用于在丁醇生產中的提取發酵之前移除不溶解固體的方法和體系的制作方法

專利名稱：用于在丁醇生產中的提取發酵之前移除不溶解固體的方法和體系的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于在發酵醇如丁醇生產中從發酵罐進料流中移除不溶解固體的方法和體系。
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背景技術：
背景技術：
丁醇是一種重要的工業化學品，其具有多種用途，包括用作燃料添加劑，在塑料工業中用作化學原料，以及在食品和食用香料工業中用作食品級的提取劑。因此，高度地需要丁醇以及高效環保的生產方法。利用微生物發酵生產丁醇是一種這樣的環保生產方法。一些生產高生產能力丁醇的微生物也具有低的丁醇毒性閥值，使得當生產丁醇時需要從發酵罐中移除丁醇。當生產丁醇時，可使用原位產物移除(ISPR)從發酵罐中移除丁醇，從而使得微生物以高生產能力生產丁醇。用于本領域已經描述的ISPR的一種方法是液-液提取(美國專利公開申請公布2009/0305370)。為了技術和經濟上的可行性，液-液提取需要接觸提取劑和發酵液體培養基以高效傳質；提取劑從發酵液體培養基中相分離(在發酵期間及發酵之后)；和/或高效地可回收并再利用溶劑以及在長期運行期間最小化提取劑的降解和/或污染。當進入發酵罐的含水物流包含來自原料的不溶解固體時，因為不溶解固體增加資金和運行成本而妨礙了對技術和經濟上可行的液-液提取的上述需求。具體地講，在提取發酵期間存在的不溶解固體可降低發酵罐中的傳質系數，阻止發酵罐中的相分離，可引起來自提取劑中的不溶解固體的油(例如玉米油)積聚，導致提取效率隨時間降低，可提高溶劑損失，因為它與固體一起最后作為干酒糟及可溶物(Dried Distillers' Grains withSolubles, DDGS)被移除，可減緩提取劑液滴從發酵液體培養基中的分離，和/或可導致更低的發酵罐體積效率。因此，一直需要通過提取發酵開發用于生產產物醇如丁醇的更有效的方法和體系。本發明滿足了上述需要并提供了通過減少進料于發酵罐的不溶解固體量生產產物醇如丁醇的方法和體系。
發明概沭本發明涉及用于在發酵醇如丁醇生產中從發酵罐進料流中移除不溶解固體的方法和體系。本發明涉及的方法包括提供包含可發酵碳源、不溶解固體和水的生物質原料漿液；從所述漿液中分離所述不溶解固體的至少一部分，從而產生α)包含可發酵碳源的水溶液和(ii)包含固體的濕餅共產物；以及將所述水溶液加到在發酵容器中包含重組微生物的發酵液體培養基中，從而產生發酵產物；其中改善了所述生物質加工生產能力。在一些實施方案中，所述改善的生物質加工生產能力包括相對于在不溶解固體存在的情況下產生的發酵產物改善的發酵產物和共產物的可回收能力。在一些實施方案中，所述改善的生物質加工生產能力包括下列中的一個或多個提高的工藝流再循環能力、提高的發酵罐體積效率、以及提高的生物質原料負荷供給。在一些實施方案中，所述方法還包括使所述發酵液體培養基與提取劑接觸，其中所述提取劑相對于包含不溶解固體的發酵液體培養基具有提高的提取效率。在一些實施方案中，提高的提取效率包括下列中的一個或多個穩定的提取劑分配系數、增加的提取劑與發酵液體培養基的相分離、增加的液-液傳質系數、提高的提 取劑回收和再循環能力、以及用于回收和再循環的保存的提取劑。在一些實施方案中，所述提取劑是有機提取劑。在一些實施方案中，所述提取劑包括一種或多種不可混溶的有機提取劑，所述不可混溶的有機提取劑選自C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、C12-C22脂肪酰胺、以及它們的混合物。在一些實施方案中，所述提取劑包括來源于玉米油的C12-C22脂肪酸。在一些實施方案中，所述不溶解固體通過臥式螺旋-碟式離心、三相臥螺離心、盤疊式離心、過濾離心、潷析器離心、過濾、真空過濾、帶式過濾器、壓濾、使用篩網的過濾、篩分、柵濾、多孔柵濾、浮選、水力旋流器、壓濾器、螺旋壓榨器、重力沉降器、渦旋分離器、或它們的組合從原料漿液中分離。在一些實施方案中，所述方法還包括液化原料以產生生物質原料漿液的步驟；其中所述原料選自玉米粒、玉米棒、作物殘余物如玉米殼、玉米秸桿、草、玉米、小麥、黑麥、小麥秸桿、大麥、大麥秸桿、干草、稻桿、柳枝稷、廢紙、甘蔗渣、高粱、甘蔗、大豆、由谷物的研磨獲得的組分、纖維素材料、木質纖維素材料、樹、枝、根、葉、木片、木屑、灌木和灌叢、蔬菜、水果、花、動物糞肥、以及它們的混合物。在一些實施方案中，所述原料是玉米。在一些實施方案中，所述原料是分級的或未分級的。在一些實施方案中，所述原料是濕磨的或干磨的。在一些實施方案中，所述方法還包括在液化期間提高反應溫度的步驟。在一些實施方案中，所述原料漿液包含來自所述原料的油，并且從所述漿液中分離所述油。在一些實施方案中，所述濕餅包含原料油。在一些實施方案中，用水洗滌所述濕餅以回收存在于所述濕餅中的低聚糖。在一些實施方案中，將所述回收的低聚糖加到所述發酵容器中。在一些實施方案中，進一步加工所述濕餅以提供改善的共產物。在一些實施方案中，進一步加工所述共產物以形成動物飼料產品。在一些實施方案中，用溶劑洗滌所述濕餅以回收存在于所述濕餅中的油。在一些實施方案中，所述溶劑選自己烷、丁醇、異丁醇、異己烷、乙醇和石油餾分。在一些實施方案中，所述發酵產物是產物醇，所述產物醇選自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、以及它們的異構體。在一些實施方案中，所述重組微生物包含工程化的丁醇生物合成途徑。在一些實施方案中，所述方法還包括至少部分地蒸發所述發酵液體培養基和產物以及任選的CO2，其中產生蒸氣流，并且從所述蒸氣流中回收所述產物。在一些實施方案中，所述方法還包括使所述蒸氣流與吸收液相接觸，其中所述蒸氣流的至少一部分被吸收到所述吸收液相中；其中在所述蒸氣流被吸收到所述吸收液相中的開始的溫度大于在所述吸收液相不存在的情況下冷凝所述蒸氣流的開始的溫度。在一些實施方案中，所述蒸發和接觸步驟在真空條件下進行。在一些實施方案中，從所述漿液中分離所述不溶解固體的主要部分提供了所述發酵液體培養基的相對于包含不溶解固體的發酵液體培養基的更高的蒸氣壓。在一些實施方案中，所述更高的蒸氣壓提供更有效的蒸發產物回收。在一些實施方案中，所述更有效的蒸發產物回收包括下列中的一個或多個更低的資金投資，更小的蒸發、吸收、壓縮和冷卻設備，改善的傳質速率，更少的蒸發能量，以及更低的吸收劑流速。本發明也涉及生產丁醇的方法，所述方法包括提供原料；液化所述原料以產生原料漿液，其中所述原料漿液包含低聚糖、油和不溶解固體；從所述原料漿液中分離不溶解固體以產生(i)包含低聚糖的水溶液，( )包含不溶解固體的濕餅，和(iii)油相；在發酵罐中使所述水溶液與發酵液體培養基接觸；發酵所述發酵罐中的低聚糖以產生丁醇；以及當所述丁醇產生時，從所述發酵液體培養基中進行所述丁醇的原位移除，其中從所述原料漿液中移除所述不溶解固體提高所述丁醇生產的效率。在一些實施方案中，所述原料是玉
米，并且所述油是玉米油。在一些實施方案中，所述不溶解固體包括胚芽、纖維和谷蛋白。在一些實施方案中，所述方法還包括干磨所述原料。在一些實施方案中，所述玉米是未分級的。在一些實施方案中，所述不溶解固體通過臥式螺旋-碟式離心、三相臥螺離心、盤疊式離心、過濾離心、潷析器離心、過濾、真空過濾、帶式過濾器、壓濾、使用篩網的過濾、篩分、柵濾、多孔柵濾、浮選、水力旋流器、壓濾器、螺旋壓榨器、重力沉降器、渦旋分離器、或它們的組合進行分離。在一些實施方案中，從所述原料漿液中分離不溶解固體的步驟包括離心所述原料漿液。在一些實施方案中，離心所述原料漿液將所述原料分離成包含所述水溶液的第一液相、包含所述濕餅的固相、以及包含所述油的第二液相。在一些實施方案中，用水洗滌所述濕餅以回收存在于所述濕餅中的低聚糖。在一些實施方案中，所述原位移除包括液-液提取。在一些實施方案中，用于所述液-液提取的提取劑是有機提取劑。在一些實施方案中，糖化所述水溶液中的低聚糖與發酵所述發酵罐中的低聚糖同時發生。在一些實施方案中，所述方法還包括在液化期間提高反應溫度的步驟。在一些實施方案中，所述方法還包括在發酵所述發酵罐中的低聚糖之前糖化所述低聚糖。在一些實施方案中，從所述原料漿液中移除不溶解固體的步驟包括離心所述原料漿液。在一些實施方案中，在糖化所述糖之前離心所述原料漿液。在一些實施方案中，所述發酵液體培養基包含重組微生物，所述重組微生物包含丁醇生物合成途徑。在一些實施方案中，所述丁醇是異丁醇。在一些實施方案中，從所述原料漿液中移除不溶解固體的步驟通過提高所述丁醇從所述發酵液體培養基到所述提取劑的液-液傳質系數而提高所述丁醇生產的效率；通過提高所述丁醇用提取劑的提取效率而提高所述丁醇生產的效率；通過提高所述發酵液體培養基和提取劑之間的相分離速率而提高所述丁醇生產的效率；通過提高提取劑的回收和再循環而提高所述丁醇生產的效率；或通過降低提取劑的流速而提高所述丁醇生產的效率。本發明也涉及生產丁醇的體系，所述體系包括被構造成液化原料以產生原料漿液的液化容器，所述液化容器包括用于接納所述原料的入口 ；和用于排出原料漿液的出口，其中所述原料漿液包含糖和不溶解固體；離心機，其被構造成從所述原料漿液中移除所述不溶解固體以產生(i)包含所述糖的水溶液和(ii)包含所述不溶解固體部分的濕餅，所述離心機包括用于接納所述原料漿液的入口 ；用于排出所述水溶液的第一出口 ；用于排出所述濕餅的第二出口 ；和被構造成發酵所述水溶液以產生丁醇的發酵罐，所述發酵罐包括用于接納所述水溶液的第一入口 ；用于接納提取劑的第二入口 ；用于排出所述富含丁醇的提取劑的第一出口 ；用于排出發酵液體培養基的第二出口。在一些實施方案中，所述離心機還包括用于排出油的第三出口，所述油是在從所述原料漿液中移除所述不溶解固體時產生的。在一些實施方案中，所述設備還包括被構造成糖化所述原料漿液中的糖的糖化容器，所述糖化容器包括用于接納所述原料漿液的入口 ；和用于排出所述原料漿液的出口。在一些實施方案中，所述設備還包括被構造成糖化所述水溶液中的糖的糖化容器，所述糖化容器包括用于接納所述水溶液的入口 ；和用于排出所述水溶液的出口。