膜聯蛋白1抗體的制作方法

專利名稱：膜聯蛋白1抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及與膜聯蛋白-Al結合的特異性結合分子和產生這種特異性結合分子的雜交瘤細胞系，特別涉及該分子的抗體和片段。這種特異性結合分子可用于治療T-細胞介導的疾病。
背景技術：
由于糖皮質激素(GCs)能夠同時阻止固有免疫應答和適應性免疫應答，因此經常被用于治療各種慢性自身免疫疾病。通過本發明人和其他研究組過去約10年的研究已經表明GCs對固有免疫應答的某些炎癥效應是由被稱作膜聯蛋白-1(Anx-Al)的蛋白介導的。已經證明該蛋白在許多細胞種類包括中性粒細胞、巨噬細胞和內皮細胞的自我平衡控制中發揮著作用。然而，經常被忽視的方面是Anx-Al在適應性免疫應答中的作用。令人驚訝的是考慮已經將Anx-Al提議作為GCs的藥理作用的第二信使之一。本發明人先前已經證明，Anx-Al通過調節T細胞受體(TCR)信號的強度在T細胞中發揮自我平衡作用(D，Acquisto et al.，Bloodl09:1095-1102，2007)。而且，本發明人已經證明，高水平的Anx-Al降低T細胞活化的閾值，并促進其分化成Thl細胞，但Anx-Al基因缺陷型小鼠卻表現出T細胞活化受損和分化成Th2細胞的增加(D，Acquisto et al.，Eur.J.1mmunol.37:3131-3142，2007)。W02005/027965記載了凋亡中性粒細胞將抗炎信號傳遞到樹突細胞的機制的發現過程，并識別了干擾該過程的抗體。

發明內容
本發明人已經識別出一種在T細胞活化的特異性抑制方面性能良好且沒有任何不利的細胞毒性效應的單克 隆抗體。該抗體可用于治療T細胞介導的疾病，例如風濕性關節炎或多發性硬化癥。因此，本發明提供一種針對具有圖2A所示的氨基酸序列的人類Anx-Al蛋白而產生的特異性結合分子。定義本文中使用的“特異性結合分子”是一對彼此具有結合特異性的分子中的成員。特異性結合對中的成員可以是天然來源的或其整個或部分是合成產生的。成對分子中的一個成員的表面具有一個能與成對分子中的另一成員的特定空間和極性結構特異性結合從而互補的區域，該區域可以為突起或凹陷。因此，每對成員具有彼此特異性結合的特性。各種類型的特異性結合對的實例為抗原-抗體、生物素-親和素、激素-激素受體、受體-配體、酶-基質。本發明主要考慮抗原-抗體類型的反應。本發明的特異性結合分子與Anx-Al的結合親和力大于與其它分子的結合親和力，即該特異性結合分子與Anx-Al特異性結合。與Anx-Al結合的特異性結合分子包括抗Anx-Al抗體和適體。本發明的特異性結合分子通常為抗體。本發明的抗Anx-Al抗體通過阻止T細胞活化而發揮功能，因此，當被給藥時，該抗體可以用于治療T細胞介導的疾病，該疾病通常是由異常的T細胞活化引起的。本文中使用的術語“抗體”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有抗原結合位點的分子，該抗原結合位點特異性結合抗原，無論該抗原是天然的還是部分或全部合成產生的。該術語還包括任何具有結合結構域的多肽或蛋白質，該結合結構域為抗體結合結構域或與抗體結合結構域同源的結構域。這些可以從天然來源得到，它們還可以部分或全部通過合成得到。抗體是通常含有兩條相同重鏈和兩條相同輕鏈的多肽，所述輕鏈小于所述重鏈。哺乳動物的抗體有兩種稱作λ和K的輕鏈。每條重鏈和每條輕鏈都由可變區和恒定區組成。重鏈可變區被稱作Vh區，輕鏈可變區被稱作'區。對于K輕鏈來說，'區也可以被稱作Vk區。重鏈和輕鏈的每個可變區都包括3個互補決定區(CDRs)，CDR1、CDR2 和 CDR3。將這些分別稱作 VLCDRl、VLCDR2、VLCDR3、VHCDRl、VHCDR2 和VHCDR3。抗體的實例有免疫球蛋白亞型(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)和它們的亞型子類；包含抗原結合結構域的片段如Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、dAb、Fd ;和雙體抗體。所述抗體可以為多克隆抗體或單克隆抗體。本文中，單克隆抗體可以被稱作“mAb”。
具體實施例方式膜聯蛋白是一類結合鈣和磷脂的細胞蛋白，也被稱作脂皮質蛋白。膜聯蛋白家族有13個成員，包括膜聯蛋白Al、膜聯蛋白A2和膜聯蛋白A5。膜聯蛋白Al也被稱作膜聯蛋白-1，在本文中被稱作“Anx-Al”。膜聯蛋白-1 (Anx-Al)是一種分子量為37kDa的蛋白，并且最初被認為是糖皮質激素活動的介導物。在過去的幾年中，已經有證據表明Anx-Al通過調節T細胞受體(TCR)信號的強度在適應性免疫系統，特別是在T細胞中發揮著自我平衡的作用。Anx-Al在體內固有免疫系統的細胞中發揮著炎癥內源性下調物的作用。

圖1A是顯示Anx-Al三維結構的帶狀圖。人類有8個編碼Anx-Al的核苷酸序列。其中，僅有四個被翻譯，因此有四種Anx-Al的亞型，所述四個 亞型被命名為ANXA1-002、ANXA1-003、ANXA1-004和ANXA1-006。這些序列可以從數據庫網站(www.ensembl.0rg)中得到，且被命名為 0TTHUMT00000052664(ANXAl-002)、 0TTHUMT00000052665(ANXA1-003)、0TTHUMT00000052666 (ANXA1-004)和 0TTHUMT00000052668 (ANXA1-006)。圖 2A 顯示了一種人類膜聯蛋白-1 (Anx-Al)的ANXA1-003亞型的氨基酸和核苷酸序列。圖2B、2C和2D分別顯示了亞型ANXA1-002、ANXA1-004和ANXA1-006的氨基酸序列。從圖2可以看出，亞型ANXA1-002.ANXA1-004和ANXA1-006是ANXA1-003的短剪接變體或是少量氨基酸發生改變的ANXA1-003的變體。許多研究已經表明，被稱作Ac.2-26的Anx-Al的N-末端肽作為整個蛋白質的生物活性代表物(surrogate)(參見例如Lim et al., Proc Natl Acad SciUSA95, 14535-9，1998)。圖1B是膜聯蛋白重復序列和該生物活性序列位點的示意圖。肽Ac.2-26是一種乙酰化的肽，該肽具有圖2所示的Anx-Al的全長氨基酸序列的氨基酸殘基2-26的序列。圖1C顯示了肽Ac.2-26的序列，該序列如下所述:ch3co-amvseflkqawfieneeqeyvqtvkAnx-Al及其N-末端衍生的生物活性肽通過甲酰肽受體(FPR)家族的成員介導它們的生物效應。Anx-Al通過直接結合和活化該家族中的成員類甲酰肽受體-1 (FPRL-1)在中性粒細胞溢出和固有免疫中起到反向調節作用。先前，本發明的發明人就已經發現，在存在hrAnx-Al的情形下，通過刺激FPRL-1來刺激T細胞可提高T細胞的活化作用(DJ Acquisto et al.，Bloodl09:1095-1102，2007)。本發明的特異性結合分子可與膜聯蛋白-1 (Anx-Al)結合。特異性結合分子結合的Anx-Al是具有圖2A所示的多肽序列的人類Αηχ-Α1。在第一方面中，本發明提供一種針對具有圖2Α所示的氨基酸序列的人類Anx-Al蛋白而產生的特異性結合分子。本發明的這個方面還涉及一種包括本發明的第一方面的特異性結合分子的互補決定區(CDRs) VLCDRl、VLCDR2、VLCDR3、VHCDRl、VHCDR2 和 VHCDR3，或與每個單獨的 CDR 具有至少70%同一性的氨基酸序列的特異性結合分子。該特異性結合分子通常為抗體。