專利名稱：：作為lpa受體拮抗劑的吡唑并吡啶酮衍生物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及作為LPA受體拮抗劑起作用的新的吡唑并吡啶酮衍生物及其制備方法。先前技術溶血磷脂酸(LPA)為相對于主要的磷脂種類以低濃度存在于所有的真核組織和以較高濃度(亞微摩爾范圍)存在于血漿中的小的甘油磷脂(分子量:430-480Da)。在1996年，LPA的第一個高親和性、同源細胞表面受體被鑒定(LPAl)(I)。這迅速導致鑒定了兩種另外的密切相關的受體(LPA2和LPA3)，并且最近鑒定了兩種另外的稍微不同的受體(LPA4和LPA5)。全部5種受體為I型視紫紅質樣G蛋白偶聯受體(GPCRs)，這些受體在其組織分布和下游信號轉導通路方面存在不同(參見ChoiJffetal.,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.2010，50:157-186)。由于受體亞型、表達模式和效應器通路的這種非均勻性，LPA的效應為多樣化和廣泛的，調節許多生物學過程。關于這些生物學作用的大量信息源于遺傳缺失研究。迄今為止，基因敲除小鼠已被報道具有5種已知受體中的4種(LPA1-4)，以及主要的LPA生成酶，自毒素(autotaxin)(ATX)(2，3)。這些突變小鼠，除了新興類的化學工具，已將通過使用體外研究作出的觀察轉換為醫學相關背景。不稍稍提及結構類似的脂質1-磷酸鞘氨醇(SlP)就難以討論LPA。當其第一個同源受體(SlPl)在1998年被去孤兒化(deorphanized)時，SlP也被發現為細胞外的信號轉導脂質(4)。盡管它們代表不同的信號轉導系統，這兩種脂質之間的相似性擴展到其組織分布和濃度、其同源受體的同源性和效應器通路、及其廣泛范圍的生物學作用。然而，因為LPA和SlP信號轉導近年來已經變為這種熱門的研究領域，該綜述具體地講集中在LPA的生物學作用上。SlP信號轉導的全面綜述可見于其它文獻(5，6)。自從20世紀早期就已知溶血磷脂具有生物活性，但是這些作用長期被認為是質膜的非特異性洗滌劑樣破壞的結果。然而，這些研究在非常高的非生理濃度下進行。已知LPA在生理濃度下的效應經5種真正的高親和性同源受體(LPA1-LPA5)以及或許通過另外的最近提出的或仍未鑒定的受體介導(16-18)。LPAl為對LPA鑒定的第一個高親和性受體(I)(在16，17中綜述)。哺乳動物LPARl基因(人類染色體位點9q31.3)編碼由364個氨基酸組成具有7個假定的跨膜區(transmembranedomains)的約41-kDa蛋白。在小鼠，開放閱讀框在具有中斷跨膜區6的保守基因內區(與ZparJ和ZparJ共有)的5個外顯子中的2個上被編碼。可通過可供選擇的外顯子使用或剪接產生的/^ar7(mrecl.3)的一種報道的變體導致N末端的18-氨基酸缺失(19)。這種變體的生物學意義尚未建立。在成年小鼠觀察到的廣泛表達，至少明顯存在于腦、子宮、睪丸、肺、小腸、心臟、胃、腎、脾、胸腺、胎盤和骨骼肌中(20，21)。也在人類中廣泛表達(22)。Lparl的表達在胚胎發育期間受到更多的空間限制，但是在腦中富集(23)。特別是，正在發育的神經系統為Lparl表達的主要位點，其中其受到空間上和時間上的調節(在17，20中綜述)。在胚胎形成期間，中樞神經系統(CNS)表達局限于稱為腦室區(VZ)并且在包括腦膜的表面上的一層的新皮層的神經源性區域(I)。VZ在皮質神經發生的末端，剛出生之前消失，但是在出生后的腦中繼續表達,其中其在正在發育的白質神經纖維束(whitemattertracts)中存在的細胞中明顯并且與髓鞘形成一致(24)。原位雜交技術顯示在少突膠質細胞和施旺細胞(分別為CNS和外周神經系統的成髓鞘細胞)中表達(24，25)。LPAl結合并激活3種類型的G蛋白:Gai/o,Gα^/11和Gα12/13(26，27)。LPAl激活引起一系列的細胞反應:細胞增殖與存活、細胞遷移和細胞骨架變化；通過血清反應元件激活改變細胞-細胞接觸、Ca2+流動和腺苷酸環化酶抑制；和促分裂原活化蛋白激酶、磷脂酶C、Akt和Rho通路的激活(在16，17，20中綜述)。Lparl在小鼠的靶向斷裂顯示該受體的意料之外的體內功能(28)。LpaH-/-小鼠在混合(C57B1/6JX129)遺傳背景下顯示50%圍產期死亡率，并且在純粹的(C57B1/6J或Balb/cByJ)遺傳背景下進一步降低存活率(J.Chun,未發表的觀察結果)。存活者具有減小的體格大小、伴隨鈍化口鼻的顱面畸形和坐骨神經施旺細胞的凋亡增加(28，29)。歸因于嗅覺缺陷的缺陷乳兒很可能導致圍產期死亡率。小部分的胚胎具有露腦畸形Γ5%)或前額頭部出血Γ2.5%)。在胚胎成神經細胞和成纖維細胞喪失LPA反應證實的體內非冗余功能和作用(28，30)。另外，在初始序列的群體擴張期間(28)，Z/7ar7-/_次代品系自發產生，其稱為“M0laga變體”并且呈現更嚴重的大腦發育缺陷(31)。Lpar2由于其與的60%氨基酸相似性而自孤兒GPCR基因的GenBank搜索進行確認。社類，LPAR2(染色體位點19pl2)編碼具有348個殘基的預測的氨基酸序列的蛋白，得到39kDa的計算出的分子質量(32)。Lpar2的表達模式與的相比較在時空上相對受限(20，22)。在小鼠，Lpar2在腎臟、子宮和睪丸中高度表達和在肺部適度表達，并且在胃、脾臟、胸腺、腦和心臟發現表達水平較低(20)。ZparJ也在胚腦中表達`，但是在出生后一周內減少(20)。在人體組織中，在睪丸和白細胞中檢測到Lpar2的高度表達，在前列腺、脾臟、胸腺和胰腺中發現適度表達(22)。在癌細胞中，在幾種情況下已經報道了Lpar2的異常表達，提示LPA2的腫瘤促進作用。LPA2結合于異源三聚體G蛋白的Gαi/o、Ga11/q和Gα12/13家族。這些G蛋白通過包括與LPAl類似的Ras、促分裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇3激酶、Rac、磷脂酶C、二酰甘油和Rho的下游分子傳遞信號(28)。LPA2為真正的高親和性同源LPA受體(33)。LPA2信號轉導的激活通常與如細胞存活(34，35)和細胞遷移(36-38)這樣的過程有關。結果，LPA2信號轉導作為癌癥轉移的潛在因素出現(參見下文)(39-41)。