在一些實施方案中，所述設備還包括被構造成碾磨所述原料的干磨機，所述干磨機包括用于接納所述原料的入口 ；和用于排出經碾磨的原料的出口。本發明還涉及組合物，其包含20-35重量％的粗蛋白、1-20重量％的粗脂肪、0_5重量％的甘油三酯、4-10重量％的脂肪酸和2-6重量％的脂肪酸異丁酯。本發明還涉及組合物，其包含25-31重量％的粗蛋白、6-10重量％的粗脂肪、4-8重量％的甘油三酯、0_2重 量％的脂肪酸和1-3重量％的脂肪酸異丁酯。本發明還涉及組合物，其包含20-35重量％的粗蛋白、1-20重量％的粗脂肪、0-5重量％的甘油三酯、4-10重量％的脂肪酸和2-6重量％的脂肪酸異丁酯。本發明還涉及組合物，其包含26-34重量％的粗蛋白、15-25重量％的粗脂肪、12-20重量％的甘油三酯、1-2重量％的脂肪酸、2-4重量％的脂肪酸異丁酯、1-2重量％的賴氨酸、11-23重量％的冊？和5-11重量％的ADF。在一些實施方案中，所述方法包括(a)提供包含可發酵碳和來自所述生物質的不溶解固體以及水的原料漿液；(b)從所述漿液中分離所述不溶解固體的主要部分，從而產生(i)包含可發酵碳的水溶液和(ii)包含固體的濕餅共產物；以及(C)將所述水溶液加到在發酵容器中包含重組微生物的發酵液體培養基中，從而產生發酵產物；其中改善了所述生物質加工生產能力。在一些實施方案中，所述改善的生物質加工生產能力包括相對于在不溶解固體存在的情況下產生的發酵產物改善的發酵產物和共產物的可回收能力。在一些實施方案中，所述改善的生物質加工生產能力包括下列中的一個或多個提高的工藝流再循環能力、提聞的發酵te體積效率、以及提聞的玉米負荷供給。在一些實施方案中，提聞的工藝流再循環能力包括一個或多個發酵重組微生物循環、水循環和能量效率。在一些實施方案中，所述方法還可包括(d)使(C)的發酵液體培養基與提取劑接觸，其中所述提取劑相對于包含不溶解固體的發酵液體培養基具有提高的提取效率。在一些實施方案中，提高的提取效率包括下列中的一個或多個穩定的分配系數、增加的相分離、增加的傳質系數、以及提高的工藝流再循環能力。在一些實施方案中，提高的提取效率包括下列中的一個或多個穩定的提取劑分配系數、增加的提取劑與發酵液體培養基的相分離、增加的液-液傳質系數、以及提高的提取劑回收和再循環能力。在一些實施方案中，提高的提取效率包括用于再循環的保存的提取劑。在一些實施方案中，所述水溶液具有小于約20cps的粘度。在一些實施方案中，所述水溶液包含小于約20g/L的單體葡萄糖。在一些實施方案中，所述改善的產物可回收能力為產物提供改善的重組微生物耐受性。在一些實施方案中，所述改善的耐受性通過下列中的一個或多個提供移除抑制劑與不溶解固體或提高液-液傳質系數。在一些實施方案中，所述改善的提取劑效率提供改善的重組微生物耐受性。在一些實施方案中，所述改善的重組微生物耐受性通過提取抑制劑、副產物和代謝物提供。在一些實施方案中，原料漿液包含來自原料的油，并且從步驟(b)中的漿液中分離所述油。在一些實施方案中，所述濕餅包含的原料油的量小于約20%的濕餅干固體含量。在一些實施方案中，從步驟(b)的原料漿液中分離的不溶解固體的主要部分為按重量計至少約75%的不溶解固體。在一些實施方案中，從步驟(b)的原料漿液中分離的不溶解固體的主要部分為按重量計至少約90%的不溶解固體。在一些實施方案中，從步驟(b)的原料漿液中分離的不溶解固體的主要部分為按重量計至少約95%的不溶解固體。在一些實施方案中，步驟(b)包括離心所述原料漿液。在一些實施方案中，離心所述原料漿液將所述原料分離成包含所述水溶液的第一液相、以及包含所述濕餅的固相。在一些實施方案中，用水洗滌所述濕餅以回收存在于所述濕餅中的糖或糖源。在一些實施方案中，所述包含水溶液的液相被離心超過一次。在一些實施方案中，所述提取劑是有機提取劑。在一些實施方案中，所述提取劑·包括一種或多種不可混溶的有機提取劑，所述不可混溶的有機提取劑選自C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、C12-C22脂肪酰胺、以及它們的混合物。在一些實施方案中，所述發酵重組微生物是細菌或酵母細胞。在一些實施方案中，所述產物是產物醇，所述產物醇選自丁醇及其異構體。在一些實施方案中，所述方法還包括(d)至少部分地蒸發所述發酵液體培養基和(C)的產物以及任選的CO2，其中產生蒸氣流，并且從所述蒸氣流中回收所述產物。在一些實施方案中，所述方法還包括使蒸氣流與吸收液相接觸，其中所述蒸氣流的至少一部分被吸收到所述吸收液相中，其中在所述蒸氣流被吸收到所述吸收液相中的開始的溫度大于在所述吸收液相不存在的情況下冷凝所述蒸氣流的開始的溫度。在一些實施方案中，所述蒸發和接觸步驟在真空條件下進行。在一些實施方案中，從所述漿液中分離所述不溶解固體的主要部分可提供所述發酵液體培養基的相對于包含不溶解固體的發酵液體培養基的更高的蒸氣壓。在一些實施方案中，所述更高的蒸氣壓提供更有效的蒸發產物回收。在一些實施方案中，所述更有效的蒸發產物回收包括下列中的一個或多個更低的資金投資，更小的蒸發、吸收、壓縮和冷卻設備，改善的傳質速率，更少的蒸發能量，以及更低的吸收劑流速。在一些實施方案中，分離不溶解固體的主要部分以使不溶解固體的淀粉損失最小化。在一些實施方案中，通過進行一個或多個最優化操作最小化淀粉損失，所述最優化操作包括控制溫度、酶濃度、pH、玉米粉粒度和液化期間的反應時間；離心操作條件；和濕餅洗滌條件。在一些實施方案中，進一步加工所述濕餅以提供改善的共產物。在一些實施方案中，將所述共產物進一步加工成DDGS。在一些實施方案中，所述DDGS具有改善的產物特征，其包含相對于在不溶解固體存在的情況下產生的DDGS更少的原料油。在一些實施方案中，所述DDGS具有改善的產物特征，使得所述DDGS的生產具有與發酵液體培養基、重組微生物、發酵產物、和提取劑最少的接觸污染。在一些實施方案中，通過上述方法產生的DDGS符合有機動物飼料的膳食標簽要求。在一些實施方案中，發酵液體培養基包括發酵產物部分和玉米油部分，其比率為按重量計至少約4 1，其中所述液體培養基基本上不含不溶解固體。在一些實施方案中，所述玉米油部分包含至少約15重量％的游離脂肪酸。在一些實施方案中，所述發酵液體培養基包含按重量計不超過約15%的不溶解固體。在一些實施方案中，所述發酵液體培養基包含按重量計不超過約10%的不溶解固體。在一些實施方案中，所述發酵液體培養基包含按重量計不超過約5%的不溶解固體。在一些實施方案中，離心產物特征包括一層不溶解固體、一個玉米油層和一個包含可發酵糖的上清液層，其中在上清液層中的可發酵糖對不溶解固體層中的不溶解固體的重量比在約2 I至約5 I的范圍內；在上清液層中的可發酵糖對玉米油層中的玉米油的重量比在約10 I至約50 I的范圍內；并且在不溶解固體層中的不溶解固體對玉米油層中的玉米油的重量比在約2 I至約25 I的范圍內。在一些實施方案中，生產丁醇的方法包括以下步驟(a)提供玉米原料；(b)液化所述玉米原料以產生原料漿液，其中所述原料漿液包含糖、玉米油和不溶解固體；(c)從所 述原料漿液中移除不溶解固體以產生(i)包含糖的水溶液，(ii)包含不溶解固體的濕餅，和(iii)游離玉米油相；(d)在發酵罐中使所述水溶液與液體培養基接觸；(e)使所述發酵罐中的糖發酵以產生丁醇；以及(f)當所述丁醇產生時，從所述液體培養基中進行所述丁醇的原位移除，其中從所述原料漿液中移除所述不溶解固體提高所述丁醇生產的效率。在一些實施方案中，不溶解固體包括胚芽、纖維和谷蛋白。在一些實施方案中，所述方法還包括干磨玉米原料。在一些實施方案中，所述玉米是未分級的。在一些實施方案中，步驟(C)包括離心所述原料漿液。在一些實施方案中，離心所述原料漿液將所述原料漿液分離成包含所述水溶液的第一液相、包含所述濕餅的固相、以及包含所述游離玉米油的第二液相。在一些實施方案中，用水洗滌所述濕餅以回收存在于所述濕餅中的糖。在一些實施方案中，所述包含水溶液的液相被離心超過一次。在一些實施方案中，從步驟(c)的原料漿液中移除按重量計至少約75%的不溶解固體。在一些實施方案中，從步驟(c)的原料漿液中移除按重量計至少約90%的不溶解固體。在一些實施方案中，從步驟(c)的原料漿液中移除按重量計至少約95%的不溶解固體。在一些實施方案中，所述原位移除包括液-液提取。在一些實施方案中，用于所述液-液提取的提取劑是有機提取劑。在一些實施方案中，所述有機提取劑包括油醇。在一些實施方案中，所述液體培養基包含微生物。在一些實施方案中，所述微生物是細菌或酵母細胞。在一些實施方案中，一部分液體培養基流出發酵罐并且所述方法還包括從中分離存在于液體培養基部分中的酵母并將分離的酵母返送回發酵罐中。在一些實施方案中，部分液體培養基包含存在于原料漿液中的按重量計不超過約25%的不溶解固體。在一些實施方案中，部分液體培養基包含存在于原料漿液中的按重量計不超過約10%的不溶解固體。在一些實施方案中，部分液體培養基包含存在于原料漿液中的按重量計不超過約5 %的不溶解固體。在一些實施方案中，糖化所述水溶液中的糖與發酵所述發酵罐中的糖同時發生。在一些實施方案中，所述方法還包括在發酵所述發酵罐中的糖之前糖化所述糖。在一些實施方案中，步驟(C)包括離心所述原料漿液。在一些實施方案中，離心所述原料漿液發生在糖化所述糖之前。在一些實施方案中，離心所述原料漿液發生在糖化所述糖之后。