在一種實施方式中，所述特異性結合分子具有互補決定區(⑶Rs)VIXDRl、VIXDR2、VLCDR3、VHCDRl、VHCDR2和VHCDR3，或與它們具有至少70%同一性的氨基酸序列，所述每個互補決定區都各自具有如下所述的氨基酸序列，其中VLCDRl 為 KASENVVTYVSVLCDR2 為 GASNRYTVLCDR3 為 GQGYSYPYTVHCDRl 為 GYTFTNYWIGVHCDR2 為 DIYPGGDYTNYNEKFKGVHCDR3 為 WGLGYYFDY。CDRs 是根據保守序列定義(Kabat et al in “Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，Nat’ 1.1nst.Health, Bethesda, MD (1987))和結構化定義(Chothia and Lesk J.Mol Biol.196:901-17 (1987))的結合指定的。后來在 Carter etal,Proc Nat，I Acad Sci U S A.89:4285-9 (1992)中也記載了這些定義。本發明還涉及上述肽序列的變體。本文中使用的術語“變體”指的是具有相似氨基酸序列和/或保持相同功能的蛋白質。例如，術語“變體”包括包含增加、缺失或置換等一個或多個氨基酸的蛋白質或多肽。本發明的變體的一個實例是蛋白，如融合蛋白，所述蛋白包括上面定義的肽，但其中用一個或多個其它氨基酸置換了上面定義的肽中的一個或多個氨基酸。技術人員知道有幾種氨基酸具有相似的性質。通常可以用一個或多個其它的這類氨基酸來置換物質中的一個或多個同類氨基酸，而不會喪失該物質的所需活性。因此，氨基酸甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸通常能夠互相置換(具有脂肪族側鏈的氨基酸)。在這些可能的置換中，優選使用甘氨酸和丙氨酸互相置換(因為它們具有相對較短的側鏈)，并且優選使用纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸互相置換(因為它們具有較大的脂肪族疏水側鏈)。其它可經常互相置換的氨基酸包括:苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香族側鏈的氨基酸)；賴氨酸、精氨酸和組氨酸(具有堿性側鏈的氨基酸)；天冬氨基酸和谷氨酸(具有酸性側鏈的氨基酸);天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺側鏈的氨基酸);以及半胱氨酸和蛋氨酸(具有含硫側鏈的氨基酸)。這種性質的置換通常被稱作“保守的”或“半保守”的氨基酸置換。因此，本發明涉及一種具有CDRs的特異性結合分子， 所述CRDs具有上述的氨基酸序列，但在CDRs中有一個或多個保守置換，從而使得CFRs的氨基酸序列與上述序列具有至少70%的同一性。例如，與上面列出的⑶Rs的氨基酸序列相比，每個⑶R可有1、2、3、4或5個保守置換(取決于⑶R)。例如，在上面列出的VIXDRl的氨基酸序列中能有1、2或3個保守置換，在上面列出的VLCDR2的氨基酸序列中能有I或2個保守置換，在上面列出的VLCDR3的氨基酸序列中能有I或2個保守置換，在上面列出的VHCDRl的氨基酸序列中能有1、2或3個保守置換，在上面列出的VHCDR2的氨基酸序列中能有1、2、3、4或5個保守置換，在上面列出的VHCDR3的氨基酸序列中能有1、2或3個保守置換，并且所述序列仍保持與上面列出的CDR序列至少70%的同一性。氨基酸可以用下述的三字母代碼和單字母代碼表示:甘氨酸(G或Gly)、丙氨酸(A或Ala)、纈氨酸(V或Val)、亮氨酸(L或Leu)、異亮氨酸(I或lie)、脯氨酸(P或Pro)、苯丙氨酸(F或Phe)、酪氨酸(Y或Tyr)、色氨酸(W或Trp)、賴氨酸(K或Lys)、精氨酸(R或Arg)、組氨酸(H或His)、天門冬氨酸(D或Asp)、谷氨酸(E或Glu)、天冬酰胺(N或Asn)、谷氨酰胺(Q或Gin)、半胱氨酸(C或Cys)、蛋氨酸(M或Met)、絲氨酸(S或Ser)和蘇氨酸(T或Thr)。在殘基可以是天門冬氨酸或天冬酰胺的位置，可以使用符號Asx或B。在殘基可以是谷氨酸或谷氨酰胺的位置，可以使用符號Glx或Z。除非上下文中指定，否則所提及的天門冬氨酸包括天冬氨酸鹽，且谷氨酸包括谷氨酸鹽。也可以對上述蛋白如融合蛋白的氨基酸序列進行氨基酸的缺失或插入。因此，例如，對多肽活性沒有實質作用的氨基酸或至少沒有消除該活性的氨基酸是可以缺失的。這種缺失可能是有益的，因為在保持活性的同時，降低了該多肽的整體長度和分子量。這可以減少特定目的所需的多肽量，如可以減少劑量水平。也可以對上述的融合蛋白進行氨基酸插入。進行該過程可以改變本發明物質的性質(如有助于識別、純化或表達，如上文與融合蛋白有關的解釋)。可以使用任何合適的技術進行與上述序列有關的氨基酸改變，如通過使用定點誘變或固態合成。`應該理解的是本發明范圍內的氨基酸置換或插入可以使用天然存在的或非天然存在的氨基酸進行。無論使用的是天然氨基酸還是合成氨基酸，優選僅存在L-氨基酸。本領域中已知的“同一性”是指兩個或多個多肽序列或兩個或多個多核苷酸序列之間的關系，這是通過比較序列確定的。在本領域中，同一性也可以指多肽或多核苷酸序列之間的序列關聯度，視具體情況而定，這是通過比對序列的字符串確定的。雖然有多種方法都可以測量兩個多肽序列或兩個多核苷酸序列之間的同一性，但是用于確定同一性的一般方法是在計算機程序中進行編碼。優選的用于確定兩個序列之間同一性的計算機程序包括但不局限于 GCG 程序包(Devereux, et al., Nucleic Acids Research, 12, 387 (1984), BLASTP, BLASTN和 FASTA(Atschul et al.，J.Molec.Biol.215，403(1990))。人們可以使用程序如CLUSTAL程序比較氨基酸序列。所述程序比較氨基酸序列，并通過在任一適合的序列中插入空格找到最優比對。用最優比對能夠計算出氨基酸的同一性或相似性(同一性加上保守氨基酸的類型)。程序如BLASTx將比對最長的一段相似序列，并賦給一個合適的值。因此，可能獲得發現多個相似區域的比較，每個區域都有不同的評分。本發明中考慮了兩種類型的同一性分析。兩個氨基酸序列或兩個核酸序列的同一性百分比是通過以實現最佳比對為目的的序列比對(例如，為了與序列最佳比對，可以在第一個序列中引入缺口)并比較相應位置的氨基酸殘基或核苷酸確定的。“最優比對”是指兩個同一性百分比最高的序列的比對。同一性百分比是通過被比較的序列中同源氨基酸殘基或核苷酸的數量確定的(即，同一性百分比=同源位置的數量/位置的總數量X100)。使用本領域技術人員已知的數學算法能夠完成兩個序列之間同一性百分比的確定。用于比較兩個序列的數學算法的一個實例是Karlin and Altschul (1990)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:2264-2268 中的算法，后修改為 Karlin and Altschul (1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-5877。Altschul, et al.(1990) J.Mol.Biol.215:403-410 中的NBLAST和XBLAST程序已經納入了該算法。用分數=100、字長=12的NBLAST程序可以進行BLAST核苷酸檢索，以得到與本發明核酸分子同源的核苷酸序列。用分數=50、字長=3的XBLAST程序可以進行BLAST蛋白質檢索，以得到與本發明蛋白分子同源的氨基酸序列。為了得到用于比較目的的間隙比對，可以使用Altschul et al.(1997)Nucleic AcidsRes.25:3389-3402中記載的間隙BLAST。