有趣的是，幾份報告已經提供了LPA2信號轉導與其它通路相互作用的證據。例如，LPA2通過與局灶性粘附分子TRIP6相互作用促進細胞遷移(42，43)，并且幾種PDZ蛋白和鋅指蛋白也被報道直接與LPA2的羧基末端尾部相互作用(44)。另外，LPA2介導的信號轉導可提供對表皮生長因子誘導的胰腺癌細胞的遷移和通過Ga12/13/Rho通路的侵襲的抑制作用(45)。這些研究提供了LPA2信號轉導在經典的G蛋白信號級聯放大與其它信號轉導通路之間具有交叉調節作用以調節信號轉導的效率和特異性的證據。小鼠基因敲除研究證實，Lpar2-/~突變動物為能存活的，大致正常的和以正常孟德爾比率出生而沒有性別偏差的，但是突變體具有在Z/7ar7-/-突變體中存在的惡化的前額血腫(28,30)。另外,來自雙敲除突變株(double-nullmutants)的原代成纖維細胞和胚胎皮層細胞顯示對外源性LPA的反應大大減少(30，46)。Lpar3使用退化的PCR基克隆和同源性搜索作為孤兒GPCR基因被發現(47，48)。LPAR3(人類染色體位點1ρ22.3_p31.1)編碼與小鼠LPAl和LPA2氨基酸序列飛0%相同的"40-kDaGPCR。在人類心臟、睪丸、前列腺、胰腺、肺、卵巢和腦中已經觀察到Z/^似的表達(47，48)，并且在小鼠睪丸、腎臟、肺、小腸、心臟、胃、脾、腦和胸腺最豐富(20)。有趣的是，已經顯示，在鼠科動物子宮，mRNA專門在種植窗(windowofimplantation)的管腔子宮內膜上皮表達(49)，并且其表達受黃體酮和雌激素調節(50)。象LPAl和LPA2—樣，LPA3可與Gαi/o和Gag結合以介導LPA誘導的磷脂酶C激活、Ca2+移動、腺苷酸環化酶抑制和激活以及促分裂原活化蛋白激酶激活(27)。然而，LPA3不能與Gα12/13結合，并因此不在其中包含Gα12/13和Rho的神經元細胞中介導細胞變圓(27)。而且，LPA3不象LPAl和LPA2那樣對具有飽和酰基鏈的LPA種類有反應，但是對含有不飽和脂肪酸的2-酰基-LPA具有相對高的親和性(47，51)。小鼠為能存活的和大致正常的，但是雌性裸鼠在生殖系統中顯示突出的表型(49)(參見下文)。然而，盡管LPA3在前額皮質、海馬和扁桃腺中表達(47，48)，迄今為止尚未報道與神經系統中的LPA3喪失相關的表型。LPA4起初自表達序列標簽數據庫的分析被鑒定為假定的GPCR(52，53)，并且通過配體篩選發現為LPA的特異性受體(54)。LPA4在結構上不同于共享有顯著同源性的經典的LPA和SlP受體，并且與P2Y嘌呤受體更加密切相關。然而，其不對測試的任何核苷酸或核苷有反應(52，54)。在人類，LPAR4基因位于染色體X，ql3_q21.1區，并且含有具有42kDa的經計算的分子質量的、編碼370個氨基酸的1113個堿基對的無內含子(intronless)的開放閱讀框(52，53)。LPA4對18:1-LPA具有特異性的結合親和性，心/值為44.8nM，但是對其它溶血磷脂和相關脂質例如SlP和SPC沒有特異性的結合親和性(54)。LPA4更傾向于LPA的結構類似物，等級序列為18:1->18:0->16:0->14:0->1-烷基->1-鏈烯基-^^(54)。在用定量實時PCR檢查的16種人體組織當中，財mRNA被普遍表達，并且在卵巢中特別豐富(54)。在用蛋白質印跡(Northernblot)和實時PCR檢查的小鼠組織當中，Lpar4mRNA在心臟、皮膚、胸腺、卵巢、正在發育的腦和胚胎成纖維細胞中表達(3，55)。用原位雜交技術的整體裝置(Wholemount)檢測肢芽、體節、面部突起(facialprocesses)和正在發育的腦中的Lpar4mRNA(23)。在過度表達LPA4的細胞中，LPA通過Ga12/13和Rho/Rho-激酶通路引起形態變化例如細胞變圓和應力纖維形成(55，56)，如在表達LPA1-、LPA2-和LPA5-的細胞觀察到的那樣。另外，在表達LPA4的細胞觀察到Rho激酶介導的細胞聚集和N-鈣粘蛋白依賴的細胞粘附(56)。LPA通過Gas誘導細胞內cAMP積聚，和通過Ga^/11和Gai誘導Ca2+移動(55，56)。尤其是，對經典的LPA受體未報道Gas偶合。最近已經報道了缺乏LPA4的小鼠，盡管它們未呈現明顯異常(3)。然而，LPA4對細胞運動性具有抑制作用，在其細胞中{a)LPA4缺乏增強對成纖維細胞中LPA的遷移反應，和{b、LPA4的異源性表達抑制B103細胞的LPAl依賴的遷移和LPA-誘導的遷移及結腸癌細胞的侵襲(3)。最近，孤兒GPCR(GPR92)被鑒定為LPA受體并且重新命名為LPA5以反映這種特性(57，58)。人類似位于染色體12pl3.31，并且編碼由372個氨基酸組成的41kDa蛋白。象其它的LPA受體(LPA1-4)—樣，LPA5也屬于視紫紅質-GPCR家族，并且盡管結構上不同于LPA1-3，其與LPA4共有35%的同源性(58)。在鼠科動物組織例如胚腦、小腸、皮膚、脾臟、胃、胸腺、肺、心臟、肝臟和胚胎干細胞中廣泛表達(57，58)。LPA通過結合于Ga12/13在表達LPA5的細胞中誘導神經突收縮和應力纖維形成，并且通過激活Ga增加細胞內鈣水平(58)。此外，LPA在表達LPA5的細胞中增加cAMP水平和肌醇磷酸產生(57，58)。最近，兩種其它的脂質衍生的分子(焦磷酸法尼酯和花生四烯酸甘油OV-arachidonylglycin))被表征為LPA5配體(59)。在該項研究中,焦磷酸法尼酯激活Ga^/ll-和Gas_介導的信號轉導,而Ar-花生四烯酸甘油OV-arachidonylglycin)僅能夠激活Ga/11介導的信號轉導。已經表明，那些配體與LPA5的配體結合袋進行不同的相互作用(59)。然而，隨后的研究證實，LPA5為也可通過相對于18:1-LPA以高得多的濃度的焦磷酸法尼酯激活的真正的LPA受體，這留下了這些可供選擇的配體的生物相關性的懸而未決的問題(60,61)。最近，3種另外的孤兒GPCRs已被公布為新的假定的LPA受體:GPR87、P2Y5和P2Y10(62-64)。這些孤兒GPCRs中的每一種屬于嘌呤能受體(purinergicreceptor)P2Y家族，并且比LPA1-3與LPA4和LPA5更加密切相關。在這些當中，基于近來發表和未發表的數據，P2Y5有可能作為LPA6加入LPA受體家族。