在一些實施方案中，所述丁醇是異丁醇。在一些實施方案中，步驟(C)通過提高所述丁醇從所述液體培養基到所述提取劑的液-液傳質系數而提高所述丁醇生產的效率。在一些實施方案中，步驟(C)通過提高所述丁醇用提取劑的提取效率而提高所述丁醇生產的效率。在一些實施方案中，步驟(C)通過提高所述液體培養基和提取劑之間的相分離速率而提高所述丁醇生產的效率。在一些實施方案中，步驟(C)通過提高提取劑的回收和再循環而提高所述丁醇生產的效率。在一些實施方案中，步驟(C)通過降低提取劑的流速而提高所述丁醇生產的效率。在一些實施方案中，步驟(C)包括下列中的一個或多個穩定的提取劑分配系數、提聞的發酵te體積頻率、提聞的玉米負荷供給、提聞的發酵重組微生物再循環、提聞的水的再循環、提高的能量效率、改善的重組微生物對丁醇的耐受性、降低的水相滴度、以及改善的DDGS價值。在一些實施方案中，生產丁醇的體系包括(a)被構造成液化原料以產生原料漿液的液化容器，所述液化容器包括用于接納所述原料的入口，用于排出原料漿液的出口，·其中所述原料漿液包含糖和不溶解固體；(b)離心機，其被構造成從所述原料漿液中移除所述不溶解固體以產生(i)包含所述糖的水溶液和(ii)包含所述不溶解固體部分的濕餅，所述離心機包括用于接納所述原料漿液的入口，用于排出所述水溶液的第一出口，和用于排出所述濕餅的第二出口 ；和(c)用于發酵所述發酵罐中的水溶液以產生丁醇的發酵罐，所述發酵罐包括用于接納所述水溶液的第一入口，用于接納提取劑的第二入口，以及用于排出所述富含丁醇的提取劑的第一出口，和用于排出發酵液體培養基的第二出口。在一些實施方案中，所述離心機還包括用于排出油的第三出口，所述油是在從所述原料漿液中移除所述不溶解固體時產生的。在一些實施方案中，所述體系還包括被構造成糖化所述原料漿液中的糖的糖化容器，所述糖化容器包括用于接納所述原料漿液的入口，和用于排出所述原料漿液的出口。在一些實施方案中，所述體系還包括被構造成糖化所述水溶液中的糖的糖化容器，所述糖化容器包括用于接納所述水溶液的入口和用于排出所述水溶液的出口。在一些實施方案中，所述體系還包括被構造成碾磨所述原料的干磨機，所述干磨機包括用于接納所述原料的入口，和用于排出經碾磨的原料的出口。在一些實施方案中，在離心機中從玉米醪漿液中形成的濕餅(其中所述濕餅包含不溶解固體)包括存在于玉米醪漿液中的按重量計至少約75%的不溶解固體。在一些實施方案中，所述濕餅包括存在于玉米醪漿液中的按重量計至少約90%的不溶解固體。在一些實施方案中，所述濕餅包括存在于玉米醪漿液中的按重量計至少約95%的不溶解固體。在一些實施方案中，在離心機中從玉米醪漿液中形成的水溶液(其中所述水溶液包含不溶解固體)包括存在于玉米醪漿液中的按重量計不超過約25%的不溶解固體。在一些實施方案中，所述水溶液包括存在于玉米醪漿液中的按重量計不超過約10%的不溶解固體。在一些實施方案中，所述水溶液包括存在于玉米醪漿液中的按重量計不超過約5 %的不溶解固體。附圖簡述并入本文并成為說明書的一部分的附圖示出了本發明并且與說明書一起進一步解釋本發明的原理并使得本領域的技術人員能夠利用本發明。圖I圖示了本發明的示例性方法和體系，其中不溶解固體在液化后并且在發酵之前從離心機中移除。圖2圖示了本發明示例性的替代方法和體系，其中原料被碾磨。圖3圖示了本發明另一個示例性的替代方法和體系，其中所述離心機排出油流。圖4圖示了本發明另一個示例性的替代方法和體系，其中將糖化容器置于離心機和發酵罐之間。 圖5圖示了本發明另一個示例性的替代方法和體系，其中將糖化容器置于液化容器和離心機之間。圖6圖示了本發明另一個示例性的替代方法和體系，其中利用兩個連續離心機移除不溶解固體。圖7示出了存在的不溶解玉米醪固體對總體積傳質系數kp的效應，該傳質系數用于將i-BuOH從液化玉米淀粉(即，低聚糖)的水溶液傳送到油醇液滴的分散體中，所述液滴當使用具有2. 03mm內徑的噴嘴分散油醇時流經鼓泡塔反應器。圖8示出了存在的不溶解玉米醪固體對總體積傳質系數ha的效應，該傳質系數用于將i-BuOH從液化玉米淀粉(即，低聚糖)的水溶液傳送到油醇液滴的分散體中，所述液滴當使用具有O. 76mm內徑的噴嘴分散油醇時流經鼓泡塔反應器。圖9示出了發酵樣品管中根據(重力)沉降時間的液-液界面的位置。相分離數據示出運行時間5. 3小時、29. 3小時、53. 3小時和70. 3小時的運行時間。來自提取發酵的樣品數據，其中從醪進料中移除固體，并且OA是溶劑(2010Y035)。

圖10示出了最終液體培養基中根據(重力)沉降時間的液-液界面的位置。來自提取發酵的數據，其中從醪進料中移除固體，并且OA是溶劑(2010Y035)。圖11示出了根據批次I和批次2時間的漿液水相中的葡萄糖濃度。圖12示出了根據批次3和批次4時間的漿液水相中的葡萄糖濃度。圖13示出了酶負荷和在液化期間某些時段施用+/_高溫階段對淀粉轉化的效應。發明詳述除非另行定義，否則本文所用的所有科技術語的含義與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的一樣。如發生矛盾，以本專利申請(包括其定義)為準。此外，除非上下文另有所需，單數術語將包括復數并且復數術語將包括單數。為所有目的，所有的出版物、專利、以及本文提及的其它參考資料均全文以引用方式并入本文。為了進一步限定本發明，本文提供了以下術語和定義。如本文所用，術語“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或它們的任何其它變型將被理解為是指包括指定的整數或整數組但不排除任何其它整數或整數組。例如，包含一系列元素的組合物、混合物、工藝、方法、制品或設備不必僅限于那些元素，而可以包括其它未明確列出的元素，或此類組合物、混合物、工藝、方法、制品或設備固有的元素。此外，除非另外特別說明，否則“或”是指包含性的或，而不是指排他性的或。例如，以下任何一個均表示滿足條件A或B :A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。同樣，涉及元素或組分實例(即次數)的數目在本發明元素或組分前的不定冠詞“一個”或“一種”旨在是非限制性的。因此，應將“一個”或“一種”理解為包括一個或至少一個，并且元素或組分的詞語單數形式也包括復數指代，除非有數字明顯表示單數。
如本文所用，術語“發明”或“本發明”為非限制性術語，并且不旨在意指本發明的任何單獨實施方案，而是涵蓋如專利申請所述的所有可能的實施方案。如本文所用，修飾本發明的成分或反應物的量使用的術語“約”是指可以通過例如以下方式而發生的用數字表示的量的變化在真實世界中用于產生濃縮物或溶液的一般測量和液體處理操作；通過這些操作中非故意的誤差；用于制備組合物或執行方法的成分的制造、來源或純度中的差異；等。術語“約”還包括由于產生自特定起始混合物的組合物的不同平衡條件而不同的量。無論是否通過術語“約”來修飾，權利要求包括量的等同量。在一個實施方案中，術語“約”指在報告數值的10%范圍內，或者在報告數值的5%范圍內。如本文所用，“生物質”指包含可水解多糖的天然產物，所述多糖提供可發酵糖，包括來源于天然來源如玉米、甘蔗、小麥、纖維素或木質纖維素材料以及包含纖維素、半纖維素、木質素、淀粉、低聚糖、二糖和/或單糖、以及它們的混合物的材料的任何糖和淀粉。生物質也可包含附加組分如蛋白質和/或脂質。生物質可來源于單一來源，或者生物質可包括來源于一種以上來源的混合物。例如，生物質可包括玉米棒和玉米秸桿的混合物，或草和 葉的混合物。生物質包括但不限于生物能作物、農業殘余物、市政固體垃圾、工業固體垃圾、來自造紙業的淤渣、庭院垃圾、木材和林業垃圾。生物質的實例包括但不限于玉米粒、玉米棒、作物殘余物如玉米殼、玉米秸桿、草、小麥、黑麥、小麥秸桿、大麥、大麥秸桿、干草、稻桿、柳枝稷、廢紙、甘蔗渣、高粱、甘蔗、大豆、由谷物的研磨獲得的組分、樹、枝、根、葉、木片、木屑、灌木和灌叢、蔬菜、水果、花、動物糞肥、以及它們的混合物。例如，可通過本領域已知的任何加工方法，利用發酵加工生物質以從生物質中形成麥芽漿、果汁、糖蜜或水解產物，所述方法例如研磨、處理和/或液化，并且它們包含可發酵糖并可包含水。例如，可通過本領域技術人員已知的任何方法來加工纖維素和/或木質纖維素生物質以獲得包含可發酵糖的水解產物。在美國專利公開申請公布2007/0031918A1中公開了低氨預處理，該專利申請以引用方式并入本文。纖維素和/或木質纖維素生物質的酶促糖化通常利用酶聚生體來降解纖維素和半纖維素以產生包含糖的水解產物，所述糖包括葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。(適用于纖維素和/或木質纖維素生物質的糖化酶參見Lynd等人(Microbiol. Mol. Biol.Rev. 66 :506-577,2002)。如本文所用，干酒糟及可溶物(DriedDistillers ' Grains with Solubles,DDGS)指來自原料或生物質發酵的共產物或副產物(例如發酵谷物或谷物混合物產生產物醇)。在一些實施方案中，DDGS也可指由產物醇(例如丁醇、異丁醇等)制備方法產生的動物飼料。如本文所用，“可發酵的碳源”或“可發酵的碳底物”是指能被微生物代謝的碳源。適宜的可發酵碳源包括但不限于單糖，如葡萄糖或果糖；二糖，如乳糖或蔗糖；低聚糖；多糖，如淀粉或纖維素；一碳底物；以及它們的混合物。如本文所用，“可發酵糖”是指能夠由本文所公開的微生物代謝以產生發酵醇的一種或多種糖。如本文所用，“原料”是指發酵過程中的原料，所述原料包含具有或不具有不溶固體的可發酵碳源，并且如果適用，所述原料在通過進一步加工(例如通過液化、糖化、或其它方法)已經從淀粉中釋放可發酵碳源或從復糖降解中獲取可發酵碳源之前或之后包含可發酵碳源。原料包括或來源于生物質。合適的原料包括但不限于黑麥、小麥、玉米、玉米醪、甘蔗、甘蔗醪、大麥、纖維素材料、木質纖維素材料、或它們的混合物。至于“原料油，”應當理解該術語涵蓋由給定原料產生的油。如本文所用，“發酵液體培養基”是指水、糖(可發酵碳源)、液化固體、任選地微生物產生的醇、產物醇及發酵容器內具有的所有其它物質組分的混合物，其中產物醇通過在微生物存在的情況下使糖反應生成醇、水和二氧化碳(CO2)而制得。有時，如本文所用，術語“發酵培養基”和“發酵混合物”可與“發酵液體培養基”同義使用。如本文所用，“發酵容器”是指其中進行發酵反應的容器，產物醇如丁醇通過發酵反應由糖制備。本文中術語“發酵罐”可與“發酵容器”同義使用。如本文所用，“糖化容器”指其中進行糖化(即，將低聚糖降解成單糖)的容器。在發酵和糖化同時發生的情況下，所述糖化容器和發酵容器可為相同容器。如本文所用，“糖化酶”指能夠水解多糖和/或低聚糖例如糖原或淀粉的α -I,4-糖苷鍵的一種或多種酶。糖化酶也可包括能夠水解纖維素或木質纖維素材料的酶。