或者，可以使用PS1-Blast進行重復檢索，該重復檢索可檢測分子之間的遠緣關系(Id.)。當使用BLAST、間隙的BLAST和PS1-Blast程序時，可以使用各個程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認參數。參見http://www.ncb1.nlm.nih.gov。序列比較使用的數學算法的另一個實例是CABIOS (1989)中的Myers和Miller算法。屬于CGC序列比對軟件包 的ALIGN程序(版本2.0)已經納入了該算法。本領域中已知的其他序列分析算法包括Torellis and Robotti (1994) Comput.Appl.Biosc1.，10:3-5 中記載的 ADVANCE 和 ADAM ；以及 Pearson and Lipman (1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.85:2444-8 中記載的FASTA。在FASTA內，ktup是一個設置靈敏度和檢索速度的控制選項。通常，使用HGMP (人類基因組圖譜計劃)提供的BLAST計算機程序(Atschul etal.，J.Mol.Biol.215，403-410(1990))中的默認參數時，本發明特異性結合分子的CDRs的氨基酸序列在氨基酸水平上與上述CDRs的氨基酸序列具有至少70%的同一性。更典型地，CDR序列在氨基酸水平上與上述序列具有至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%的同一性。通常，本發明中特異性結合分子的每個⑶R序列與上面列出的CDRs的氨基酸序列都有該水平的同一性。或者，本發明的特異性結合分子的任何I個，2個，3個，4個或5個⑶Rs與上面列出的⑶Rs的氨基酸序列有該水平的同一性。本發明的特異性結合分子通常是抗體，更典型的是單克隆抗體。在一種實施方式中，本發明的單克隆抗體是人源化的。通過修飾抗體的氨基酸序列可以將本發明的單克隆抗體人源化。降低本發明特異性結合分子的免疫原性的方法包括例如通過定位誘變或其它常用的分子生物學方法(Roguska et al Protein Eng.9895-904 (1996))將CDR移植到適合的抗體主鏈骨架上或重
塑可變表面殘基。其它可用的方法可以包括分子內潛在的T細胞表位的識別和隨后如通過定點誘變移除這些表位(去免疫法)。當將特異性結合分子用作藥物時可能需要所述特異性結合分子的人源化。也可以按照需要進行CDR區域或骨架序列周圍的人源化。可以使用單克隆抗體和其它抗體并通過重組DNA技術來產生保持原抗體特異性的其它抗體或嵌合分子。這類技術可以包括將編碼抗體的免疫球蛋白可變區或互補決定區(⑶Rs)的DNA引入不同的免疫球蛋白的恒定區或恒定區加上骨架區。參見如EP-A-184187、GB2188638A或EP-A-239400。產生抗體的雜交瘤細胞或其它細胞可進行基因突變或其它改變，這可能改變或不改變所得抗體的結合特異性。由于可以在多個方面對抗體進行修飾，術語“抗體”應該被解釋為涵蓋具有所需特異性結合結構域的任何特異性結合成員或物質。因此，該術語涵蓋抗體片段、衍生物、功能等效物和抗體類似物，人源化抗體，包括任何包括免疫球蛋白結合結構域的多肽，不論是天然的還是整體或部分合成的。因此，涵蓋了與另一種多肽融合的含有免疫球蛋白結合結構域或其等效物的嵌合分子。EP-A-0120694和EP-A-0125023中記載了嵌合抗體的克隆和表達。人源化的抗體可以是被修飾的具有非人如小鼠抗體的可變區和人類抗體的恒定區的抗體。例如，專利號為N0.5225539的美國專利中記載了制備人源化抗體的方法。本發明的特異性結合分子可以是抗體的片段。已經證明一個完整抗體的片段能夠發揮結合抗原的作用。結合片段的實例有(i)由Vu Vh，(^和ChI結構域組成的Fab片段；(ii)由Vh和ChI結構域組成的Fd片段；(iii)由單一抗體的\和Vh結構域組成的Fv片段；(iv)由 Vh 結構域組成的 dAb 片段(Ward, E.S.et al., Nature341:544-546 (1989))；(v)分離的⑶R區域；(vi) F(ab’)2片段，包括兩個聯合的Fab片段的二價片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv),其中Vh結構域和\結構域是通過肽連接物連接的，所述肽連接物使兩個結構域相連接以形成抗原結合位點(Bird et al., Science242:423-426 (1988) ; Huston etal., PNAS USA85:5879-5883 (1988)) ; (viii )雙特異性單鏈 Fv 二聚體(PCT/US92/09965)和(ix) “雙體抗體”，通過基因融合構建的多價或多特異性片段(W094/13804;P.Hollingeret al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448 (1993)) 通常，所述片段為 Fab、F(ab，)2或Fv片段或scFv分子。雙體抗體是多肽的多聚體，每個多肽都具有第一結構域和第二結構域，所述第一結構域具有免疫球蛋白輕鏈的結合區域，所述第二結構域具有免疫球蛋白重鏈的結合區域，兩個結構域相連接(例如，通過肽連接物)但不能彼此結合成抗原結合位點:抗原結合位點是通過將多聚體內一個多肽的第一結構域和多聚體內另一多肽的第二結構域結合形成的(W094/13804)。

當使用雙特異性抗體時，可以是常規的雙特異性抗體，這些抗體可以用各種方法(Hollinger&ffinter, Current Opinion Biotechnol.4:446-449 (1993))來制造，如通過化學方法制備或從混合的雜交瘤中制備，或這些抗體可以是任何上述的雙特異性抗體片段。優選使用scFv 二聚體或雙體抗體,而非完整抗體。雙體抗體和scFv可以僅使用可變結構域而不使用Fe區域來構建，這潛在地減少抗獨特型反應的效果。其它形式的雙特異性抗體包括 Traunecker et al., EMBO JournallO: 3655-3659 (1991)中記載的單鏈 “ Janusins”。也可以使用與雙特異性整體抗體不同的雙特異性雙體抗體，因為它們在E.coli中很容易被構建和表達。使用噬菌體展示技術(W094/13804)能夠從文庫中很容易的篩選出具有合適的結合特異性的雙體抗體(和許多其它的多肽如抗體片段)。例如，如果對抗原X有特異性的雙體抗體的一個臂保持恒定，那么在另一個臂變化時就可以制備文庫并篩選出具有合適特異性的抗體。單克隆抗體VJ-4B6是雜交瘤細胞系VJ-4B6-E5-B10-D4分泌的，所述細胞系根據布達佩斯條約于2010年6月3日保藏于歐洲細胞培養物保藏中心(ECACC)、HealthProtection Agency,Centre for Emergency Preparedness and Response, PortonDown, Salisbury, SP40JG, United Kingdom、登記號為 n0.10060301。保藏是由Fulvio D’Acquisto, Queen Mary and Westfield College, Centre forBiochemical Pharmacology, Charterhouse Square, London EC1M6BQ 完成的。根據歐洲專利公約的31(1) (d)款，保藏人已經授權申請人可在本申請中援引該保藏材料，并且已經給出無限制且不可撤銷的承諾，同意將該保藏材料向公眾提供。雜交瘤細胞系VJ-4B6-E5-B10-D4可產生與膜聯蛋白-Al特異性結合的單克隆抗體VJ-4B6。