P2Y5被確定為人類毛發生長的關鍵介質，并且為罕見家族形式的人類脫發的因果基因出3，63a)，并且這種假定的LPA6的近來研究支持該受體通過異常高濃度的LPA激活[對于一些試驗EC50在低微摩爾范圍內(65)]。這表明P2Y5作為相對低親和性LPA受體的特性不同于LPA1-5(65)，可能需要不同的配體或其它解釋。GPR87和P2Y10被報道使用混雜的Gα16融合系統增加細胞內Ca2+移動(62，64)。P2Y10-Ga16也可通過SlP及LPA誘導Ca2+瞬變現象(EC50分別=53和130nM)(62)。需要更詳細的調查研究以證實這3個作為真正LPA受體的候選者。已經報道了非GPCRLPA受體，但是其確實性仍有待確定(66)。引用文獻:1.HechtJH,WeinerJA,PostSR,ChunJ.1996.腦室區基因-1(vzg_l)編碼在發育的腦皮質的神經原區域表達的溶血磷脂酸受體(Ventricularzonegene-1(vzg-1)encodesalysophosphatidicacidreceptorexpressedinneurogenicregionsofthedevelopingcerebralcortex).J.Cell.Biol.135:1071-832.ChoiJWjLeeCWjChunJ.2008.遺傳裸鼠顯示的溶血磷脂受體的生物學作用:最新進展(Biologicalrolesoflysophospholipidreceptorsrevealedbygeneticnullmice:anupdate).Biochim.Biophys.Acta1781:531-393.LeeZ，ChengCTjZhangH，SublerMAjWuJ，etal.2008.LPA4/p2y9/GPR23在細胞運動的負性調節中的作用(RoleofLPA4/p2y9/GPR23innegativeregulationofcellmotility).MoLBiol.Cell.19:5435-454.LeeM，VanBrooklynJ，ThangadaS，LiuC，HandA，etal.1998.作為G蛋白-偶合受體EDG-1的配體的1-憐酸鞘氨醇(Sphingosine-l-phosphateasaligandfortheGprotein-coupledreceptorEDG-1).Science279:1552-555.SpiegelS，MilstienS.2003.1_磷酸鞘氨醇:一種難以探測的信號轉導脂質(Sphingosine-l-phosphate:anenigmaticsignallingLipid).Nat.Rev.MoLCell.BioL4:397-4076.ChunJ，RosenH.2006.作為組織移植和自身免疫性疾病的潛在性藥物靶標的溶血憐月旨(Lysophospholipidreceptorsaspotentialdrugtargetsintissuetransplantationandautoimmunediseases).Curr.Pharm.Des.12:161-717.AokiJ.2004.溶血憐脂酸產生的機理(Mechanismsoflysophosphatidicacidproduction).Semin.Cell.Dev.Biol.15:477-898.SugiuraT，NakaneS，KishimotoS，WakuK，YoshiokaY，etal.1999.溶血磷脂酸及其烷基醚-連接的類似物在大鼠腦中的存在和它們對培養的神經元細胞的生物活性的比^較(Occurrenceoflysophosphatidicacidanditsalkylether-linkedanaloginratbrainandcomparisonoftheirbiologicalactivitiestowardculturedneuralcells).Biochim.Biophys.Acta1440:194-2049.SanoT，BakerD，ViragT，WadaA，YatomiY，etal.2002.與血小板激活有關的多重機制導致血液中的溶血磷脂酸和1-磷酸鞘氨醇生成(Multiplemechanismslinkedtoplateletactivationresultinlysophosphatidicacidandsphingosine1-phosphategenerationinblood).J.Biol.Chem.277:21197-20610.Umezu-GotoM，KishiY，TairaA，HamaK，DohmaeN，etal.2002.自毒素具有由溶血磷脂酸產生的導致腫瘤細胞生長和迀移的溶血磷脂酶活性(AutotaxinhaslysophospholipaseDactivityleadingtotumorcellgrowthandmotilitybylysophosphatidicacidproduction).J.Cell.BioL158:227-3311.TokumuraA，MajimaE，KariyaY，TominagaK，KogureK，etal.2002.人血漿溶血磷脂酶D，一種產生溶血磷脂酸的酶作為自毒素(一種多功能磷酸二酯酶)的鑒定(IdentificationofhumanplasmalysophospholipaseD，alysophosphatidicacid-producingenzyme,asautotaxin,amultifunctionalphosphodiesterase).J.BioLChem.277:39436—4212.StrackeML,KrutzschHCjUnsworthEJjArestadA，CioceV，etal.1992.自毒素，一種新的移動-剌激蛋白的鑒定、純化和部分序列分析(Identification，purification，andpartialsequenceanalysisofautotaxin,anovelmotility-stimulatingprotein).J.Biol.Chem.267:2524-2913.MurataJ，LeeHYjClairT，KrutzschHCjArestadAAjetal.1994.