如本文所用，“液化容器”指其中進行液化的容器。液化是其中低聚糖從原料中釋放出來的過程。在其中原料是玉米的實施方案中，低聚糖在液化期間從玉米淀粉內容物中釋放出來。如本文所用，“糖”指低聚糖、二糖、單糖、和/或它們的混合物。術語“糖類”也包括碳水化合物，包括淀粉、右旋糖苷、糖原、纖維素、戊聚糖、以及糖。如本文所用，“不溶解固體”指原料的不可發酵部分，其不溶解在液相中，例如胚芽、纖維和谷蛋白。例如，原料的不可發酵部分包括保持固體狀態并且能夠從發酵液體培養基中吸收液體的原料部分。如本文所用，“提取劑”指用于提取任何丁醇異構體的有機溶劑。如本文所用，“原位產物移除(ISPR) ”指從諸如發酵的生物過程中，當產物生成時選擇性移出具體的發酵產物以控制生物過程中的產物濃度。如本文所用，“產物醇”指在發酵過程中能夠由微生物產生的任何醇，所述微生物利用生物質作為可發酵碳底物的來源。產物醇包括但不限于C1-C8烷醇。在一些實施方案中，產物醇為C2-C8烷醇。在其他實施方案中，產物醇為C2-C5烷醇。應當理解，C1-C8烷醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇。同樣地，C2-C8烷醇包括但不限于乙醇、丙醇、丁醇和戊醇。“醇”在本文中也用于指產物醇。如本文所用，“丁醇”特指以單獨或其混合物形式的丁醇異構體I- 丁醇(I-BuOH)、
2-丁醇(2-BuOH)、叔丁醇(叔-BuOH)、和 / 或異丁醇(iBuOH、i-BuOH 或 I-BU0H)。如本文所用，“丙醇”指丙醇異構體異丙醇或I-丙醇。如本文所用，“戊醇”指戊醇異構體I-戊醇、3-甲基-I- 丁醇、2-甲基-I- 丁醇、2，
2-二甲基-I-丙醇、3-戊醇、2-戊醇、3-甲基-2-丁醇、或2-甲基-2-丁醇。如本文所用，術語“水相滴度”是指發酵液體培養基中特定醇(例如丁醇)的濃度。如本文所用，術語“有效滴度”指每升發酵培養基發酵產生的特定醇(例如丁醇)總量或醇酯化產生的醇酯的當量醇。術語“與水不混溶的”或“不溶解的”是指化學組分如提取劑或溶劑不能夠以形成
單一液相的形式與水溶液如發酵液體培養基混合。如本文所用，術語“水相”是指通過使發酵液體培養基接觸與水不混溶的有機提取劑而獲得的兩相混合物中的水相。在本文所述包括發酵提取的方法的一個實施方案中，術語“發酵液體培養基”具體地指在雙相發酵提取中的水相。如本文所用，術語“有機相”是指通過使發酵液體培養基接觸與水不混溶的有機提取劑而獲得的兩相混合物中的非水相。本發明提供通過發酵生產發酵產物如產物醇以及提高生物質加工生產能力和成本效果的體系和方法。在一些實施方案中，產物醇為丁醇。可液化原料以產生原料漿液，其中原料漿液包括可液化的糖和不溶解固體。如果將原料漿液直接進料于發酵罐，所述不溶解固體可妨礙從發酵罐中有效地移除并回收產物醇如丁醇。具體地講，當利用液-液提取從發酵液體培養基中提取丁醇時，存在的不溶解顆粒可通過妨礙提取劑和發酵液體培養基間的接觸引起體系失效，包括但不限于降低丁醇到提取劑的傳質速率；在發酵罐中產生乳液并從而妨礙提取劑和發酵液體培養基的良好相分離；降低提取劑的回收和再利用效率， 因為至少一部分提取劑和丁醇被“捕集”在固體中，它們最后作為干酒糟及可溶物(DriedDistillers' Grains with Solubles, DDGS)被移除；降低發酵罐體積效率,因為固體占據發酵罐的體積并且因為提取劑從發酵液體培養基中分離更慢；以及通過污染玉米油縮短提取劑的循環壽命。所有這些效應導致更高的資金和運行成本。此外，被“捕集”在DDGS中的提取劑可降低作為動物飼料銷售的DDGS的價值和資質。因此，為了避免和/或最小化這些問題，在將原料漿液中存在的糖加入發酵罐之前從原料漿液中移除至少一部分不溶解顆粒(或固體)。相對于對包含其中尚未移除不溶解顆粒的水溶液的發酵液體培養基進行的提取，當對包含其中已經移除了不溶解顆粒的水溶液的發酵液體培養基進行提取時，提取活性和丁醇生產效率提高。本發明的體系和方法將根據所述圖進行描述。在一些實施方案中，例如如圖I所示，所述體系包括液化容器10，它被構造成液化原料以產生原料衆液。具體地講，可將原料12導入液化容器10的入口。原料12可為工業中已知的任何合適的生物質材料，包括但不限于黑麥、小麥、甘蔗、或玉米，它們包含可發酵碳源如淀粉。液化原料12的方法涉及將原料12中的淀粉水解成水溶性糖，并且它是一種常規方法。可使用工業上通常利用的任何已知的液化方法以及相應的液化容器，包括但不限于酸方法、酸-酶方法、或酶方法。可單獨或組合使用此類方法。在一些實施方案中，可利用所述酶方法并且可將適用的酶14例如α-淀粉酶導入液化容器10的入口。也可將水導入液化容器10。液化原料12的方法產生原料漿液16，其包括來自原料或生物質的糖(例如可發酵碳)和不溶解固體。不溶解固體是原料12的不可發酵部分。在一些實施方案中，原料12可為玉米，例如干磨的、未分級的玉米籽粒，并且不溶解的顆粒可包括胚芽、纖維和谷蛋白。原料漿液16可從液化容器10的出口排出。在一些實施方案中，原料12是玉米或玉米籽粒，并且原料漿液16是玉米醪漿液。離心機20被構造成從原料漿液16中移除不溶解固體，它具有用于接納原料漿液16的入口。離心機20攪拌或旋轉原料漿液16以產生液相或水溶液22和固相或濕餅24。水溶液22可包括糖例如低聚糖形式的糖、以及水。水溶液可包含按重量計至少約10%的低聚糖，按重量計至少約20%的低聚糖，或者按重量計至少約30%的低聚糖。水溶液22可從位于靠近離心機20頂部處的出口排出。水溶液可具有小于約20厘泊的粘度。水溶液可包含小于約20g/L的單體葡萄糖，更優選地小于約10g/L，或小于約5g/L的單體葡萄糖。用于測定單體葡萄糖量的適用方法是本領域熟知的。本領域已知的此類適用方法包括HPLC。濕餅24可包括不溶解固體。濕餅24可從出口排出，所述出口位于靠近離心機20底部的地方。濕餅24也可包括一部分糖和水。 一旦已經從離心機20中排出了水溶液22，可用附加的水在離心機20中洗滌濕餅24。作為另外一種選擇，可用附加的水在另外的離心機中洗滌濕餅24。洗滌濕餅24將回收存在于濕餅中的糖或糖源(例如低聚糖)，并且可將回收的糖和水再循環到液化容器10中。在洗滌后，可通過任何合適的已知方法干燥濕餅24以形成干酒糟及可溶物(Dried Distillers' Grains with Solubles,DDGS)。由在離心機20中形成的濕餅24形成DDGS具有多個優點。因為不溶解固體不進入發酵罐，提取劑和/或丁醇不被捕集在DDGS中，DDGS不經受發酵罐的條件，并且DDGS不接觸發酵罐中存在的微生物。所有這些效果為隨后的DDGS(例如作為動物飼料)加工和銷售提供有益效果。離心機20可為工業中利用的任何常規離心機，包括例如臥式螺旋-碟式離心機、三相臥螺離心機、盤疊式離心機、過濾離心機、或潷析器離心機。在一些實施方案中，從原料漿液16中移除不溶解固體可通過過濾、真空過濾、帶式過濾、壓濾、使用篩網的過濾、篩分、柵或柵濾、多孔柵濾、浮選、水力旋流器、壓濾器、螺旋壓榨器、重力沉降器、渦旋分離器、或可用于從液體中分離固體的任何方法來完成。在一個實施方案中，可從玉米醪中移除不溶解固體以形成兩種產物流，例如與玉米醪相比包含更低濃度固體的低聚糖水溶液和與玉米醪相比濕餅包含更高濃度固體的濕餅。此外，如果利用三相臥螺離心機從玉米醪中移除固體，可產生包含玉米油的第三物流。同樣地，可使用不同的分離技術或其組合產生多個產物流。在一些實施方案中，濕餅24是由原料漿液16形成的組合物，例如在離心機20中的玉米醪漿液，其中濕餅24包括存在于原料漿液中的按重量計至少約50%的不溶解顆粒，存在于原料漿液中的按重量計至少約55%的不溶解顆粒，存在于原料漿液中的按重量計至少約60%的不溶解顆粒，存在于原料漿液中的按重量計至少約65%的不溶解顆粒，存在于原料漿液中的按重量計至少約70 %的不溶解顆粒，存在于原料漿液中的按重量計至少約75%的不溶解顆粒，存在于原料漿液中的按重量計至少約80%的不溶解顆粒，存在于原料漿液中的按重量計至少約85%的不溶解顆粒，存在于原料漿液中的按重量計至少約90%的不溶解顆粒，存在于原料漿液中的按重量計至少約95 %的不溶解顆粒，或存在于原料漿液中的按重量計約99%的不溶解顆粒.在一些實施方案中，水溶液22由原料漿液16形成，例如在離心機20中的玉米醪漿液包括存在于原料漿液中的按重量計不超過約50%的不溶解顆粒，存在于原料漿液中的按重量計不超過約45 %的不溶解顆粒，存在于原料漿液中的按重量計不超過約40 %的不溶解顆粒，存在于原料漿液中的按重量計不超過約35%的不溶解顆粒，存在于原料漿液中的按重量計不超過約30%的不溶解顆粒，存在于原料漿液中的按重量計不超過約25%的不溶解顆粒，存在于原料漿液中的按重量計不超過約20%的不溶解顆粒，存在于原料漿液中的按重量計不超過約15%的不溶解顆粒，存在于原料漿液中的按重量計不超過約10%的不溶解顆粒，存在于原料漿液中的按重量計不超過約5%的不溶解顆粒，或存在于原料漿液中的按重量計約I%的不溶解顆粒。
發酵罐30被構造成發酵水溶液22以產生丁醇，其具有用于接納水溶液22的入口。發酵罐30可包括發酵液體培養基。微生物32選自細菌、藍細菌、絲狀真菌和酵母，將其導入發酵罐30,包括中發酵液體培養基中。在一些實施方案中,微生物32可為細菌如大腸桿菌。在一些實施方案中，微生物32可為釀酒酵母。微生物32消耗水溶液22中的糖并產生丁醇。利用微生物以及產生高生產能力丁醇的微生物發酵生產丁醇是已知的，并且被公開在例如美國專利公開申請公布2009/0305370中，其公開內容全文并入本文。在一些實施方案中，微生物32可為發酵重組微生物。在一些實施方案中，微生物32經工程化以包含生物合成途徑。在一些實施方案中，生物合成途徑是丁醇生物合成途徑。在一些實施方案中，生物合成途徑將丙酮酸轉化成發酵產物。在一些實施方案中，生物合成途徑包含至少一種異源性多核苷酸，其編碼的多肽催化底物到產物的轉化的生物合成途徑。在一些實施方案中，每個底物到產物的轉化的生物合成途徑由異源多核苷酸編碼的多肽催化。當微生物產生丁醇時，可利用原位產物移除(ISPR)例如液-液提取從發酵罐30 中移除丁醇。下文簡述了液-液提取并且可根據美國專利公開申請公布2009/0305370所述的方法進行液-液提取，其公開內容全文并入本文。發酵罐30具有用于接納提取劑34的入口。提取劑34可為有機提取劑，其選自飽和的、單不飽和的、多不飽和的(以及它們的混合物)C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、C12-C22脂肪酰胺、以及它們的混合物。