本發明的單克隆抗體VJ-4B6屬于IgG2b亞型。抗體VJ-4B6是針對具有圖2所示的氨基酸序列的全長人類Anx-Al蛋白而產生的。圖11中顯示了抗體VJ-4B6的輕鏈可變區的DNA和氨基酸序列。圖12顯示了VJ-4B6的輕鏈可變區的氨基酸序列，其中標注了 CDRs。圖12還顯示了 VJ-4B6的輕鏈恒定區的最初幾個氨基酸。圖13中顯示了抗體VJ-4B6的重鏈可變區的DNA和氨基酸序列。圖14顯示了VJ-4B6的重鏈可變區的氨基酸序列，其中標注了⑶Rs。圖14還顯示了 VJ-4B6的重鏈恒定區的最初幾個氨基酸。抗體VJ-4B6 的 CDRs 如下:VLCDRl 為 KASENVVTYVSVLCDR2 為 GASNRYTVLCDR3 為 GQGYSYPYTVHCDRl 為 GYTFTNYWIGVHCDR2 為 DIYPGGDYTNYNEKFKGVHCDR3 為 WGLGYYFDY本發明涉及具有如本文所述的抗體VJ-4B6的CDRs的特異性結合分子，并且本發明還涉及具有與如本文所述的抗體VJ-4B6的一個或多個⑶Rs有至少70%同一性的⑶Rs的特異性結合分子。本發明還涉及具有抗體VJ-4B6的輕鏈可變區、重鏈可變區或具有輕鏈可變區和重鏈可變區的特異性結合分子。因此，在一個具體實施方式
中，根據本發明的第一方面，本發明提供一種具有具有圖11和/或圖13所示的氨基酸序列的多肽的特異性結合分子。本發明的這個實施方式還涉及特定的抗體片段，所述片段具有具有圖11所示的氨基酸序列的輕鏈可變區和/或具有圖13所示的氨基酸酸序列的重鏈可變區。例如，該實施方式涉及Fab、F(ab’)2或Fv片段和scFv分子。根據本發明的第一方面，本發明還涵蓋包括具有圖12和/或圖14所示的氨基酸序列的多肽的特異性結合分子。在一個具體實施方式
中，根據本發明的第一方面，本發明提供一種由雜交瘤細胞系產生的特異性結合分子，所述雜交瘤細 胞系于2010年6月3日保藏于歐洲細胞培養物保藏中心(ECACC)，登記號為N0.10060301。在第二方面，本發明提供一種可產生特異性結合分子的雜交瘤細胞系，所述雜交瘤細胞系產生針對具有圖2A所示的氨基酸序列的人類Anx-Al蛋白而產生的特異性結合分子。在一個具體的實施方式中，根據本發明的第二方面，本發明提供一種雜交瘤細胞系，所述雜交瘤細胞系于2010年6月3日保藏于歐洲細胞培養物保藏中心(ECACC)，登記號為 N0.10060301。在第三方面，本發明提供一種包括本發明的特異性結合分子的藥物組合物。根據本發明第三方面的組合物可以用任何方便的途徑制備。本發明的藥物組合物除包括本發明的特異性結合分子外，通常還包括藥學上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑、輔助劑、運載工具、緩沖液或穩定劑。所述載體包括但不局限于生理鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、脂質體、水、甘油、聚乙二醇、乙醇及其組合。該藥物組合物可以為任何適合的形式，這取決于對患者給藥所需的方法。該藥物組合物可以以單位劑型提供，通常是用密閉容器提供，并且可以作為試劑盒的一部分來提供。這種試劑盒通常(雖然不是必須的)包括使用說明書。該試劑盒可以包括多個所述單位劑型。可以通過任何適當的途徑使藥物組合物適合于給藥，如通過口服(包括口腔或舌下)、直腸、鼻、局部(包括口腔、舌下或透皮)、陰道或非腸道(包括皮下注射、肌肉注射、靜脈注射或真皮內注射)途徑。該組合物可通過藥學領域中已知的任何方法制備，例如，通過在無菌條件下將活性成分與載體或賦形劑混合。適合口服給藥的藥物組合物能夠以離散單元如膠囊或藥片、粉末或顆粒、溶液、酏劑或懸浮液(在水或非水液體中；或者作為可食用的泡沫或攪拌泡沫(Whips);或作為乳劑)存在。用于藥片或硬明膠膠 囊的合適賦形劑包括乳糖、玉米淀粉或其衍生物、硬脂酸或硬脂酸鹽。用于軟明膠膠囊的合適賦形劑包括如植物油、蠟、油脂、半固態或液態多元醇等。對于溶液和酏劑的制備，可使用的賦形劑包括如水、多元醇和糖類。對于懸浮液的制備，可使用油(例如植物油)來提供水包油或油包水懸浮液。適合經皮給藥的藥物組合物可以離散貼劑存在，這是為了在很長的一段時間中可以與受體的表皮保持緊密接觸。例如，活性成分可通過PharmaceuticalResearch, 3 (6):318(1986)中普遍記載的電離子滲入療法從貼劑中釋放出來。適合局部給藥的藥物組合物可制造成藥膏、乳脂、懸浮液、洗液、粉劑、溶液、糊劑、凝膠劑、噴霧、氣溶膠或油。對于眼睛或其它外部組織如口和皮膚的感染，優選使用局部藥膏或乳脂形式的組合物。配制軟膏時，可以使用活性成分與石蠟或可與水混溶的軟膏基質。或者，活性成分可以制成具有水包油乳脂基質或油包水基質的乳脂。適合眼睛局部給藥的藥物組合物包括眼藥水，其中活性成分溶解或懸浮在合適的載體特別是水溶劑中。適合口中局部給藥的藥物組合物包括糖果、藥片和漱口水。適合直腸給藥的藥物組合物可以栓劑或灌腸劑存在。適于鼻腔給藥且載體是固體的藥物組合物包括例如粒度在20-500微米范圍內的粗粉劑，使用鼻煙的方式給藥，即將持有粉劑的容器靠近鼻子并通過鼻腔通道將容器內的粉劑迅速吸入。通過噴鼻劑或滴鼻劑給藥且載體是液體的藥物組合物包括活性成分的水性或油性溶液。
適于吸入給藥的藥物組合物包括可以由各種類型的壓力定量氣溶膠、噴霧器或吹藥器產生的微粒粉塵劑或霧劑。適合陰道給藥的藥物組合物可以以陰道栓、棉球、乳脂、凝膠劑、糊劑、泡沫或噴霧制劑存在。適合腸胃外給藥的藥物組合物包括水和非水無菌注射液以及水和非水無菌懸浮液，所述注射液可以含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和使該劑型與目標受試者的血液基本上等滲的溶質；所述懸浮液可以含有懸浮劑和增稠劑。用于注射用溶液劑的賦形劑包括例如水、乙醇、多元醇、丙三醇和植物油。所述組合物可以置于單位劑量或多劑量的容器內，例如密封的安瓿和小瓶中，并可以儲藏于冷凍干燥(凍干的)的條件下，僅需添加無菌液體載體，例如注射用水，就可以立即使用。可用無菌粉劑、顆粒劑和片劑制備臨時的注射溶液劑和懸浮液。藥物組合物可包括防腐劑、增溶劑、穩定劑、濕潤劑、乳化劑、甜味劑、著色劑、香味齊U、鹽(本發明的物質本身就可以以藥學上可接受的鹽的形式提供)、緩沖劑、包衣劑或抗氧化劑。除本發明的分子外，本發明的藥物組合物還可以含有一種或多種其它治療活性劑。在某些實施方式中，活性藥物濃縮物的劑型可以包括藥學上可接受的等滲劑、緩沖劑和藥學上可接受的表面活性劑。或者，所述劑型可以包括活性成分和磷酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、吐溫80或吐溫20 (降低攪動誘導的聚集風險的表面活性劑)和水(USP/Ph.Eur)，任選地可將pH調整到約6.0-7.0，如6.5左右。活性藥物濃縮物可以被凍干或不被凍干。其它劑型可以包括緩沖劑三水乙酸鈉、滲透壓調節劑氯化鈉、調節pH的乙酸和注射用水。本發明組合物的劑量范圍較寬,其劑量范圍取決于治療的疾病或失調、治療的個體的年齡和狀況等，而且醫生將最終決定所使用的合適劑量。該劑量可適當地重復使用。如果產生副反應，則可根據日常臨床實踐減少劑量或該劑量的頻率。對于哺乳動物特別是人類給藥，預期的活性劑的日劑量為I μ g/kg體重至IOmg/kg體重,通常為10 μ g/kg體重至lmg/kg體重。在任何情況下，醫生將決定最適合個體的實際劑量，該劑量取決于各種因素，包括個體的年齡、體重、性別和應答等。上述劑量是一般情況的示例。當然，也有使用較高劑量或較低劑量的實例，并且這都在本發明的范圍內。本發明的特異性結合分子可以用在醫藥學上，如用于治療T細胞介導的疾病。因此，在第四方面，本發明提供一種供醫藥學上使用的本發明的特異性結合分子。