人腫瘤迀移-剌激蛋白，自毒素的cDNA克隆揭示與磷酸二酯酶的同源性(cDNAcloningofthehumantumormotility-stimulatingprotein,autotaxin,revealsahomologywithphosphodiesterases).J.BioLChem.269:30479-8414.vanMeeterenLA,RuursP，StortelersC，BouwmanP，vanRooijenMAjetal.2006.自毒素，一種分泌的溶血磷脂酶D，對發育期間血管形成是必要的(Autotaxin，asecretedlysophospholipaseD，isessentialforbloodvesselformationduringdevelopment).MoLCell.BioL26:5015-2215.TanakaM，OkudairaS，KishiY，OhkawaR，IsekiS，etal.2006.自毒素通過產生溶血磷脂酸穩定血管并且為胚胎脈管系統形成所必需(Autotaxinstabilizesbloodvesselsandisrequiredforembryonicvasculaturebyproducinglysophosphatidicacid).J.Biol.Chem.281:25822-3016.FukushimaN，IshiiI，ContosJJjWeinerJAjChunJ.2001.溶血憐脂受體(Lysophospholipidreceptors).Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.41:507-3417.1shiiI，FukushimaN，YeX，ChunJ.2004.溶血憐脂受體:信號傳導和生物學(Lysophospholipidreceptors:signalingandbiology).Annu.Rev.Biochem.73:321-5418.ChunJ.2007.溶血憐脂如何得到其受體(Howthelysophospholipidgotitsreceptor).Scientist21:48-5419.ContosJJjChunJ.1998.LPA受體基因的完整cDNA序列、基因組結構和染色體定位(CompletecDNAsequence,genomicstructure,andchromosomallocalizationoftheLPAreceptorgene),lpAl/vzg-l/Gpcr26.Genomics51:364-7820.ContosJJjIshiiI，ChunJ.2000.溶血憐脂酸受體(Lysophosphatidicacidreceptors).MoLPharmacol.58:1188-921.YeX.2008.生殖系統的功能和病理學中的溶血磷脂信號傳導(Lysophospholipidsignalinginthefunctionandpathologyofthereproductivesystem).Hum.Reprod.Update14:519-3622.AnSjBleuT，HallmarkOGjGoetzlEJ.1998.對溶血磷脂酸的人G-蛋白偶聯受體的新亞型的特征鑒定(CharacterizationofanovelsubtypeofhumanG-protein-coupledreceptorforlysophosphatidicacid).J.Biol.Chem.273:7906-1023.0huchiH，HamadaA，MatsudaH，TakagiA，TanakaM，etal.2008.溶血憐脂受體基因的表達圖譜(Expressionpatternsofthelysophospholipidreceptorgenesduringmouseearlydevelopment).Dev.Dyn.237:3280-9424.WeinerJAjHechtJHjChunJ.1998.溶血憐脂酸受體基因vzg-l/lpAl/edg-2通過在產后鼠科動物腦中的成熟少突神經膠質細胞表達(Lysophosphatidicacidreceptorgenevzg-l/lpAl/edg-2isexpressedbymatureoligodendrocytesduringmyelinationinthepostnatalmurinebrain).J.Comp.Neurol.398:587-9825.WeinerJAjChunJ.1999.由發送信號的磷脂溶血磷脂酸介導的施旺細胞存活(Schwanncellsurvivalmediatedbythesignalingphospholipidlysophosphatidicacid).Proc.Natl.Acad.ScLUSA96:5233-3826.FukushimaN，KimuraY，ChunJ.1998.由vzg-l/lpAl/edg-2編碼的信號受體偶聯至G蛋白并介導對溶血磷脂酸的多細胞響應(Asinglereceptorencodedbyvzg-1/IpAl/edg-2couplestoGproteinsandmediatesmultiplecellularresponsestolysophosphatidicacid).Proc.Natl.Acad.ScLUSA95:6151-5627.1shiiI，ContosJJjFukushimaN，ChunJ.2000.使用逆轉錄病毒表達系統對神經元細胞系中的溶血磷脂酸受體，LP(Al)/VZG-l/EDG-2、LP(A2)/EDG-4和LP(A3)/EDG-7進行功會泛t匕較(Functionalcomparisonsofthelysophosphatidicacidreceptors,LP(Al)/VZG-l/EDG-2,LP(A2)/EDG-4，andLP(A3)/EDG-7inneuronalcelllinesusingaretrovirusexpressionsystem).MoLPharmacol.58:895-90228.ContosJJjFukushimaN，WeinerJAjKaushalD，ChunJ.2000.正常乳兒行為中IpAl溶血磷脂酸受體基因的必要條件(RequirementfortheIpAllysophosphatidicacidreceptorgeneinnormalsucklingbehavior).Proc.Natl.Acad.Sc!.USA97:13384-8929.WeinerJAjFukushimaN，ContosJJjSchererSSjChunJ.2001.