提取劑還可為有機提取齊IJ，其選自飽和的、單不飽和的、多不飽和的(以及它們的混合物)C4-C22脂肪醇、C4-C28脂肪酸、C4-C28脂肪酸酯、C4-C22脂肪醛、以及它們的混合物。提取劑34可為所述有機提取劑例如油醇、二十二醇、鯨蠟醇、月桂醇、十四醇、硬脂醇、I-i^一醇、油酸、月桂酸、肉豆蘧酸、硬脂酸、肉豆蘧酸甲酯、油酸甲酯、十一醛、月桂醛、20-甲基十一醛、以及它們的混合物。提取劑34接觸發酵液體培養基并且將存在于發酵液體培養基中的丁醇轉移到提取劑34中。富含丁醇的提取劑流36通過發酵罐30中的出口排出。隨后使用常規技術從物流36中的提取劑中分離丁醇。可將進料流加到發酵罐30中。發酵罐30可為本領域已知的任何適用發酵罐。在一些實施方案中，可在發酵罐30中發生同步糖化和發酵。可使用工業上通常利用的任何已知的糖化方法，包括但不限于酸方法、酸-酶方法、或酶方法。在一些實施方案中，可將酶38如葡糖淀粉酶導入發酵罐30中的入口以將存在于水溶液22中的低聚糖形式的糖降解成單糖。在一些實施方案中，可從發酵罐30的出口排出發酵液體培養基40。排出的發酵液體培養基40可包括微生物32如酵母。微生物32可容易地與發酵液體培養基40分離，例如在離心機(未示出)中分離。微生物32然后可再循環到發酵罐30中，其隨時間可提高丁醇的生產速率，從而導致丁醇生產效率的提高。當一部分發酵液體培養基40流出發酵罐30時，發酵液體培養基40包括存在于原料漿液中的按重量計不超過約50%的不溶解顆粒，存在于原料漿液中的按重量計不超過約45%的不溶解顆粒，存在于原料漿液中的按重量計不超過約40%的不溶解顆粒，存在于原料漿液中的按重量計不超過約35%的不溶解顆粒，存在于原料漿液中的按重量計不超過約30%的不溶解顆粒，存在于原料漿液中的按重量計不超過約25%的不溶解顆粒，存在于原料漿液中的按重量計不超過約20%的不溶解顆粒，存在于原料漿液中的按重量計不超過約15%的不溶解顆粒，存在于原料漿液中的按重量計不超過約10%的不溶解顆粒，存在于原料漿液中的按重量計不超過約5%的不溶解顆粒，或存在于原料漿液中的按重量計不超過約I %的不溶解顆粒。 在一些實施方案中，例如如圖2所示，本發明的體系和方法可包括被構造成干磨原料52的干磨機50。原料52可為與圖I的原料12相同的原料，并且可通過入口進入干磨機50。干磨機50可干磨或碾磨原料52。在一些實施方案中，原料52可為未分級的。在一些實施方案中，原料52可為未分級的玉米籽粒。干磨機50可為任何適用的已知干磨機，例如錘磨機。經干磨的原料54通過出口從干磨機50中排出并進入液化容器10。圖2的剩余部分與圖I相同并且未再進行描述。在其它實施方案中，原料可為分級的和/或濕磨的，這已知在工業中作為未分級的和/或干磨的替代。濕磨法是多步方法，其將生物質(例如玉米)分離成它的主要組分(胚芽、果皮纖維、淀粉和谷蛋白)以分別從每個共產物獲取價值。這個方法提供純化的淀粉流；然而，它是昂貴的并且包括將生物質分離成它的非淀粉組分，這對醇的發酵生產是不必要的。分級移除纖維和胚芽，其包含存在于經碾磨的完整玉米中的大部分脂質，產生具有更高淀粉(胚乳)含量的分級玉米。干燥分級不會從纖維中分離胚芽，因此它比濕磨法更便宜。然而，分級不會移除全部纖維或胚芽，并且不移除全部固體。此外，在分級過程中存在一些淀粉損失。濕磨玉米比干燥分級更昂貴，但是干燥分級比干磨未分級的玉米更昂貴。在一些實施方案中，例如如圖3所示，本發明的體系和方法可包括從離心機20的出口排出油26。圖3與圖I相同，不同的是油流26流出離心機20并因此將不再次進行詳述。原料漿液16分離成包含可發酵糖的第一液相或水溶液22、包含不溶解固體的固相或濕餅24、以及包含可流出離心機20的油26的第二液相。在一些實施方案中，原料12是玉米，并且油26是游離玉米油。如本文所用，術語游離玉米油指從玉米胚芽中游離出的玉米油。可使用任何合適的常規離心機如三相臥螺離心機排出水溶液22、濕餅24和油26。在一些實施方案中，當原料是玉米時，來自原料12的一部分油如玉米油保留在濕餅24中。在此類情況下，濕餅24包含的玉米油量為按重量計小于約20%的濕餅24的干固體含量。在一些實施方案中，當從離心機20中移除原料12 (例如玉米)和玉米油26時，發酵罐30中的發酵液體培養基包括減量的玉米油。例如，發酵液體培養基基本上不含不溶解固體，它可包括重量比為至少約4 I的產物醇部分(例如丁醇)和油部分(例如玉米油)。玉米油可包含按重量計至少15%的游離脂肪酸，例如按重量計16. 7%的游離脂肪酸。在一些實施方案中，所述發酵液體培養基具有按重量計不超過約25%的不溶解固體，所述發酵液體培養基具有按重量計不超過約15%的不溶解固體，所述發酵液體培養基具有按重量計不超過約10%的不溶解固體，所述發酵液體培養基具有按重量計不超過約5%的不溶解固體，所述發酵液體培養基具有按重量計不超過約I %的不溶解固體，或者所述發酵液體培養基具有按重量計不超過約O. 5%的不溶解固體。在一些實施方案中，離心機20產生的產物特征包括一層不溶解固體、一層油(例如玉米油)和一個包含可發酵糖的上清液層。在上清液層中的可發酵糖對在不溶解固體層中的不溶解固體的重量比可在約2 I至約5 I的范圍內；在上清液層中的可發酵糖對玉米油層中的玉米油的重量比可在約10 I至約50 I的范圍內；和/或在不溶解固體層中的不溶解固體對玉米油層中的玉米油的重量比可在約2 I至約25 I的范圍內。在一些實施方案中，除圖3的體系和方法之外，可修改圖2的體系和方法以包括如上所述從離心機20中排出油流。如果不單獨排出油26，它可與濕餅24 —起被移除。當經由離心機20移除濕餅24時，在一些實施方案中，當原料是玉米時，來自原料12的一部分油如玉米油保留在濕餅24中。一旦已經從離心機20中排出水溶液22，可用附加的水在離心機中洗滌濕餅24。洗滌濕餅24將回收存在于濕餅中的糖(例如低聚糖)，并且可將回收的糖和水再循環到液化容器10中。在洗滌后，濕餅24可與可液化物結合，然后通過任何合適的已知方法進行干燥以形成干酒糟及可溶物(Dried Distillers' Grains with Solubles, DDGS)。由在離心機20中形成的濕餅24形成DDGS具有多個優點。因為不溶解固體不進入發酵容器中，提取劑和/或產物醇如丁醇不被捕集在DDGS中，它不經受發酵容器的條件，并且它不接觸發酵容器中存在的微生物。所有這些有益效果使它更易于加工和銷售DDGS，例如以動物飼料形式 加工和銷售。在一些實施方案中，油26不與濕餅24分開排出，而是將油26包括在濕餅24中，作為它的一部分，并且最終存在于DDGS中。在此類情況下，所述油可與DDGS分開并且轉化成ISPR提取劑，隨后用于相同或不同的醇發酵方法。可使用任何合適的已知方法將油26與DDGS分開，所述方法包括例如溶劑提取方法。在本發明的一個實施方案中，將DDGS載入提取容器中并用溶劑如己烷洗滌以移除油
26。可利用的其他溶劑包括例如異丁醇、異己烷、乙醇、石油餾分如石油醚、或它們的混合物。在油26提取后，可處理DDGS以移除任何殘余的溶劑。例如，可使用任何本領域已知的方法加熱DDGS以蒸發任何殘余的溶劑。在移除溶劑后，DDGS可經受干燥過程以移除任何殘余的水。經加工的DDGS可用作動物如家禽、牲畜、和家養寵物的飼料補充劑。在從DDGS中提取后，可收集所得油26和溶劑混合物以從溶劑中分離油26。在一個實施方案中，可通過蒸發加工油26/溶劑混合物，從而蒸發和收集、再利用溶劑。可將回收的油轉化成ISPR提取劑，隨后用于相同或不同的醇發酵過程。移除原料的油組分有利于丁醇生產，因為存在于發酵罐中的油可降解成脂肪酸和甘油。甘油可在水中積聚并減少可用于整個體系再循環的水量。因此，移除原料的油組分通過提高可通過所述體系再循環的水量提高產物醇的生產效率。在一些實施方案中，例如如圖4和圖5所示，糖化可發生在分開的糖化容器60中，其位于離心機20和發酵罐30之間(圖4)或位于液化容器10和離心機20之間(圖5)。圖4和5與圖I相同，不同的是包括分開的糖化容器60并且發酵罐30不接納酶38。如上所述，可使用工業上通常利用的任何已知的糖化方法，包括但不限于酸方法、酸-酶方法、或酶方法。糖化容器60可為任何合適的已知糖化容器。在一些實施方案中，可將酶38如葡糖淀粉酶導入糖化容器60中的入口以將低聚糖形式的糖降解成單糖。例如在圖4中，存在于從離心機20中排出并通過入口被接納在糖化容器60中的含水物流22中的低聚糖降解成單糖。因此，包含單糖的水溶液62通過出口從糖化容器60中排出并流入發酵罐30中。作為另外一種選擇，如圖5所示，存在于從液化容器10中排出并通過入口被接納在糖化容器60中的原料物流16中的低聚糖降解成單糖。因此，包含單糖的原料物流64通過出口從糖化容器60中排出并流入離心機20中。
