ；(d)SEQ ID NO:65 的 CDRLl ；(e)SEQ ID NO:66 的 CDRL2 ；(f)SEQ ID NO:67 的 CDRL3 ； (g)重鏈構架，如SEQID NO:47中所述，包含第2個氨基酸殘基處的Val、Ile或Gly ;第4個氨基酸殘基處的Leu或Val ;第20個氨基酸殘基處的Leu、Ile、Met或Val ;第22個氨基酸殘基處的Cys ;第24個氨基酸殘基處的Thr、Ala、Val、Gly或Ser ;第26個氨基酸殘基處的Gly ;第29個氨基酸殘基處的lie、Phe、Leu或Ser ;第36個氨基酸殘基處的Trp ；第47個氨基酸殘基處的Trp ;第48個氨基酸殘基處的He、Met、Val或Leu ;第69個氨基酸殘基處的Ile、Leu、Phe、Met或Val ;第71個氨基酸殘基處的Arg ;第78個氨基酸殘基處的Ala、Leu Val、Tyr或Phe ;第80個氨基酸殘基處的Leu或Met ;第90個氨基酸殘基處的Tyr或Phe ;第92個氨基酸殘基處的Cys ;或第94個氨基酸殘基處的Arg、Lys> Gly、Ser、His或Asn，其中氨基酸殘基使用Kabat方案編號；和 (h)輕鏈構架，如SEQID NO:49中所述，包含第2個氨基酸殘基處的Ala或Gln ;第3個氨基酸殘基處的Val ;第4個氨基酸殘基處的Val ;第23個氨基酸殘基處的Cys ;第35個氨基酸殘基處的Trp ;第48個氨基酸殘基處的Ile ;第66個氨基酸殘基處的Leu ;第71個氨基酸殘基處的Ala ;第88個氨基酸殘基處的Cys，或第98個氨基酸殘基處的Phe，其中氨基酸殘基使用Kabat方案編號； 并且其中所述抗原結合蛋白結合MAGE A3。
21.權利要求20的抗原結合蛋白，其中 (a)所述重鏈構架包含第2個氨基酸殘基處的Val;第4個氨基酸殘基處的Leu ;第20個氨基酸殘基處的Val ;第22個氨基酸殘基處的Cys ;第24個氨基酸殘基處的Ala ;第26個氨基酸殘基處的Gly ;第29個氨基酸殘基處的Phe ;第36個氨基酸殘基處的Trp ;第47個氨基酸殘基處的Trp ;第48個氨基酸殘基處的Val ;第69個氨基酸殘基處的Ile ;第71個氨基酸殘基處的Arg ;第78個氨基酸殘基處的Leu ;第80個氨基酸殘基處的Leu ;第90個氨基酸殘基處的Tyr ;第92個氨基酸殘基處的Cys ;和第94個氨基酸殘基處的Ser ;其中氨基酸殘基使用Kabat方案編號；和 (b)所述輕鏈構架包含第2個氨基酸殘基處的Ala;第3個氨基酸殘基處的Val ;第4個氨基酸殘基處的Val ;第23個氨基酸殘基處的Cys ;第35個氨基酸殘基處的Trp ;第48個氨基酸殘基處的Ile ;第66個氨基酸殘基處的Leu ;第71個氨基酸殘基處的Ala ;第88個氨基酸殘基處的Cys，和第98個氨基酸殘基處的Phe，其中氨基酸殘基使用Kabat方案編號。
22.核酸分子，其編碼權利要求1-21中任一項定義的抗原結合蛋白。
23.根據權利要求22所述的核酸分子，其包含: (i)SEQ ID NO: 38的重鏈DNA序列或具有75%或更高同一性的變體重鏈； (ii)SEQ ID NO:42的重鏈DNA序列或具有75%或更高同一性的變體重鏈； (iii)SEQ ID NO:46的重鏈DNA序列或具有75%或更高同一性的變體重鏈； (iv)SEQ ID NO:40的輕鏈DNA序列或具有75%或更高同一性的變體輕鏈； (iv) SEQ ID NO:44的輕鏈DNA序列或具有75%或更高同一性的變體輕鏈；或 (iv)SEQ ID NO:48的輕鏈DNA序列或具有75%或更高同一性的變體輕鏈。
24.表達載體,包含如權利要求22-23中任一項定義的核酸分子。
25.重組宿主細胞，包含如權利要求24定義的表達載體。
26.用于生產抗原結合蛋白的方法，包括培養如權利要求25定義的宿主細胞和回收所述抗原結合蛋白的步驟。
27.在人福爾馬林固定石蠟包埋組織中檢測MAGE-A3和/或MAGE-A6的方法，包括使用如權利要求1-21中任一項定義的單克隆抗體在所述組織上進行酶聯免疫吸附測定。
28.根據權利要求27所述的方法，其中所述組織是腫瘤組織。
29.根據權利要求28所述的方法，其中所述腫瘤組織是黑素瘤或非小細胞肺癌。
全文摘要
本發明涉及與MAGE-A3結合的抗原結合蛋白如抗體、編碼這種抗原結合蛋白的多核苷酸、所述抗原結合蛋白的診斷應用和制備方法。
文檔編號C07K16/30GK103108887SQ201180045742
公開日2013年5月15日 申請日期2011年7月20日 優先權日2010年7月22日
發明者A.貝爾格倫, N.布萊斯, Y.弗拉代, R.M.帕爾曼捷, A.皮羅爾熱 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司