在第五方面，本發明提供一種用于治 療T細胞介導的疾病的本發明的特異性結合分子。因此，本發明的這方面還包括治療受試者的T細胞介導的疾病的方法，通常是需要被治療的受試者，所述方法包括向受試者給藥本發明的特異性結合分子。因此，本發明還涉及本發明的特異性結合分子在制備用于治療T細胞介導的疾病的藥物中的用途，或還涉及本發明的特異性結合分子在制備治療T細胞介導的疾病的藥物中的用途。所述治療方法可以用于人類受試者或動物受試者，而且本發明同樣涉及在人類藥品和/或動物藥品中的用途。本發明的特異性結合分子優選以“治療有效量”向個體給藥，該量足以顯示出對個體的益處。本文中使用的“治療”包括能夠對人類或非人類動物優選為哺乳動物有益的任何方案。治療可以是針對現存的病癥或可以是預防性的(預防性治療)。在本發明的這個方面，本發明的特異性結合分子可以用于治療由T細胞介導的各種不同疾病。在本文中，“T細胞介導的疾病”是指T細胞在發病或疾病或病癥的發展中能夠發揮作用的任何疾病或病癥。T細胞介導的疾病通常是由異常的T細胞活化引起的。相應地，可以通過阻止Anx-Al的活性而阻止T細胞的活化來治療這種疾病，本文中已經證明這可以通過單克隆抗體VJ-4B6起作用。通常，本發明中治療的T細胞介導的疾病是Thl細胞起作用的疾病。T細胞介導的疾病包括但不局限于移植物抗宿主疾病、移植排斥反應、動脈粥樣硬化、HIV和/或AIDS、牛皮癬、流產和一些自身免疫疾病。根據本發明可治療的自身免疫疾病包括風濕性關節炎(RA)、多發性硬化癥(MS)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、艾迪生氏病(Addison’s disease)、格雷夫斯病(Grave’s disease)、硬皮癥、多肌炎、糖尿病且特別是某些形式的糖尿病(例如，青少年糖尿病)、自身免疫性葡萄膜視網膜炎、潰瘍性結腸炎、尋常型天皰瘡、炎性腸病、自身免疫性甲狀腺炎、葡萄膜炎、貝賽特氏癥(Behfefs disease)
和舍格倫式綜合癥(Sjiigren's disease)。典型的T細胞介導的疾病是風濕性關節炎、多發
性硬化癥、全身性紅斑狼瘡、動脈硬化、HIV、AIDS或牛皮癬。更典型地，T細胞介導的疾病是風濕性關節炎或多發性硬化癥。

本文中限定的T細胞介導的疾病還包括流產。本文中限定的治療可以是預防性的(預防性治療)。因此本發明的特異性結合分子可以用來預防流產。已知的是失控的Thl應答與流產有關，并且增加的Th2應答有助于懷孕。典型的T細胞介導的疾病是風濕性關節炎。在風濕性關節炎(RA)中，認為是滑膜中T細胞識別抗原呈遞細胞且與抗原呈遞細胞相互作用。這些細胞一旦被活化，就會產生細胞因子和效應物分子；細胞因子的連續放大生產會形成“細胞因子級聯反應”，該級聯反應會導致巨噬細胞的活化和誘導炎性過程，使軟骨和骨頭的退化和吸收達到最高。隨著時間的推移，會出現骨腐蝕，軟骨損壞，以及完全喪失關節的完整性。最終，可能會影響多個器官系統。在另一種實施方式中，T細胞介導的疾病是多發性硬化癥(MS)。在另一種實施方式中，T細胞介導的疾病是動脈硬化。炎癥在冠狀動脈疾病和動脈硬化的其它臨床表現中起著關鍵的作用。免疫細胞控制早期的粥樣硬化病變，它們的效應物分子加速了病變的進程，并且炎癥的活化可以引起急性冠狀動脈綜合癥。適應性免疫高度地參與了動脈粥樣化的形成，因為已經表明它與代謝危險因子相互作用以啟動、傳播和活化動脈樹中的病變。在另一實施方式中，T細胞介導的疾病是系統性紅斑狼瘡(SLE)。鑒于Anx-Al促進Thl細胞分化的能力，本發明也可以用于例如限制失控的保護性細胞(Thl)對抗細胞內病原體的應答和通過抑制Thl分化和促進Th2分化來治療細胞外感染(Th2應答)。
本發明的第二方面和后續方面的優選特征是對第一方面中的特征所做的適應性改變。在一種實施方式中，本發明提供一種針對具有圖2所示的氨基酸序列的全長人類Anx-Al蛋白而產生的特異性結合分子。所述特異性結合分子的一個實例為單克隆抗體VJ-4B6，該抗體是由2010年6月3日保藏于歐洲細胞培養物保藏中心(ECACC)，登記號為N0.10060301的雜交瘤細胞系產生的。在一種實施方式中，本發明提供具有單克隆抗體VJ-4B6的CDRs的特異性結合分子，所述單克隆抗體VJ-4B6的CDRs具有下述氨基酸序列:VLCDRl 為 KASENVVTYVSVLCDR2 為 GASNRYTVLCDR3 為 GQGYSYPYTVHCDRl 為 GYTFTNYWIGVHCDR2 為 DIYPGGDYTNYNEKFKG`
VHCDR3 為 WGLGYYFDY在一種實施方式中，本發明提供具有單克隆抗體VJ-4B6的Vh和/或\區域的特異性結合分子，圖11和圖13分別顯示了所述區域。在一種實施方式中，本發明提供雜交瘤細胞系VJ-4B6-E5-B10-D4，該細胞系于2010年6月3日保藏于歐洲細胞培養物保藏中心(ECACC)，登記號為N0.10060301。單克隆抗體VJ-4B6是由圖3A所述的方法產生的。簡單地說，將cDNA編碼的具有圖2A所示序列的全長人類Anx-Al克隆到表達載體中，并確認其細胞表面的表達。將吸附到金微粒的載體DNA通過幾次皮內應用后給藥小鼠。鼠細胞接受了免疫載體并表達了 cDNA編碼的蛋白，從而刺激了免疫應答。然后，將鼠淋巴細胞與鼠骨髓瘤細胞融合以產生雜交瘤。然后，進行特異性測試，克隆雜交瘤和并產生單克隆抗體。因此，用于產生單克隆抗體VJ-4B6的方法使用了被Anx-Al的cDNA轉染的細胞，該細胞能夠在細胞表面表達整個分子，因此，該蛋白以與體內存在形式相同的形式即以它的四級天然結構存在。這種產生抗體的方法與產生其它市售Anx-Al抗體的方法不同，所述其他市售抗體是通過用Anx-Al肽或變性全長蛋白免疫小鼠而產生的。本發明的抗體特別可用于治療T細胞介導的疾病，如風濕性關節炎和多發性硬化癥。現在將參照下述實施例進一步描述本發明，下述實施例僅是為了說明的目的。在實施例中，參考了多個附圖，其中:圖1A是膜聯蛋白-1結構的帶狀圖，該圖顯示了四個膜聯蛋白重復序列和N-末端結構域。圖1B是膜聯蛋白重復序列(repeat)和生物活性序列膜聯蛋白_1肽Ac.2-26位置的示意圖。圖1C顯示了肽Ac.2-26的氨基酸序列，該序列是Anx-Al乙酰化的N-末端肽片段。圖2A顯示了人類膜聯蛋白-1 (Anx-Al)亞型ANXA1-003的(i )氨基酸序列和(ii )核苷酸序列。圖2B顯示了人類膜聯蛋白-1 (Anx-Al)亞型ANXA1-002的氨基酸序列。圖2C顯示了人類膜聯蛋白-1 (Anx-Al)亞型ANXA1-004的氨基酸序列。圖2D顯示了人類膜聯蛋白-1 (Anx-Al)亞型ANXA1-006的氨基酸序列。圖3顯示了 VJ-4B6的生成。(A)用于分離和產生VJ-4B6的方法的示意圖；(B)柱狀圖顯示了用VJ-4B6對被膜聯蛋白-1的cDNA (綠線；右手峰)或無關的對照cDNA (紅線；左手峰)穩定轉染的細胞系進行染色的結果。圖4顯示了 VJ-4B6的確認。(A)用VJ-4B6 (50ng/ml)對透化的人類外周血單核細胞(PBMC)或多形單核細胞(￡olymorph Mononuclear Cells) (PMN)進行染色。(B)用VJ-4B6 (50ng/ml)對透化的小鼠淋巴細胞或駐留的腹腔巨噬細胞進行染色。在所有的試驗中，細胞都用4%的多聚甲醛進行固定，然后在FACS緩沖液中用0.02%的皂苷使細胞透化。在4°C下，將細胞與生物素化的VJ-4B6培養過夜，然后，用鏈霉親和素-FITC綴合的抗體(稀釋度1:200)染色I小時。在所有的圖中，左手峰代表對照，而右手峰代表VJ-4B6。顯示的數據來自單一實驗，并代表其它兩組有相似結果的實驗。圖5顯示了 VJ-4B6抑制抗-⑶3_誘導的T細胞增殖。