在一些實施方案中，除圖4和5的體系和方法之外，可修改圖2和3的體系和方法以包括如上所述分開的糖化容器60。在一些實施方案中，例如如圖6所示，本發明的體系和方法可包括兩個或更多個系列離心機。圖6與圖I相同，不同的是添加了第二離心機20'并因此將不再次進行詳述。排出離心機20的水溶液22可被離心機20'的入口接納。離心機20'可與離心機20相同并且可以相同方式運行。離心機20'可移除不溶解固體，其在離心機20中不與水溶液22分開，從而產生(i)類似于含水物流22，但是與含水物流22相比包含更少量不溶解固體的含水物流22'，和(ii)類似于濕餅24的濕餅24'。然后可將含水物流22'導入發酵罐30。在一些實施方案中，在離心機2(V后可存在一個或多個附加的離心機。在一些實施方案中，除圖6的體系和方法之外，可如上所述修改圖2-6的體系和方法以包括附加的離心機用于移除不溶解固體。在一些實施方案中，可從發酵罐30的出口排出發酵液體培養基40。缺乏或最小化與發酵液體培養基40 —起排出發酵罐30的不溶解固體具有多個附加的有益效果。例如，可無需下游加工中的單位和操作，例如醪塔或蒸餾塔，從而產生產物醇生產的效率提高。可移除一些或全部完全釜餾物離心機，因此在流出發酵罐的最終液體培養基中不溶解固體更少。圖1-6中公開的方法和體系包括從原料漿液16中移除不溶解固體并因此改善生物質的加工生產能力和成本效果。改善的生產能力可包括相對于在發酵之前不移除不溶解固體的體系和方法提聞的丁醇生廣效率和/或提聞的提取活性。如上所述，還可進一步加工不溶解固體以產生其他副產物如DDGS或脂肪酸酯。例如，可回收脂肪酸酯以提高碳水化合物至產物醇(例如丁醇)的生產能力。這可通過使用溶劑從例如通過組合并混合多個副產物流并干燥組合與混合步驟的產物形成的副產物中提取脂肪酸酯來完成。這種用于從DDGS中回收玉米油甘油三酯的溶劑型提取體系在美國專利公開申請公布2010/0092603中進行了描述，其教導以引用方式并入本文。在脂肪酸酯的溶劑提取的一個實施方案中，可從完整釜餾物(“分離固體”)中分離固體，因為所述流將包含在未組合副產物流中最大部分的脂肪酸酯。然后可將這些分離的固體進料于提取器并用溶劑洗滌。在一個實施方案中，翻轉分離固體至少一次以確保分離固體的所有側面受到溶劑洗滌。在洗滌后，收集已知作為混雜油的所得脂質和溶劑的混合物，從而從溶劑中分離提取的脂質。例如，可將所得脂質和溶劑的混合物沉淀到分隔體中進行進一步加工。在提取過程中，當溶劑洗滌分離固體時，該溶劑不僅將脂質帶入溶液，而且它收集細小的固體顆粒。這些“細小顆粒”一般是混雜油中的非期望雜質，并且在一個實施方案中，所述混雜油可從提取器或分隔體中通過將所述細小顆粒從混雜油中分離或洗掉的裝置排出。為了分離混雜油中包含的脂質和溶劑，所述混雜油可經受蒸餾步驟。在這個步驟中，所述混雜油可例如通過蒸發器進行加工，所述蒸發器將混雜油加熱到足夠高的溫度以引起溶劑的蒸發，但是該溫度不足以不利地影響或蒸發提取的脂質。當溶劑蒸發時，可將其收集，例如在冷凝器中收集，并在將來再利用。從混雜油中分離溶劑產生粗脂質原液，可進一步將其加工以分離水、脂肪酸酯(例如脂肪酸異丁酯)、脂肪酸和甘油三酯。在提取脂質后，可將所述固體移出提取器并經受反提取加工，移除殘余溶劑。回收殘余溶劑對方法的經濟性來說是重要的。在一個實施方案中，可將濕固體轉移到氣密環境中以保存并收集當它被轉移到除溶劑器時，短時間內從濕固體中蒸發的溶劑。當固體進入除溶劑器時，可加熱它們以蒸發并移除殘余溶劑。為了加熱所述固體，所述除溶劑器可包括用于將固體分配到一個或多個托盤上的機構，并且可直接加熱該固體，例如通過直接接觸熱空氣或熱蒸汽來加熱，或者間接地進行加熱，例如通過加熱輸送粗粉的托盤來加熱。為了有利于將固體從一個托盤轉移到另一個托盤上，攜帶固體的托盤可包括開口，其允許固體從一個托盤移到下一個托盤上。所述固體可從除溶劑器轉移到任選地混合器中，其中所述固體在被轉移到烘干機前與其他副產物混合。在這個實例中，將固體進料于除溶劑器，其中固體接觸蒸汽。在一個實施方案中，除溶劑器中的蒸汽流和固體可互為逆流。固體然后可排出除溶劑器并且可進料到烘干機或任選地混合器中，其中可混合多個副產物。可冷凝排出除溶劑器的蒸氣并任選地與混雜油混合，然后進料到潷析器中。排出潷析器的富水相可進料到蒸餾塔中，其中從富水物流中移除己烷。在一個實施方案中，耗盡了己烷的富水物流流出蒸餾塔底部并且可再循環用于發酵過程，例如，它可用于與經碾磨的玉米固體形成漿液。在另一個實施方案中，塔頂和塔底產物可再循環用于發酵過程。例如，可將富含脂質的塔底產物加到水解器的進料中。可將塔頂產物例如冷凝并進料于潷析器。流出這個潷析器的富 含己烷的物流可任選地用作溶劑的一部分，進料于提取器。流出這個潷析器的富水相可進料于將己烷從水中抽提出的塔。本領域的技術人員能夠理解，可以多種方式修改本發明的方法以優化用于生產產物醇如丁醇的發酵方法。在另一個實施方案中，副產物(或共產物)可來源于用于發酵方法的醪。例如玉米油可與醪分離，并且該玉米油可包含甘油三酯、游離脂肪酸、甘油二酯、單酸甘油酯、和磷脂(參見例如實施例20)。可將所述玉米油任選地以不同比率加到其他副產物(或共產物)中，并且因此例如能夠產生在所得副產物中不同量的甘油三酯。以這種方式可控制例如所得副產物的脂肪含量以產生更低脂肪、高蛋白的動物飼料，其與高脂肪產品相比將更好地適應奶牛的需要。在一個實施方案中，可將分離自醪的粗制玉米油進一步加工成食用油供消費者使用，或者它也可用作動物飼料的組分，因為它的高甘油三酯含量將使它成為代謝能的優異來源。在另一個實施方案中，它也可用作生物柴油或可再生柴油的原料。在一個實施方案中，可使用全部或部分提取劑副產物作為動物飼料副產物的組分，或者它可用作生物柴油或可再生柴油的原料。在另一個實施方案中，固體可與醪分離并且可包含甘油三酯和游離脂肪酸。這些固體(或物流)可用作動物飼料，其或者當離心排出時回收或者在干燥后回收。這些固體(或濕餅)可尤其適用作反芻動物(例如奶牛)的飼料，這是因為它具有高含量的可利用賴氨酸和旁路或瘤胃不可降解的蛋白。例如這些固體可為特定值的高蛋白、低脂肪飼料。在另一個實施方案中，這些固體可用作基料，即，可將其他副產物如糖漿加到固體中以形成產物，其可用作動物飼料。在另一個實施方案中，可將不同量的其他副產物加到固體中以調整所得產物的特性，從而符合某些動物種類的需要。如實施例21所述分離自完整釜餾物的固體組合物可包括例如粗蛋白、脂肪酸和脂肪酸異丁酯。在一個實施方案中，可使用這一組合物(或副產物)(濕的或干的)作為動物飼料，其中例如高蛋白(例如高賴氨酸)、低脂肪、和高纖維含量是期望的。在另一個實施方案中，可將脂肪加到這一組合物中，例如，如果期望高脂肪、低纖維的動物飼料，從另一個副產物物流中加入脂肪。在一個實施方案中，這一更高脂肪、低纖維的動物飼料可用于豬或家禽。在另一個實施方案中，濃縮酒糟可溶物(Condensed DistillersSolubles,CDS)的非水性組合物(參見例如實施例21)可包括例如蛋白質、脂肪和脂肪酸異丁酯以及其他液化的和懸浮的固體如鹽和碳水化合物。這種CDS組合物可用作例如動物飼料(濕的或干的)，其中期望高蛋白、低脂肪、高礦物鹽的飼料組分。在一個實施方案中，這一組合物可用作奶牛飼料的組分。在另一個實施方案中，可通過蒸發回收來自發酵方法的油。這種非水性的組合物可包含脂肪酸異丁酯和脂肪酸(參見例如實施例20)，并且這種組合物(或物流)可進料于水解器以回收異丁醇和脂肪酸。在另一個實施方案中，這一物流可用作生物柴油生產的原料。經由發酵方法生產醇(例如丁醇)產生的不同物流可以多種方式混合以產生多個共產物。例如，如果來自醪的粗制玉米用于產生用作提取劑的脂肪酸，并且脂質通過蒸發器進行提取用于其他目的，然后可混合并加工剩余的物流以產生共產物組合物，其包含粗蛋·白、粗脂肪、甘油三酯、脂肪酸和脂肪酸異丁酯。在一個實施方案中，這個組合物可包含至少約20-35重量％的粗蛋白、至少約I-20重量％的粗脂肪、至少約0-5重量％的甘油三酯、至少約4-10重量％的脂肪酸、和至少約2-6重量％的脂肪酸異丁酯。在一個特定實施方案中，所述共產物組合物可包含約25重量％的粗蛋白、約10重量％的粗脂肪、約O. 5重量％的甘油三酯、約6重量％的脂肪酸、和約4重量％的脂肪酸異丁酯。在另一個實施方案中，脂質通過蒸發器進行提取并且所述脂肪酸用于其他目的，并且混合并加工來自醪的約50重量％的粗制玉米和剩余的物流，所得共產物組合物可包含粗蛋白、粗脂肪、甘油三酯、脂肪酸和脂肪酸異丁酯。在一個實施方案中，這個組合物可包含至少約25-31重量％的粗蛋白、至少約6-10重量％的粗脂肪、至少約4-8重量％的甘油三酯、至少約0-2重量％的脂肪酸、和至少約1-3重量％的脂肪酸異丁酯。在一個特定實施方案中，所述共產物組合物可包含約28重量％的粗蛋白、約8重量％的粗脂肪、約6重量％的甘油三酯、約O. 7重量％的脂肪酸、和約I重量％的脂肪酸異丁酯。在另一個實施方案中，混合分離自完整釜餾物的固體和提取自醪的50重量％的玉米油，并且所得共產物組合物可包含粗蛋白、粗脂肪、甘油三酯、脂肪酸、脂肪酸異丁酯、賴氨酸、中性洗滌劑纖維(NDF)和酸性洗滌劑纖維(ADF)。在一個實施方案中，這個組合物可包含至少約26-34重量％的粗蛋白、至少約15-25重量％的粗脂肪、至少約12-20重量％的甘油三酯、至少約1-2重量％的脂肪酸、至少約2-4重量％的脂肪酸異丁酯、至少約1-2重量％的賴氨酸、至少約11-23重量％的冊？、和至少約5-11重量^^^ADF。在一個特定實施方案中，所述共產物組合物可包含約29重量％的粗蛋白、約21重量％的粗脂肪、約16重量％的甘油三酯、約I重量％的脂肪酸、約3重量％的脂肪酸異丁酯、約I重量％的賴氨酸、約17重量％的NDF、和約8重量％的ADF。所述高脂肪、甘油三酯、和賴氨酸含量以及更低纖維含量的這種共產物組合物可為豬和家禽期望的飼料。如上所述，可以多種方式混合經由發酵方法生產醇(例如丁醇)產生的不同物流以產生共產物組合物，其包含粗蛋白、粗脂肪、甘油三酯、脂肪酸和脂肪酸異丁酯。例如可利用包含至少約6%的粗脂肪和至少約28%的粗蛋白的組合物作為產乳動物的動物飼料產品。包含至少約6%的粗脂肪和至少約26%的粗蛋白的組合物可用作肥育舍飼牛的動物飼料產品，而包含至少約1%的粗脂肪和至少約27%的粗蛋白的組合物可用作越冬牛的動物飼料產品。可利用包含至少約13%的粗脂肪和至少約27%的粗蛋白的組合物作為家禽的動物飼料產品。可利用包含至少約18%的粗脂肪和至少約22%的粗蛋白的組合物作為單胃動物的動物飼料產品。因此可以此種方式混合多種物流以定制用于特定動物種類的飼料
女口
廣叩ο如上所述，可以多種方式混合經由發酵方法生產醇(例如丁醇)產生的不同物流以產生共產物組合物，其包含粗蛋白、粗脂肪、甘油三酯、脂肪酸和脂肪酸異丁酯。例如可利用包含至少約6%的粗脂肪和至少約28%的粗蛋白的組合物作為產乳動物的動物飼料產品。包含至少約6%的粗脂肪和至少約26%的粗蛋白的組合物可用作肥育舍飼牛的動物飼料產品，而包含至少約I %的粗脂肪和至少約27%的粗蛋白的組合物可用作越冬牛的動物 飼料產品。可利用包含至少約13%的粗脂肪和至少約27%的粗蛋白的組合物作為家禽的動物飼料產品。可利用包含至少約18%的粗脂肪和至少約22%的粗蛋白的組合物作為單胃動物的動物飼料產品。因此可以此種方式混合多種物流以定制用于特定動物種類的飼料
女口