由受體-介導的溶血磷脂酸對施旺細胞形態學和粘附的調節(RegulationofSchwanncellmorphologyandadhesionbyreceptor-mediatedlysophosphatidicacidsignaling).J.NeuroscL21:7069-7830.ContosJJjIshiiI，FukushimaN，KingsburyMAjYeX，etal.2002.1pa(2)(Edg4)和lpa(l)/lpa(2)(Edg2/Edg4)溶血磷脂酸受體敲除小鼠的特征:信號傳導缺乏且無歸因于lpa(2)的明顯表型異常(CharacterizationofIpa(2)(Edg4)andlpa(l)/Ipa(2)(Edg2/Edg4)lysophosphatidicacidreceptorknockoutmice:signalingdeficitswithoutobviousphenotypicabnormalityattributabletoIpa(2)).MoLCell.BioL22:6921-2931.Estivill-TorrusG，Llebrez-ZayasP，Matas-RicoE，SantinL，PedrazaC，etal.2008.LPAl信號傳導的缺乏導致有缺陷的皮層發育(AbsenceofLPAlsignalingresultsindefectivecorticaldevelopment).Cereb.Cortex18:938-5032.ContosJJjChunJ.2000.溶血磷脂酸受體基因Ip(A2)/Edg4的基因組表征和先前鑒定的cDNA中移碼突變的鑒定(Genomiccharacterizationofthelysophosphatidicacidreceptorgene,lp(A2)/Edg4，andidentificationofaframeshiftmutationinapreviouslycharacterizedcDNA).Genomics64:155-6933.BandohK，AokiJ，TairaA，TsujimotoM，AraiH，etal.2000.EDG家族的溶血磷脂酸(LPA)受體受LPA種類的不同的激活，克隆的LPA種類的構效關系(Lysophosphatidicacid(LPA)receptorsoftheEDGfamilyaredifferentiallyactivatedbyLPAspecies.Structure-activityrelationshipofclonedLPAreceptors).FEBSLett.478:159-6534.GoetzlEJjKongY，MeiB.1999.與Bax抑制相關的細胞凋亡的T細胞的溶血憐脂酸和1-憐酸鞘氨醇的保護作用(Lysophosphatidicacidandsphingosine1-phosphateprotectionofTcellsfromapoptosisinassociationwithsuppressionofBax).J.1mmunol.162:2049-5635.DengWjBalazsL，WangDAjVanMiddlesworthL，TigyiG，etal.2002.溶血磷脂酸保護和救護受輻射-和化療-誘導的細胞凋亡的小腸上皮細胞(Lysophosphatidicacidprotectsandrescuesintestinalepithelialcellsfromradiation-andchemotherapy-1nducedapoptosis).Gastroenterology123:206-1636.ZhengY，KongY，GoetzlEJ.2001.溶血磷脂酸受體-對JurkatT細胞迀移通過Matrigel模型基膜的作用(Lysophosphatidicacidreceptor-selectiveeffectsonJurkatTcellmigrationthroughaMatrigelmodelbasementmembrane).J.Immunol.166:2317-2237.ZhengY，VoiceJKjKongY，GoetzlEJ.2000.溶血磷脂酸受體在有絲分裂原-激活的人血T淋巴細胞中的改變的表達和功能特性(Alteredexpressionandfunctionalprofileoflysophosphatidicacidreceptorsinmitogen-activatedhumanbloodTlymphocytes).FASEBJ.14:2387-8938.PanchatcharamM，MiriyalaS，YangF，RojasM，EndC，etal.2008.溶血磷脂酸受體I和2在血管損傷應答中起作用，但對血壓無作用(LysophosphatidicacidreceptorsIand2playrolesinregulationofvascularinjuryresponsesbutnotbloodpressure).Circ.Res.103:662-7039.YunCCjSunH，WangD，RusoviciR，CastleberryA，etal.2005.LPA2受體介導人結腸癌細胞中的促有絲分裂信號(LPA2receptormediatesmitogenicsignalsinhumancoloncancercells).Am.J.Physiol.Cell.Physiol.289:C2_1140.YuSjMurphMM，LuY，LiuS，HallHS，etal.2008.