在所示濃度的VJ-4B6存在下，用包被在培養板上的抗-CD3(ly g/ml)刺激ΑηχΑ1+/+(Α)和ΑηχΑ1-/-(Β)小鼠的脾臟和淋巴結中的T細胞。18-20小時后，用3H-胸苷(IyCi)脈沖細胞12小時，然后用細胞收集器處理，以測量3H-胸苷整合的水平。顯示的數據來自單一實驗，并代表其它兩組有相似結果的實驗。圖6顯示了 VJ-4B6抑制抗-⑶3/⑶28誘導的T細胞增殖。在所示濃度的VJ-4B6存在下，用包被在培養板上的抗-CD3 (I μ g/ml)和抗-CD28(1 μ g/ml)刺激AnxAl+/+(A)和AnxAl-/-(B)小鼠的脾臟和淋巴結中的T細胞。18-20小時后，用3H-胸苷(IyCi)脈沖細胞12小時，然后用細胞收集器處理，以測量3H-胸苷整合的水平。顯示的數據來自單一實驗，并代表其它兩組有相似結果的實驗。圖7顯示了 VJ-4B6抑制抗-CD3-誘導的IL-2生成。在所示濃度的VJ-4B6存在下，用包被在培養板上的抗-CD3 (I μ g/ml)刺激ΑηχΑ1+/+(Α)和ΑηχΑ1-/-(Β)小鼠的脾臟和淋巴結中的T細胞。20-24 小時后，收集細胞上清液，并用ELISA分析上清液以得到IL-2的水平。顯示的數據來自單一實驗，并代表其它兩組有相似結果的實驗。圖8顯示的是VJ-4B6抑制抗-CD3/CD28-誘導的IL-2生成。在所示濃度的VJ-4B6存在下，用包被在培養板上的抗-CD3 (I μ g/ml)和抗-CD28(1 μ g/ml)刺激AnxAl+/+(A)和AnxAl-/-(B)小鼠的脾臟和淋巴結中的T細胞。20-24小時后，收集細胞上清液，并用ELISA分析上清液以得到IL-2的水平。顯示的數據來自單一實驗，并代表其它兩組有相似結果的實驗。圖9顯示了 VJ-4B6抑制抗-CD3-誘導的CD25/CD69上調。在所示濃度的VJ-4B6存在下，用包被在培養板上的抗-CD3 (I μ g/ml)刺激ΑηχΑ1+/+(Α)和ΑηχΑ1-/-(Β)小鼠的脾臟和淋巴結中的T細胞。18-20小時后，收集細胞，并用抗-⑶25FITC和抗-⑶69PE給細胞染色。用FACScalibur流式細胞儀獲得樣品并用FlowJo軟件分析樣品。顯示的數據來自單一實驗，并代表其它兩組有相似結果的實驗。圖10顯示了 VJ-4B6抑制抗-⑶3/⑶28-誘導的⑶25/⑶69上調。在所示濃度的VJ-4B6存在下，用包被在培養板上的抗-⑶3 (I μ g/ml)和抗-⑶28 (I μ g/ml)刺激AnxAl+/+(A)和ΑηχΑ1-/-(Β)小鼠的脾臟和淋巴結中的T細胞。18-20小時后，收集細胞，并用抗-⑶25FITC和抗-⑶69PE給細胞染色。用FACScalibur流式細胞儀獲得樣品并用FlowJo軟件分析樣品。顯示的數據來自單一實驗，并代表其它兩組有相似結果的實驗。圖11顯示了 VJ-4B6的輕鏈可變區的DNA和氨基酸序列。圖12顯示了 VJ-4B6的輕鏈可變區的氨基酸序列，并標注出了⑶Rs。突出了⑶R1，⑶R2，⑶R3和恒定區的起點。根據Kabat標準進行編號和⑶Rs的確定。圖13顯示了 VJ-4B6的重鏈可變區的DNA和氨基酸序列。圖14顯示了 VJ-4B6的重鏈可變區的氨基酸序列，并標注出了⑶Rs。突出了⑶R1，⑶R2，⑶R3和恒定區的起點。根據Kabat標準進行編號和⑶Rs的確定。在重鏈可變區中，殘基26-29雖然不是Kabat定義的高變區的一部分，卻是Chothia(Chothia andLesk, 1987)定義的 CDR 環的一部分。插入位置 52、52a、82、82a、82b、82c、100 和 IOOa 用52a, 82abc, IOOa 表不。圖15顯示了 VJ-4B6抑制EAE的發育。用CFA中的M0G35_55使C57BL/6小鼠免疫，并在以后的22天中每天進行監測，以獲得EAE信號。從免疫后的第6天開始，每六天給小鼠腹腔內注射 IOOng 的 IgG(A)或 5 (B)、50 (C) IOOng(D)的 VJ-4B6 (溶于 100 μ I 的 PBS 中)。結果表示為平均值 ±SEM(n=6/ 組)。*ρ〈0.05，_ρ〈0.001。圖16顯示了 VJ-4B6降低與EAE的發育相關的體重減少。用CFA中的M0G35_55使C57BL/6小鼠免疫，并在以后的22天中每天進行監測，以獲得體重的增加/減少。從免疫后的第6天開始，每六天給小鼠腹腔注射IOOng的IgG㈧或5 (B)、50 (C) IOOng(D)的VJ-4B6 (溶于 100 μ I 的 PBS 中)。結果表示為平均值 ± SEM (η=6/ 組)。*ρ〈0.05，_ρ〈0.001。圖17顯示的是VJ-4B6降低了 CIA的發育。用CFA中的牛科動物類型II膠原使DBA/1小鼠免疫。在初次免疫后的第21天，小鼠通過完全CFA中的200 μ g類型II膠原增強免疫(s.c.)，并在以后的2 0天中每天進行監測，以獲得疾病指征。從小鼠增強免疫的那天開始，每六天給小鼠腹腔注射IOOng的VJ-4B6 (溶于100 μ I的PBS中)。結果表示為平均值土 SEM (η=6/ 組)。_ρ〈0.001。實施例1-VJ-4B6特異性抑制含有膜聯蛋白_1的T細胞中的T細胞活化材料和方法小鼠(圖4Β、5、6、7、8、9和10中使用的小鼠)Balb/C 小鼠來自 B&K Universal (Grimston, England) AnxAl+小鼠來自發明人的實驗室，該小鼠在無菌條件下出生于B&K Universal。這些研究中使用的所有小鼠的年齡都在6-8周齡。動物實驗是根據英國內政部規定(Guidance on the Operation ofAnimals, Scientific Procedures Actl986)和歐洲聯盟條款的規定進行的。小鼠T細胞的提取(圖4B、5、6、7、8、9和10中使用的細胞)脾臟和淋巴結(腋窩淋巴結、腹股溝淋巴結和腸淋巴結)取自6至8周齡的小鼠，并如前人所述地用注射器柱塞和50 μ m細胞濾網(BD)使組織溫和降解而制備。用Ficoll將細胞懸液分層，以獲得單核細胞，然后收集細胞并用RPMI培養基(Gibco)洗滌。T細胞增殖試驗(圖5和圖6中的數據)將純化的淋巴結T細胞(IO5細胞/ml)在96孔板中用包被在培養板上的抗-CD3(克隆 145-2Cll;eBioscience)或抗-CD3 和抗-CD28 (克隆 37.51; eBioscience)刺激。18-20小時后，將培養物用I μ Ci的[3H]-胸昔(Amersham Pharmacia Biotech)脈沖12小時，并用自動閃爍計算器測量整合后的放射性。
IL-2的產生(圖7和圖8中的數據)將純化的淋巴結T細胞(IO5細胞/ml)在96孔板中用包被在培養板上的抗-CD3(克隆 145-2C11; eBioscience)或抗-CD3 和抗-CD28 (克隆 37.51; eBioscience)刺激。20-24小時后，收集培養上清液，并按照制造商的說明書使用鼠IL-2ELISA試劑盒(eBioscience)分析上清液，以得到IL_2的含量。流式細胞術分析(圖9和圖10)將細胞在FACS緩沖液(含有1%FCS和0.02%NaN2的PBS)中重懸。將淋巴細胞以IxlO6Ail的密度在ΙΟΟμ I的FACS緩沖液中染色，并用CellQuest 軟件(BectonDickinson)在FACScalibur流式細胞儀中捕獲。使用的抗體為抗-CD25FITC(克隆PC61, eBioscience)和PE-綴合的抗-CD69 (克隆H1.2F3)。在4 °C下將細胞在含有抗-CD16/32的FACS緩沖液中預培養30分鐘以排除非特異性結合，然后用合適濃度的綴合抗體在4°C標記30分鐘。標記后，洗滌并分析細胞。設定正向散射和側向散射以排除紅細胞和死細胞，每個樣品至少分析2X IO4個淋巴細胞。