廣叩ο在一個實施方案中，可以多種方式混合經由發酵方法生產醇(例如丁醇)產生的一個或多個物流以產生包含至少約90% COFA的組合物，其可用作燃料源如生物柴油。例如本發明方法的一個實施方案，混合經碾磨的谷物(例如通過錘磨機經加工的玉米)和一個或多個酶以生成漿液化的谷物。烹煮、液化、并用閃急蒸氣閃蒸這種漿液化的谷物以產生經烹煮的醪。然后過濾經烹煮的醪以移除懸浮固體，產生濕餅和濾液。可通過多種方法完成過濾，例如離心、篩濾、或真空過濾，并且這一過濾步驟可從所述醪中移除至少約80%至至少約99%的懸浮固體。用水再次形成漿液并且進行再過濾所述濕餅以移除附加的淀粉以產生經洗滌的濾餅。所述再漿液化方法可重復多次，例如一至五次。用于再漿液化所述濕餅的水可為發酵過程中產生的再循環水。由再漿液化/再過濾方法產生的濾液可返回初始混合步驟以與經碾磨的谷物形成漿液。可在混合步驟前加熱或冷卻濾液。在生產過程中經洗滌的濾餅可用醪在多個塔板上再漿液化。例如，經洗滌的濾餅可用醪在發酵罐后、在預閃蒸塔前、或在酒糟谷物烘干機的進料點用醪再漿液化。經洗滌的濾餅可與其他副產物分開干燥或者可直接以濕餅形式使用以產生DDGS。初始混合步驟產生的濾液可如本文所述進行進一步加工。例如，可用蒸汽或流程間換熱器加熱濾液。可將糖化酶加到濾液中并且所述濾液的液化淀粉可被部分或完全地糖化。可通過多種裝置冷卻糖化濾液，例如流程間交換、與冷卻水的交換、或與冷水的交換。然后可將冷卻濾液加到發酵罐中，其具有適用于醇生產的微生物，例如能夠生產丁醇的重組酵母。此外，還可將氨和循環物流加到發酵罐中。這一方法可包括至少一個發酵罐、至少兩個發酵罐、至少三個發酵罐、或至少四個發酵罐。在發酵期間產生的二氧化碳可排出到滌氣器以減少排氣(例如丁醇氣體排出)以及提高生產能力。可經由再循環回路將溶劑加到發酵罐中，或者可直接將溶劑加到發酵罐中。所述溶劑可為一種或多種有機化合物，其具有液化或與醇(例如丁醇)反應的能力并且可具有有限的水中液化度。所述溶劑可以單液相或雙液相材料形式從發酵罐中連續取出，或者所述溶劑可分批以單液相或雙液相材料形式取出。可對醪脫氣。可在脫氣之前加熱醪，例如通過與熱醪的流程間交換或與預閃蒸塔頂部的流程間交換進行加熱。可將蒸氣排出到冷凝器中，然后排出到滌氣器中。可進一步加熱脫氣的醪，例如通過與蒸氣區域中的其他物流的流程間熱交換進行加熱。經預熱的醪和溶劑可進入預閃蒸塔，它可從常規干磨燃料乙醇工廠的醪塔改建得至IJ。這種塔可在亞大氣壓下運行，由獲取自蒸發器管系或醪烹煮步驟的水蒸氣驅動。預閃蒸塔的頂部可通過與冷卻水和流程間熱交換(包括與預閃蒸塔進料的熱交換)的一些組合的熱交換進行冷凝。可將液體冷凝物導入醇/水潷析器(例如丁醇/水潷析器)。預閃蒸塔底部可在溶劑潷析器之前。預閃蒸塔底部可基本上不含游離醇(例如丁醇)。所述潷析器可為穩水器、離心機、或水力旋流器。水基本上與這個潷析器中的溶劑相分開，產生水相。水相包括懸浮和液化的固體，它可進行離心以產生濕餅和稀釜餾物。濕餅可與其他物流混合并干燥產生DDGS，它可被干燥并與其他產生DDGS的物流分開售賣，或者它可以濕餅形式售賣。可分流水相以提供逆流，它部分地用于將上述濾餅再漿液化。分流 也提供稀釜餾物，可將其泵入蒸發器用于進一步加工。在溶劑潷析器中產生的有機相可為醇(例如丁醇)酯。可水解溶劑以再生反應性溶劑并回收附加的醇(例如丁醇)。作為另外一種選擇，可過濾有機相并作為產品售賣。水解可為熱驅動的、同質催化的、或異質催化的。這一方法的輸入熱可為焙燒加熱器、熱油、電熱輸入、或高壓蒸汽。加入以驅動水解的水可來自再循環水流、新水、或蒸汽。可將冷卻的水解溶劑泵入亞大氣壓溶劑塔，其中它可用蒸汽基本上除去醇(例如丁醇)。這種蒸汽可為來自蒸發器的水蒸氣，它可為來自醪加工的閃蒸步驟的蒸汽，或者它可為來自熱水器的蒸汽(參見例如美國專利公開申請公布2009/0171129，其以引用方式并入本文)。從常規干磨乙醇工廠改建獲得的塔可適用作溶劑塔。可改進所述改建塔以用作溶劑塔。溶劑塔的底部可通過例如冷卻水或流程間熱交換進行冷卻。可潷析所述冷卻后的底部以移除殘余的水，并且所述水可再循環到所述方法的其他步驟中或再循環到醪化步驟中。溶劑塔頂部可通過與冷卻水或流程間熱交換的交換進行冷卻，并且可將冷凝物導入排醇/水的潷析器(例如丁醇/水潷析器)，其可與預閃蒸塔頂部共用。可將其他混合水和醇(例如丁醇)物流加到這個潷析器中，其包括滌氣器底部和來自脫氣步驟的縮合物。可將包含二氧化碳的排氣導入水滌氣器。這個潷析器的含水層也可進料于溶劑塔，或者可在小的專用蒸餾塔中除去醇(例如丁醇)。可通過與預閃蒸塔頂部、溶劑塔頂部、或溶劑塔底部的流程間交換預熱含水層。這一專用塔可從常規干磨燃料乙醇方法的副汽提塔改建得到。可將醇/水潷析器(例如丁醇/水潷析器)的有機層泵入醇(例如丁醇)塔。這個塔可為超大氣壓塔并且可通過再沸器內的蒸汽冷凝驅動。所述塔的進料可通過流程間熱交換進行加熱，從而減少所述塔運行的能量需求。這種流程間換熱器可包括預閃蒸塔的部分冷凝器、溶劑塔的部分冷凝器、水解器的產物、來自蒸發器的水蒸氣、或丁醇塔底部。可冷卻醇(例如丁醇)塔蒸氣的冷凝物并使其返回醇/水潷析器(例如丁醇/水潷析器)。醇(例如丁醇)塔底部可通過包括與醇(例如丁醇)塔進料的交換在內的流程間熱交換進行冷卻，并且可用冷卻水進一步冷卻、過濾、并以產品醇(例如丁醇)售賣。
可將如上所述從預閃蒸塔底部產生的稀釜餾物導入多效蒸發器。這個蒸發器可具有兩個、三個或更多個塔板。 所述蒸發器可具有類似于常規設計的燃料乙醇工廠的雙效四體構型，它可具有三效三體構型，或者它可具有其他構型。稀釜餾物可進入任何效。至少一個第一效主體可用來自超大氣壓醇(例如丁醇)塔的蒸氣加熱。蒸氣可來自最低壓效以提供水蒸氣形式的熱到亞大氣壓預閃蒸塔和溶劑塔。可將來自蒸發器的糖漿加到酒糟谷物烘干機中。可將發酵罐、脫氣器、醇/水潷析器(例如丁醇/水潷析器)或其他來源排出的二氧化碳導入水滌氣器。供應于這個滌氣器頂部的水可為新制的水或者可為再循環水。可處理(例如生物消化)再循環水以移除揮發性有機化合物并進行冷卻。可將滌氣器底部產物遞送到醇/水潷析器(例如丁醇/水潷析器)、遞送到溶劑塔、或者可與其他再循環水一起用于將上述濕餅再漿液化。來自蒸發器的冷凝物可用厭氧生物消化或其他方法進行處理以在再循環以再漿液化濾餅之前純化所述水。如果將玉米用作碾磨谷物的來源，可在多個點中的任何一個上從所述工藝流中分離玉米油。例如，可進行離心以在過濾經烹煮的醪后產生玉米油流，或者可進行預閃蒸塔水相離心以產生玉米油流。可離心濃縮糖漿中間體或最終的糖漿以產生玉米油流。在本發明方法的實施方案的另一個實例中，從發酵罐中排出的材料可在分離體系中進行加工，所述體系涉及裝置如離心機、沉降器、水力旋流器等，以及它們的組合，從而影響濃縮形式的活酵母的回收，所述酵母可再循環以在隨后的發酵批中直接地或在經過一些再處理后再使用。這個分離體系也可產生有機物流，其包含發酵產生的脂肪酯(例如脂肪異丁酯)和醇(例如丁醇)，以及僅包含痕量不可混溶有機物的含水物流。這一含水物流可在將它的醇(例如丁醇)內容物移除以再漿液化并泵送低淀粉固體之前或之后使用，所述固體從液化醪中分離并洗滌。這種做法的優點是避免可能出現的長帶驅動的傳送體系，該體系用于將這些固體從液化區送到谷物干燥和糖漿混合區。此外，在已經移除醇(例如丁醇)之后產生的這一完整釜餾物將需要使用現有的或新的分離裝置分離進入稀釜餾物和濕餅部分，并且這一稀釜餾物將部分形成逆流，其返回與烹煮水混合以制備新一批的可發酵醪。這個實施方案的另一個優點是保留在分離自液化醪的固體水分中的任何殘余液化淀粉將部分地通過這一逆流被捕集并回收。作為另外一種選擇，可認為固體物流中包含的酵母無活性并且可再分散在含水物流和這種混合流中，所述混合流是發酵保留的任何醇(例如丁醇)內容物的蒸餾物。還可分離無活性生物以用作增殖過程中的營養素。在另一個實施方案中，多相材料可離開預閃蒸塔的底部并且可在如上所述的分離體系中進行加工。濃縮固體可再分散在含水物流中并且這種混合流可用于再漿液化并泵送低淀粉固體，所述固體分離自液化醪并進行洗滌。上述方法以及本文所述的其他方法可使用計算機建模如Aspen建模(參見例如美國專利公開7，666，282)來展示。例如，商業建模軟件Aspen Plusu (Aspen Technology,Inc. , Burlington, MA)可與物理特性數據庫如購自 American Institute of ChemicalEngineers, Inc. (New York, NY)的 DIPPR(Design Institute for Physical PropertyResearch)聯合使用以開發完整的丁醇發酵、純化、和水管理方法的Aspen模型。這一過程模型可進行許多基本的工程計算，例如質量和能量平衡，氣/液平衡以及反應速率計算。為了產生Aspen模型，信息輸入可包括例如實驗數據、水含量和原料組成、醪烹煮和閃蒸的溫度、糖化條件(例如酶進料、淀粉轉化、溫度、壓力)、發酵條件(例如微生物進料、葡萄糖轉化、溫度、壓力)、脫氣條件、溶劑塔、預閃蒸塔、冷凝器、蒸發器、離心機等。上述方法和體系可在產物醇生產中產生提高的提取活性和/或效率，這是移除了不溶解固體的結果。例如，不存在不溶解固體的提取發酵可產引起產物醇從發酵液體培養基到提取劑的更高的傳質速率、提取劑與發酵罐中部或外部發酵的更好的相分離、以及由更高的提取劑液滴增大速率引起的更低的提取劑保留。例如在發酵期間保留在發酵液體培養基中的提取劑液滴也將更快并更完全地脫離發酵液體培養基，從而導致在發酵液體培養基中存在更少的游離提取劑并且能夠減少過程中的提取劑損失量。此外，例如可再利用微生物并且可無需在下游加工中使用附加的設備，例如醪塔和/或一些或全部完整釜餾物離心機。此外，例如消除了 DDGS中的提取劑損失的可能性。例如，再利用微生物的能力也能夠提高產物醇生產的總速率、降低總滴度需求、和/或降低含水滴度需求，從而產生更健康的微生物和更高的生產速率。此外，例如發酵罐中無需攪拌器是可能的，從而減少了資金成本；提高了發酵罐生產能力，因為最小化保留的提取劑以及不存在不溶解固體，更有效地利用了體積；和/或在新建工廠中使用連續發酵或更小的發酵罐。