溶血磷脂酸受體確定卵巢癌細胞的致腫瘤性和侵襲性(Lysophosphatidicacidreceptorsdeterminetumorigenicityandaggressivenessofovariancancercells).J.Natl.CancerInst.100:1630-4241.ChenM，TowersLNj0’ConnorKL2007.LPA2(EDG4)在乳腺癌細胞中以低于LPAl(EDG2)的效果介導Rho-依賴性趨化性(LPA2(EDG4)mediatesRho-dependentchemotaxiswithlowerefficacythanLPAl(EDG2)inbreastcarcinomacells).Am.J.Physiol.Cell.Physiol.292:C1927_3342.LaiYJjChenCS，LinWCjLinFT.2005.c-Src-mediatedTRIP6的磷酸化調節其在溶血磷脂酸-誘導的細胞迀移中的功能(phosphorylationofTRIP6regulatesitsfunctioninlysophosphatidicacid-1nducedcellmigration).MoLCell.Biol.25:5859-6843.LaiYJjLinWCjLinFT.2007.PTPL1/FAP-1負性調節溶血磷脂酸-誘導的細胞遷移中的TRIP6功能(PTPL1/FAP-1negativelyregulatesTRIP6functioninlysophosphatidicacid-1nducedcellmigration).J.Biol.Chem.282:24381-8744.LinFT,LaiYJ.2008.LPA2受體信號傳導通過羧基-末端尾介導的蛋白-蛋白相互作用的調節(RegulationoftheLPA2receptorsignalingthroughthecarboxyl-terminaltailmediatedprotein-proteininteractions).Biochim.Biophys.Acta1781:558-6245.KomachiM，TomuraH，MalchinkhuuE，ToboM，MogiC，etal.2009.LPAl受體介導剌激，而LPA2受體介導介導抑制響應于溶血磷脂酸和惡性腹水的胰腺癌細胞迀移(LPAIreceptorsmediatestimulation,whereasLPA2receptorsmediateinhibition,ofmigrationofpancreaticcancercellsinresponsetolysophosphatidicacidandmalignantascites).Carcinogenesis30:457-6546.KingsburyMAjRehenSKjContosJJjHigginsCM，ChunJ.2003.溶血憐脂酸促進皮質生長和折疊的非增殖作用(Non-proliferativeeffectsoflysophosphatidicacidenhancecorticalgrowthandfolding).Nat.NeuroscL6:1292-9947.BandohK，AokiJ，HosonoH，KobayashiS，KobayashiT，etal.1999.新的人G-蛋白-偶聯受體EDG7對溶血磷脂酸的分子克隆和特征鑒定(MolecularcloningandcharacterizationofanovelhumanG-protein-coupledreceptor,EDG7，forlysophosphatidicacid).J.Biol.Chem.274:27776-8548.1mDSjHeiseCE，HardingMAjGeorgeSR，0，DowdBFjetal.2000.在前列腺中表達的溶血磷脂酸受體Edg-7的分子克隆和特征鑒定(Molecularcloningandcharacterizationofalysophosphatidicacidreceptor,Edg-7,expressedinprostate).MoLPharmacol.57:753-5949.YeX，HamaK，ContosJJjAnlikerB，InoueA，etal.2005.在胚胎植入和定位中LPA3-介導的溶血憐脂酸信號傳導(LPA3_mediatedlysophosphatidicacidsignallinginembryoimplantationandspacing).Nature435:104-850.HamaK，AokiJ，BandohK，InoueA，EndoT，etal.2006.溶血憐脂酸受體LPA3受小鼠子宮孕酮和雌激素的正性和負性調節(Lysophosphatidicreceptor,LPA3，ispositivelyandnegativelyregulatedbyprogesteroneandestrogeninthemouseuterus).LifeScL79:1736-4051.SonodaH，AokiJ，HiramatsuT，IshidaM，BandohK，etal.2002.一種產生溶血磷脂酸的新的磷脂酸-選擇性磷脂酶Al(Anovelphosphatidicacid-selectivephospholipaseAlthatproduceslysophosphatidicacid).J.Biol.Chem.277:34254-6352.JanssensR，BoeynaemsJMjGodartM，CommuniD.1997.與P2Y5受體密切相關的人的七螺旋受體的克隆(CloningofahumanheptahelicalreceptorcloselyrelatedtotheP2Y5receptor).Biochem.Biophys.Res.Conmun.236:106-1253.0，DowdBFjNguyenT，JungBPjMarcheseA，ChengR，etal.1997.四種假定的新的人G-蛋白-偶聯受體基因的克隆和染色體繪圖(CloningandchromosomalmappingoffourputativenovelhumanG-protein-coupledreceptorgenes).Gene187:75-8154.NoguchiK，IshiiS，ShimizuT.2003.p2y9/GPR23作為新的人G-蛋白-偶聯受體對溶血磷脂酸(結構上與Edg家族相差甚遠)的鑒定(Identificationofp2y9/GPR23asanovelGprotein-coupledreceptorforlysophosphatidicacid,structurallydistantfromtheEdgfamily).J.Biol.Chem.278:25600-655.LeeCWjRiveraR，DubinAEjChunJ.2007.LPA(4)/GPR23為使用G(s)-，G(q)/G(i)_介導的鈣信號傳導和G(12/13)_介導的Rho激活的溶血磷脂酸(LPA)受體(LPA(4)/GPR23isalysophosphatidicacid(LPA)receptorutilizingG(s)-，G(q)/G(i)-mediatedcalciumsignalingandG(12/13)-mediatedRhoactivation).J.Biol.Chem.282:4310-1756.YanagidaK，IshiiS，HamanoF，NoguchiK，ShimizuT.2007.LPA4/p2y9/GPR23在大鼠神經元細胞系中介導的riio-依賴性形態學變化(LPA4/p2y9/GPR23mediatesrho-dependentmorphologicalchangesinaratneuronalcellline).J.Biol.Chem.282:5814-2457.KotarskyK，BoketoftA，BristulfJ，NilssonNE，NorbergA，etal.2006.