在所有實驗中，被染色的細胞都用FACScalibur流式細胞儀捕獲并用FlowJo軟件進行分析。用流式細胞術分析確認VJ-4B6 (圖4)將人類PBMC和PMN或小鼠的脾細胞和腹膜巨噬細胞先在含有4%多聚甲醛的FACS緩沖液中重懸10分鐘，隨后在含有4%多聚甲醛和0.02%皂苷的FACS緩沖液中重懸15分鐘。將細胞與50ng/ml的生物素化VJ-4B6在4°C培養12小時。然后用鏈霉親和素-FITC (稀釋度1:200eBioscience)將細胞在室溫下培養I小時。標記后，洗滌并分析細胞。設定正向散射和側向散射以排除紅細胞和死細胞，每個樣品至少分析2X IO4個淋巴細胞。在所有實驗中，被染色的細胞都用FACScalibur流式細胞儀捕獲并用Flowjo軟件進行分析。人類外周血白細胞(圖4A中使用的細胞)獻血者為20-35歲的健康男性和女性，他們的血液測試結果是HIV、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒均呈陰性。進一步篩選標準是在過去的四周里沒有經歷明顯的感染，發燒、過敏癥狀、異常的血液細胞計數、肝臟酶的增加或任何藥物治療。從健康的志愿者中收集新鮮的靜脈血，并將其立刻轉移到含有3.2%檸檬酸鈉的試管中(1:10稀釋)。然后，使用密度梯度法將細胞分離:將3ml的Ficoll Histopaque-10771置于3ml的FicollHistopaque-11911上層(都來源于Sigma)，以實現分層，并將6ml血液(用RPMI培養基1:1稀釋)置于Histopaques上層。在室溫下以1500RPM離心30分鐘后，使用無菌滴管將PBMCs和PMNs從合適的層中吸出，并用RPMI洗滌三次。統計分析所有的統計分析都是用Prism軟件進行的(GraphPad software)。所有的數值都用平均值土 SE表示。統計分析是通過Student’ s t檢驗或適當的單向ANOVA評估的。P〈0.05的概率被認為是顯著的。結果新的抗AnxAl抗體是由圖3A中所示的遺傳免疫方法產生的(GenovacGmbH, Germany)。測試了來自幾只被免疫小鼠的血清，并用AnxAlcDNA對三個IgG識別細胞的結果呈陽性的小鼠進行轉染。將這 些小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合以產生雜交瘤細胞。三個雜交瘤細胞克隆中僅有一個可以成功地被亞克隆和擴增。這些雜交瘤細胞被稱作VJ-4B6-E5-B10-D4。從雜交瘤細胞純化的IgG2b碎片識別轉染有AnxAlcDNA的細胞(圖3B，綠線；右手峰)，但不識別轉染有無關cDNA的細胞(圖3B，紅線；左手峰)。為了確認VJ-4B6的特異性，通過FACS分析已知表達不同蛋白水平的透化人類和小鼠細胞中的AnxAl表達。如圖4A所示，與人類PBMC相比，人類PMN的VJ-4B6染色結果是高度陽性的(圖4A，右手峰，分別為右欄和左欄)。這與先前觀察到(D’Acquisto et al,結果未公布)的PMN與PBMC相比顯著地表達更高的AnxAl水平是一致的。同樣地，與脾細胞相比，用VJ-4B6染色的小鼠巨噬細胞表現出更高的AnxAl表達水平(圖4B，右手峰，分別為右欄和左欄)。總體來說，這些結果顯示了 VJ-4B6可識別人類AnxAl和小鼠AnxAl。然后，測試了 VJ-4B6對T細胞活化的作用和特異性。為了這個目的，先用ΑηχΑ1+/+或AnxAl+小鼠的T細胞測量了 VJ-4B6對抗-CD3誘導細胞增殖的作用(以3H-胸苷整合的平均值為指標)。圖5顯示了 ΑηχΑΓ/+和AnxAl+的T細胞用抗-⑶3刺激后，3H-胸苷整合的增加(分別為圖5Α和圖5Β)。在刺激后的培養物中加入VJ-4B6引起了 ΑηχΑ1+/+的T細胞中3H-胸苷整合的濃度依賴性抑制，但對AnxAl+的T細胞中3H-胸苷整合沒有影響。用抗-⑶3和抗-⑶28刺激的T細胞也出現類似的結果(分別為圖6Α和·6Β)。為了進一步確認這些結果，測試了 VJ-4B6對T細胞活化的其它傳統標記即白細胞介素-2 (IL-2)的產生和⑶25/⑶69上調的作用。用抗-⑶3單獨刺激或用抗-⑶3和抗-⑶28刺激T細胞可產生大量的IL-2 (分別為圖7和圖8)。VJ-4B6的添加以濃度依賴性方式顯著地抑制了 ΑηχΑ1+/+Τ細胞中IL-2的產生，但對AnxAl+的T細胞中IL-2的產生沒有影響。對于⑶25/⑶69上調也得到了相似的結果。用抗-⑶3單獨刺激或用抗-⑶3和抗-⑶28刺激T細胞活化誘導⑶25/⑶69雙陽性T細胞的百分比顯著提高(分別為圖9和圖10中從左起第二欄)。在VJ-4B6存在下的刺激可以濃度依賴性方式顯著抑制ΑηχΑ1+/+Τ細胞中⑶25/⑶69的誘導，而不影響AnxAl+的T細胞中⑶25/⑶69的誘導。這些結果共同表明VJ-4B6顯著抑制T細胞增殖、IL_2的產生和由抗-⑶3或由抗-⑶3和抗-⑶28引起的信號誘導的⑶25/⑶69的上調。另外，由于在AnxAl+T細胞中它的作用消失，因此這種作用應特別地歸因于VJ-4B6與AnxAl的中和。這與發明人先前觀察到的活化的T細胞釋放合適的T細胞活化所需的內源性AnxAl+的結果相一致(D，Acquisto et al.，Bloodl09:1095-1102，2007;D，Acquisto et al., Eur.J.1mmunol.37:3131—3142，2007)。總之，這些數據表明VJ-4B6以濃度依賴性方式抑制了抗-⑶3誘導的⑶25和⑶69(T細胞活化的標記)的上調。在IL-2的產生和T細胞增殖上也觀察到了相似的抑制作用。更重要的是，在膜聯蛋白-1-缺乏的T細胞中沒有觀察到這種作用，這說明這種抑制是特異性的且抗體并沒有引起任何不利的毒性作用。實施例2-VJ-4B6的測序本實施例的目的是從雜交瘤細胞中克隆抗體重鏈和輕鏈可變區域的基因和確定互補決定區(⑶Rs)的DNA序列和定位以及其他特征。抗體可變區的克隆和測序利用Qiagen RNeasy迷你試劑盒(Cat No:74104)從I小瓶雜交瘤細胞中制備總RNA。用50 μ L水洗脫RNA并在1.2%瓊脂糖凝膠上檢查。Vh和VK(可變的kappa輕鏈)的cDNAs是用逆轉錄酶和IgG和kappa恒定區域的引物制備的。使用一大組信號序列引物，可通過PCR擴增出第一條鏈cDNAs。將擴增的DNAs用硅膠純化，并克隆到載體pGem T Easy (Promega)中。篩選得到的Vh和Vk的克隆以確定其中含有合適大小的插入物。通過自動DNA測序在兩個方向上測定選定克隆的DNA序列。參照其它抗體序列確定序列中互補決定區(⑶Rs)的定位(Kabat EA et al.，1991)。結果VJ-4B6 輕鏈 識別了單ー Vk序列。圖11顯示了 VJ-4B6Vk的DNA序列和推導出的氨基酸序列。圖12顯示了推導出的蛋白序列，并標注了 CDRs。兩個單獨擴增步驟中的九個克隆(七個是獨立的)得到了相同的V區域序列。由雜交瘤融合伴侶產生的非生產性的異常Vk序列也在多個克隆中出現，并且還有ー個序列中有缺失的克隆。VJ-4B6 重鏈識別了單ー Vh序列。圖13顯示了 VJ_4B6Vh的DNA序列和推導出的氨基酸序列。在九個單獨的克隆中發現了相同的V區域序列。有兩個克隆產生的序列中都有一個單堿基對的改變，有ー個克隆產生的序列中有ー個單堿基對的缺失和ー個單堿基對的改變，還有一個克隆產生的序列中有兩個單堿基對的改變。這五個單堿基對的變化中的每ー個僅發生在一個克隆中。剩下的五個克隆有相同的序列。圖14顯示了推導出的蛋白序列，并標注了CDRs。參考文獻Chothia C and Lesk AM.Canonical structures for the hypervariableregions of immunoglobulins.J Mol Biol.196:901-17,1987.