溶血磷脂酸結合于并激活GPR92，一種在胃腸道淋巴細胞中高度表達的G-蛋白-偶聯受體(LysophosphatidicacidbindstoandactivatesGPR92，aGprotein-coupledreceptorhighlyexpressedingastrointestinallymphocytes).J.Pharmacol.Exp.Ther.318:619-2858.LeeCWjRiveraR，GardellS，DubinAEjChunJ.2006.GPR92作為一種新的增加cAMP，LPA5的G12/13-和Gq-偶聯溶血磷脂酸受體(GPR92asanewG12/13-andGq-coupledlysophosphatidicacidreceptorthatincreasescAMP，LPA5).J.Biol.Chem.281:23589-9759.0hDY，YoonJMjMoonMJjHwangJIjChoeH，etal.2008.法呢基焦磷酸鹽和N-花生四烯酸甘油酯作為內源性配體用于GPR92的鑒定(IdentificationoffarnesylpyrophosphateandN-arachidonyIglycineasendogenousligandsforGPR92).J.BioLChem.283:21054-6460.WilliamsJRjKhandogaAL，GoyalP，FellsJIjPeryginDHjetal.2009.GPR92/LPA5溶血磷脂酸受體的獨特配體選擇性表明在人血小板激活中的作用(UniqueligandselectivityoftheGPR92/LPA5lysophosphatidatereceptorindicatesroleinhumanplateletactivation).J.Biol.Chem.284:17304-1961.YinHjChuA，LiWjWangB，SheltonF，etal.2009.使用抑制蛋白PathHunterTM分析法對脂質G-蛋白-偶聯受體配體的鑒定(LipidGprotein-coupledreceptorligandidentificationusing/betaZ-arrestinPathHunterTMassay).J.BioLChem.284:12328—3862.MurakamiM，ShiraishiA，TabataK，FujitaN.2008.孤兒GPCR，P2Y(10)受體作為1-磷酸鞘氨醇和溶血磷脂酸受體的鑒定(IdentificationoftheorphanGPCR,P2Y(10)receptorasthesphingosine-l-phosphateandlysophosphatidicacidreceptor).Biochem.Biophys.Res.Conmun.371:707-1263.PasternackSM，vonKugelgenI，AboudKAjLeeYAjRuschendorfF，etal.2008.G-蛋白-偶聯受體P2Y5及其配體LPA涉及人毛發生長的維持(Gprotein-coupledreceptorP2Y5anditsligandLPAareinvolvedinmaintenanceofhumanhairgrowth).Nat.Genet.40:329-3463a.ShimomuraY，WajidM，IshiiY，ShapiroL，PetukhovaL，etal.2008.P2RY5，一種孤兒G-蛋白-偶聯受體的裂解為常染色體隱形毛發的基礎(DisruptionofP2RY5，anorphanGprotein-coupledreceptor,underliesautosomalrecessivewoollyhair).Nat.Genet.40:335—3964.TabataK，BabaK，ShiraishiA，ItoM，FujitaN.2007.孤兒GPCRGPR87去孤兒化并表現出為溶血憐脂酸受體(TheorphanGPCRGPR87wasdeorphanizedandshowntobealysophosphatidicacidreceptor).Biochem.Biophys.Res.Conmun.363:861-6665.YanagidaK，MasagoK，NakanishiH，KiharaY，HamanoF，etal.2009.—種新的溶血磷脂酸受體p2y5/LPA6的鑒定和表征(Identificationandcharacterizationofanovellysophosphatidicacidreceptor,p2y5/LPA6).J.Biol.Chem.284:17731-4166.McIntyreTM,PontslerAV,SilvaAR,StHilaireA,XuY,etal.2003.溶血磷脂酸(LPA)的細胞內受體的鑒定:LPA為一種跨細胞PPARy激動劑的鑒定(Identificationofanintracellularreceptorforlysophosphatidicacid(LPA):LPAisatranscellularPPARgammaagonist).Proc.Natl.Acad.Sc1.USA100:131-36其它先前技術如下:BalickiR(PolishJournalofChemistry1983,57:789-797)涉及4，4，4-三氟乙酰乙酸乙酯與氨基吡唑的異常環化縮合反應。該科學論文公開了本發明的化合物2(第792頁，流程4，化合物14)。然而文章沒有公開其中公開的化合物作為藥物的應用。WO2003/062392公開了治療與EDG受體相關的病癥的方法。所公開的化合物在結構上不同于本發明的化合物。WO2009/135590描述了酰氨基取代的稠合環戊烷羧酸衍生物及其作為藥物的用途。所公開的化合物結構不同于本發明的化合物。在該申請中引用的任何參考文獻并不認可參考文獻與該申請的先有技術相關。發明描述本發明具有提供新型LPA受體拮抗劑的目的。本發明的目的已經出人意料地在一方面通過提供以下式(I)的化合物及其生理學上可接受的鹽、溶劑合物、互變異構體和立體異構體，包括其以所有比率存在的混合物得到解決:權利要求1.式(I)的化合物及其生理學上可接受的鹽、溶劑合物、互變異構體和立體異構體，包括其以所有比率存在的混合物:2.依據權利要求1的化合物及其生理學上可接受的鹽、溶劑合物、互變異構體和立體異構體，包括其以所有比率存在的混合物，其中:R1表示芳基、雜芳基、環烷基或芳基烷基，優選地為苯基、噻吩基、呋喃基、吡唑基、吡啶基、吲哚基或芐基，其可任選地被一個或多個選自以下的取代基取代:鹵素、F、Cl、Br、1、CF3、燒基、甲基、燒氧基或甲氧基。3.依據權利要求1或2的化合物及其生理學上可接受的鹽、溶劑合物、互變異構體和立體異構體，包括其以所有比率存在的混合物，其中:R2表不H、甲基或乙基。4.依據權利要求1-3中任何一項的化合物及其生理學上可接受的鹽、溶劑合物、互變異構體和立體異構體，包括其以所有比率存在的混合物，其中:R3表不H、甲基或乙基。5.依據權利要求1-4中任何一項的化合物及其生理學上可接受的鹽、溶劑合物、互變異構體和立體異構體，包括其以所有比率存在的混合物，其中:R4、R5相互獨立地表示H、烷基、OH-烷基、烷氧基、甲基、乙基、羥基-乙基或甲氧基。6.依據權利要求1-5中任何一項的化合物及其生理學上可接受的鹽、溶劑合物、互變異構體和立體異構體，包括其以所有比率存在的混合物，其中:R1表示芳基、雜芳基、環烷基或芳基烷基，優選地為苯基、噻吩基或芐基，其可任選地被一個或多個選自以下的取代基取代:鹵素、F、Cl、Br、1、CF3、烷基、甲基、烷氧基或甲氧基，R2表不H、甲基或乙基，R3表不H、甲基或乙基，R4、R5相互獨立地表示H、烷基``、OH-烷基、烷氧基、甲基、乙基、羥基-乙基或甲氧基，R6表示HX表示O。7.依據權利要求1-6中任何一項的選自以下的化合物及其生理學上可接受的鹽、溶劑合物、互變異構體和立體異構體，包括其以所有比率存在的混合物:8.用于制備式(I)化合物的方法，所述方法包括以下步驟:(a)使以下式(II)化合物9.依據權利要求1-7中任何一項的化合物用于調節，優選地抑制LPA受體介導的生物活性，優選LPAl受體、LPA2受體、LPA3受體、LPA4受體、LPA5受體或LPA6受體介導的生物活性，最優選LPA2受體介導的生物活性的用途。10.包含至少一種依據權利要求1-7中任何一項的化合物的藥物。11.包含至少一種依據權利要求1-7中任何一項的化合物的藥物，所述藥物用于治療和/或預防選自以下的生理學和/或病理生理學病癥:“癌癥、腫瘤、惡性腫瘤、良性腫瘤、實體腫瘤、肉瘤、癌、過度增生性疾病、類癌、尤因氏肉瘤、卡波濟氏肉瘤、腦腫瘤、源自腦和/或神經系統和/或腦膜的腫瘤、神經膠質瘤、膠質母細胞瘤、神經母細胞瘤、胃癌、腎癌、腎細胞癌、前列腺癌、前列腺癌、結締組織腫瘤、軟組織肉瘤、胰腺腫瘤、肝臟腫瘤、頭部腫瘤、頸部腫瘤、喉癌、食道癌、甲狀腺癌、骨肉瘤、視網膜母細胞瘤、胸腺瘤、睪丸癌、肺癌、肺腺癌、小細胞肺癌、支氣管癌、乳腺癌、乳癌、腸癌、結腸直腸腫瘤、結腸癌、直腸癌、婦科腫瘤、卵巢腫瘤/卵巢腫瘤、子宮癌、子宮頸癌、宮頸癌、子宮體癌、宮體癌、子宮內膜癌、膀胱癌、泌尿生殖道癌癥、膀胱癌、皮膚癌、上皮性腫瘤、鱗狀上皮癌、基底細胞瘤、鱗狀細胞癌、黑色素瘤、眼內黑色素瘤、白血病、單核細胞白血病、慢性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病、急性白血病、急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、淋巴瘤、眼科疾病、脈絡膜新生血管、糖尿病性視網膜病變、炎性疾病、關節炎、神經退行性變、移植排斥、轉移性生長、纖維化、再狹窄、HIV感染、動脈粥樣硬化、炎癥、心力衰竭、心肌病、心肌梗死、心肌重塑、血管重構、高血壓、周圍動脈閉塞(性)疾病、再狹窄、血栓癥、血管通透性障礙、炎性疾病、類風濕性關節炎、骨關節炎、腎病、腎乳頭壞死、腎衰竭、肺病、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、急性呼吸窘迫綜合征、免疫性疾病、變應性疾病、腫瘤生長、轉移、代謝性疾病、纖維化疾病、肺纖維化、心臟纖維化、血管纖維化、血管周圍纖維化、腎臟纖維化、肝纖維化、纖維化的皮膚病癥、牛皮癬、疼痛、瘙癢癥、視網膜缺血/再灌注損傷、黃斑變性、精神障礙、神經退行性疾病、腦神精障礙、周圍神經病癥、內分泌紊亂、甲狀腺機能亢進、瘢痕形成障礙或者用于心臟保護或腎臟保護和傷口愈合障礙、血管生成、心血管系統、骨骼、CNS和/或PNS”。12.依據權利要求10-11中任何一項的藥物，其中在這種藥物中包含至少一種另外的藥理活性物質。13.依據權利要求10-11中任何一項的藥物，其中在用至少一種另外的藥理活性物質治療之前和/或期間和/或之后應用所述藥物。14.包含治療有效量的至少一種依據權利要求1-7中任何一項的化合物的藥用組合物，所述組合物任選地進一步包含至少一種另外的選自以下的化合物:生理學上可接受的賦形劑、輔助劑、佐劑、稀釋劑、載體和/或除依據權利要求1-7中任何一項的化合物之外的另外的藥用活性物質。15.試劑盒，其包含治療有效量的至少一種依據權利要求1-7中任何一項的化合物和/或至少一種權利要求14的藥用組合物和治療有效量的至少一種其它的除依據權利要求1-7中任何一項的化合物之外的藥理活性物質。全文摘要本發明涉及依據式(I)的新的吡唑并吡啶酮衍生物及其制備方法。這些吡唑并吡啶酮衍生物可用作用于治療各種本發明公開的疾病的LPA受體拮抗劑。文檔編號C07D487/04GK103189378SQ201180042323公開日2013年7月3日申請日期2011年8月5日優先權日2010年9月2日發明者K.席曼,W.施特勒,D.溫克申請人:默克專利股份公司