Kabat EAj Wu TTj Perry HMj Gottesman KSj Foeller C.Sequences of proteins ofImmunological Interest, US Department of Health and Human Services, 1991實施例3-VJ-4B6的體內免疫抑制作用為了測試VJ-4B6的體內免疫抑制作用，我們選擇了兩種傳統的免疫疾病模型:M0G33_55誘導的實驗性自身免疫性腦脊髄炎(EAE ;多發性硬化的小鼠模型)和膠原誘導的關節炎(CIA ;風濕性關節炎的小鼠模型)。方法實驗性自身免疫性腦脊髄炎。0天時用溶于PBS的300 y g的M0G35_55以及等體積的含有300 u g熱滅活的結核分枝桿菌(M.tuberculosis)H37Ra的CFA組成的300 U I的乳劑對小鼠進行皮下免疫。小鼠身體兩側均注射乳剤，然后在0天和2天時腹腔內注射溶于100 V-1生理鹽水中的百日咳桿菌毒素(B.pertussis toxin) (500ng/100 u I)。姆天觀察小鼠，以得到EAE指征和體重的減少量。將疾病嚴重性分為6個等級:0=沒有疾病；1=尾部部分遲緩；2=尾部全部遲緩；3=正位反射受損；4=局部后肢_瘓；5=全部后肢_瘓；6=動物瀕臨死亡或死亡。膠原誘導的關節炎。將乳化在弗氏完全佐劑(complete Freund’ s adjuvant)(CFA;Hooke labs)中的200 u g膠原類型II皮下注射到6_8只雄性DBA/1小鼠(8_12周大)的尾部。在初次免疫后的第21天，給小鼠皮下注射200 Ug用IFAOtooke labs)乳化的膠原類型II以增強免疫(s.c.)。使用兩種臨床參數監測小鼠的關節炎發病的指征，所述參數為爪腫脹和臨床評分。爪腫脹是通過用器官血量測量儀(plethysmometer)測量受影響的后爪的厚度來評估的。臨床評分是通過制造商推薦的標準(http://hookelabs.com/protocols/ciaInductionDBAl/ciaInduction_DBAl.html)評估的。將四肢進行分級，以得出12只動物中每只動物的最高可能得分。結果如前人所述(Paschalidiset al., J Neuroinflammation.2009; 6:33)地用M0G33_55/CFA對雄性C57/BL6小鼠進行免疫。從用M0G33_55/CFA免疫后的第六天開始，每六天給小鼠腹膜內(1.p.)注射 VJ-4B6(5、50 和 100ng/100 u I), IgG 對照(IOOng /yl)或PBS載體(對照)。如圖15所示，與對照小鼠相比，用5、50和IOOng的VJ-4B6處理的小鼠顯示出統計學上顯著的劑量依賴性減少的疾病指征(分別為圖15B、C和D)，然而，注射對照IgG卻沒有作用(圖15A)。每種治療的曲線下面積(AUC)和相對于對照(27.29AUC)的抑制百分比如下 JgGlOOng, 24.17AUC, 11.4% ；VJ-4B65ng, 15.04AUC，44.8% ；VJ-4B650ng,
5.87AUC,78.5% ；VJ-4B6100ng,7.04AUC,74.2%。對EAE動物模型的研究已經表明疾病的急性期與體重的減輕同步發生，這可能是由于食欲不振和流體攝入不足。處理過的小鼠的重量測量與臨床評分的嚴重度相關，并顯示了與對照小鼠相比從第18天開始的VJ-4B6處理過的小鼠中劑量依賴性減少的體重減輕，但是IgG處理過的小鼠則沒有這種現象(圖16)。為了確認治療潛在的V J-4B6作為體內免疫抑制劑，我們在Cl A模型中測試了它的作用。如前人所述地用CFA中的牛科動物類型II膠 原對雄性DBA/1小鼠進行免疫(D’Acquisto et al.，Blood.2007; 109 (3): 1095-102)。從注射膠原增強免疫那天開始，每六天給小鼠腹腔內注射VJ-4B6 (100ng/100 yl)或PBS載體(對照)。與針對EAE所得到的數據一致的是，與對照小鼠(AUC83.50)相比，注射VJ-4B6顯著地減少了(AUC26.75; 67.9%)疾病指征的發展(圖17)。
申請人:或代理人檔案號P49822W0/SJL "!國際申請號PCT/GB2011/000876關于微生物或其他生物材料保藏的說明(專利合作條約實施細則13之2)
權利要求
1.種特異性結合分子，該特異性結合分子針對具有圖2A所示的氨基酸序列的人類Anx-Al蛋白而產生。
2.種特異性結合分子，所述特異性結合分子具有如權利要求1所述的特異性結合分子的互補決定區(CDRs) VLCDRl、VLCDR2、VLCDR3、VHCDRl、VHCDR2 和 VHCDR3，或與每個各自的⑶Rs至少有70%同一性的氨基酸序列。
3.據權利要求2所述的特異性結合分子，所述特異性結合分子具有互補決定區(CDRs) VLCDRl、VLCDR2、VLCDR3、VHCDRl、VHCDR2 和 VHCDR3，每個互補決定區各自具有如下所述的氨基酸序列，其中VLCDRl 為 KASENVVTYVSVLCDR2 為 GASNRYTVLCDR3 為 GQGYSYPYTVHCDRl 為 GYTFTNYWIGVHCDR2 為 DIYPG⑶YTNYNEKFKG VHCDR3 為 WGLGYYFDY 或與它們具有至少70%同一性的氨基酸序列。
4.據權利要求1-3中任意一項所述的特異性結合分子，其中，所述特異性結合分子是抗體或該抗體的片段。
5.據權利要求4所述的特異性結合分子，其中，所述抗體是單克隆抗體。
6.據權利要求5所述的特異性結合分子，其中，所述單克隆抗體是人源化的。
7.據權利要求4所述的特異性結合分子，其中，所述片段為Fab、F(ab’)2或Fv片段或scFv分子。
8.據權利要求1-5和7中任意一項所述的特異性結合分子，所述特異性結合分子包括具有圖11和/或圖13所示的氨基酸序列的多肽。
9.據權利要求1-5中任意一項所述的特異性結合分子，所述特異性結合分子是由2010年6月3日保藏于歐洲細胞培養物保藏中心(ECACC)，登記號為N0.10060301的雜交瘤細胞系產生的。
10.種雜交瘤細胞系，所述雜交瘤細胞系產生針對具有圖2A所示的氨基酸序列的人類Anx-Al蛋白而產生的特異性結合分子。
11.據權利要求10所述的雜交瘤細胞系，所述雜交瘤細胞系是于2010年6月3日保藏于歐洲細胞培養物保藏中心(ECACC)，登記號為N0.10060301的雜交瘤細胞系。
12.種藥物組合物，所述藥物組合物包括如權利要求1-9中任意一項所述的特異性結合分子。
13.據權利要求12所述的藥物組合物，所述藥物組合物還包括另一種治療活性劑。
14.據權利要求1-9中任意一項所述的特異性結合分子，所述特異性結合分子用于藥物。
15.據權利要求1-9中任意一項所述的特異性結合分子，所述特異性結合分子用于治療T細胞介導的疾病。
16.據權利要求15所述的特異性結合分子，其中，所述T細胞介導的疾病選自由移植物抗宿主疾病、移植排斥、動脈粥樣硬化、HIV、AIDS、牛皮癬、流產和自身免疫疾病所組成的組。
17.據權利要求16所述的特異性結合分子，其中，所述自身免疫疾病選自由風濕性關節炎(RA)、多發性硬化癥(MS)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、艾迪生氏病、格雷夫斯病、硬皮癥、多肌炎、糖尿病、自身免疫性葡萄膜視網膜炎、潰瘍性結腸炎、尋常型天皰瘡、炎性腸病、自身免疫性甲狀腺炎、葡萄膜炎、貝賽特氏癥和舍格倫式綜合癥所組成的組。
18.據權利要求17所述的特異性結合分子，其中，所述自身免疫疾病選自由風濕性關節炎(RA)、多發性硬化癥(MS)和全身性紅斑狼瘡(SLE)所組成的組。
19.據權利要求18所述的特異性結合分子，其中，所述自身免疫疾病為風濕性關節炎(RA)或多發性硬化癥(MS)。
20.據權利要求16所述的特異性結合分子，其中，所述T細胞介導的疾病選自由動脈粥樣硬化、HIV、AIDS和牛皮癬所組成的組。
21.利要求1-9中任意一項所述的特異性結合分子在制備用于治療T細胞介導的疾病的藥物中的用途。
22.種在有需要的受試者中治療T細胞介導的疾病的方法，所述方法包括向所述受試者給藥權利要求1 -9中任意一項所述的特異性結合分子。
全文摘要
本發明提供一種特異性結合分子，該特異性結合分子針對具有圖2A所示的氨基酸序列的人類Anx-A1蛋白而產生。本發明還涉及這種特異性結合分子在治療T細胞介導的疾病中的用途。
文檔編號C07K16/18GK103097414SQ201180038556
公開日2013年5月8日 申請日期2011年6月9日 優先權日2010年6月9日
發明者F·達奎斯托, M·佩雷蒂 申請人:倫敦大學瑪麗皇后和威斯特-弗爾德學院