提高提取效率的實例可包括例如穩定的分配系數、增加的(例如更快的或更完全的)相分離、增加的液-液傳質系數、在更低滴度下運行、提高的工藝流再循環能力、提高的發酵體積效率、提高的原料(例如玉米)負荷供給、提高的微生物(例如重組微生物)丁醇滴度耐受性、水回收利用率、減少能量消耗、提高的提取劑回收利用率、和/或微生物的回收利用。例如，固體占據的發酵罐體積將減少。因此，能夠增加可用于發酵的發酵罐的有效體積。在一些實施方案中，用于發酵的發酵罐的體積提高了至少約10%。例如，可穩定分配系數。因為可通過在發酵之前從原料漿液中移除固體來減少發酵罐中的玉米油，所述提取劑暴露于更少的玉米油，如果玉米油的量足夠大，它與提取劑結合并可降低分配系數。因此，減少導入發酵罐的玉米油導致提取劑相在發酵罐中更穩定的分配系數。在一些實施方案中，分配系數經過10個發酵循環降低了小于約10%。例如，提取劑對丁醇的提取效率可能提高，因為將有產物醇從發酵液體培養基到提取劑的更高的傳質速率(例如更高的傳質系數形式)，從而產生產物醇生產的更高效率。在一些實施方案中，傳質系數提高了至少2倍(參見實施例4和5)。此外，在發酵液體培養基和提取劑之間的相分離可能增加，減少了形成乳液的可能性，從而導致提高的產物醇生產效率。例如，相分離能夠更快速地或能夠更完全地發生。在一些實施方案中可發生相分離，其中之前在24小時內未觀察到明顯的相分離。在一些實施方案中，相分離與其中尚未移除固體的相分離相比，發生速率快至少約2x、至少約5x、或至少約IOx (參見實施例6和7)。此外，提取劑的回收和再利用可能提高。所述提取劑將不被“捕集”在固體中，所述固體最終可作為DDGS被移除，從而導致產物醇生產效率提高(參見實施例8和9)。玉米油對提取劑的稀釋也將減少，并且可能有更少的提取劑降解(參見實施例10)。提取劑的流速也可能降低，這將降低運行成本，從而導致產物醇生產效率提高。此外，提取劑的保留仍將降低，這是因為提取劑液滴以更高速度增大，從而導致產物醇生產效率提高。減少發酵罐中的不溶解固體量也提高產物醇生產效率。
此外，可從發酵罐中移除攪拌器，因為它不再需要懸浮不溶解固體，從而減少資金成本和能耗,并提高產物醇生產效率。
在一些實施方案中，發酵液體培養基40可從發酵罐30的出口排出。缺乏或最小化與發酵液體培養基40 —起排出發酵罐30的不溶解固體具有多個附加的有益效果。例如， 可無需下游加工中的單位和操作，例如醪塔或蒸餾塔，從而產生產物醇生產的效率提高。此外，因為不溶解固體不存在于流出發酵罐30的發酵液體培養基40中，無DDGS與“捕集”的提取劑一起形成。可移除一些或全部完全釜餾物離心機，因此在流出發酵罐的最終液體培養基中的不溶解固體更少。
如上所述，本發明的方法提供許多有益效果，它們能夠改善產物醇如丁醇的生產 (例如分批或連續生產)。例如，傳質的改善能夠以更低的含水滴度運行，產生“更健康的” 微生物。更好的相分離能夠導致改善的發酵罐體積效率以及通過醪塔、蒸餾塔等加工更少的反應器內容物的可能性。此外，有更少的由于固體導致的溶劑損失并且有回收利用細胞的可能性。本發明的方法也可提供更高質量的DDGS。
此外，本文所述方法在發酵之前移除油(例如玉米油)，這將隨后允許控制發酵中加入的油。此外，在發酵之前移除油將使DDGS中存在的油量具有一些靈活性。S卩，可加入不同量的油到DDGS中，導致DDGS與不同脂肪內容物的生產取決于特定動物種類的營養需求。
重鉬微牛物和丁醇牛物合成涂徑
不受理論的束縛，據信本文所述方法與任何醇生產微生物、尤其是以高于它們的耐受性水平的滴度生產醇的重組微生物聯合使用。
醇生產微生物是本領域已知的。例如，通過嗜甲烷菌(例如發孢甲基彎菌 (Methylosinus trichosporium))發酵氧化甲燒以生產甲醇，并使甲醇(C1燒基醇)接觸羧酸和能夠酯化羧酸與甲醇的催化劑形成羧酸甲酯。酵母菌株CEN.PK113-7D(CBS 8340， the Centraal Buro voor Schimmelculture ；van Dijken等人,Enzyme Microb. Techno. 26 706-714,2000)能夠產生乙醇，并且使乙醇接觸羧酸和能夠酯化羧酸與乙醇的催化劑形成乙酯(參見例如實施例36)。
生產醇的重組微生物也是本領域已知的(例如Ohta等人，Appl. Environ. Microbiol. 57 :893_900,1991 ；Underwood 等人，Appl. Environ. Microbiol. 68 :1071_1081, 2002 ；Shen 和 Liao, Metab. Eng. 10 :312_320, 2008 ;Hahnai 等人，Appl. Environ. Microbiol. 73 7814-7818, 2007 ;美國專利公開 5，514，583 ;美國專利公開 5，712，133 ；PCT 專利申請公布 W01995/028476 ；FeIdmann 等人,Appl. Microbiol. Biotechnol. 38 :354_361， 1992 ；Zhang 等人，Science 267 :240_243，1995 ;美國專利公開申請公布 2007/0031918A1 ； 美國專利公開7，223，575 ;美國專利公開7，741，119 ;美國專利公開7，851，188 ;美國專利公開申請公布2009/0203099A1 ;美國專利公開申請公布2009/0246846A1 ;和PCT專利申請公布WO 2010/075241，它們全部以引用方式并入本文)。
能夠生產丁醇的適用重組微生物是本領域已知的，并且本文描述了某些能夠生產丁醇的適用微生物。借助生物合成途徑生產丁醇的重組微生物可包括以下菌屬中的一種梭菌屬(Clostridium)、發酵單胞菌屬(Zymomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)、 沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、志賀氏菌屬(Shigella)、紅球菌屬(Rhodococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽抱桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬 (Enterococcus)、產喊桿菌屬(Alcaligenes)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、類芽胞桿菌屬(Paenibacillus)、節桿菌屬(Arthrobacter)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、 短桿菌屬(Brevibacterium)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、克魯維酵母菌屬 (Kluyveromyces)、耶氏酵母屬(Yarrowia)、畢赤酵母屬(Pichia)、假絲酵母屬(Candida)、 漢遜酵母屬(Hansenula)、伊薩酵母屬(Issatchenkia)或酵母屬(Saccharomyces)。 在一個實施方案中，重組微生物可選自大腸桿菌(Escherichia col i)、植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)和啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一個實施方案中，所述重組微生物是酵母。在一個實施方案中，重組微生物為克拉布特里陽性酵母，其選自酵母屬、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)、裂殖酵母屬、德克酵母屬(Dekkera)、球擬酵母屬(Torulopsis)、酒香酵母屬(Brettanomyces)、以及假絲酵母屬的一些菌種。克拉布特里陽性酵母的菌種包括但不限于啤酒糖酵母、克魯維酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、貝酵母(Saccharomyces bayanus)、芽殖酵母(Saccharomyces mikitae)、奇異酵母(Saccharomyces paradoxus)、魯氏接合酵母 (Zygosaccharomyces rouxii)和光滑假絲酵母(Candidaglabrata)。
在一些實施方案中,所述宿主細胞是啤酒糖酵母。釀酒酵母(S. cerevisiae)是本領域已知的并且購自多種來源，包括但不限于美國典型培養物保藏中心(Rockville，MD)、 Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS)Fungal Biodiversity Centre、 LeSaffre、 Gert Strand AB、FermSolutions、North American Bioproducts、Martrex 和 Lallemand0 釀酒酵母(S. cerevisiae)包括但不限于 BY4741、CEN. PK 113_7D、Ethanol Red 酵母、Ferm Pro 酵母、Bio-Ferm XR酵母、Gert Strand Prestige Batch Turbo 醇酵母、Gert Strand Pot Distillers酵母、Gert Strand Distillers Turbo酵母、FerMax Green酵母、FerMax Gold 酵母、TlieirnosaccR酵母、BG-I、PE-2、CAT-1、CBS7959、CBS7960 和 CBS7961。
利用微生物以及生產丁醇的微生物的發酵生產丁醇在例如美國專利公開申請公布2009/0305370中公開，該文獻以引用方式并入本文。在一些實施方案中，微生物包含丁醇生物合成途徑。在一些實施方案中，微生物中的異源性多核苷酸編碼至少一個、至少兩個、至少三個、或至少四個多肽，它們催化途徑中底物到產物的轉化。在一些實施方案中，微生物中的異源性多核苷酸編碼所有多肽，它們催化途徑中底物到產物的轉化。在一些實施方案中，所述微生物包含減少或消除了的丙酮酸脫羧酶活性。基本上不含丙酮酸脫羧酶活性的微生物在美國專利申請公布2009/0305363中進行了描述，其以引用方式并入本文。本文也描述了基本上不含具有NAD依賴性甘油3-磷酸脫氫酶活性如GPD2的酶的微生物。
生產丁醇的適當的生物合成途徑是本領域中已知的，并且某些適當的途徑描述于本文中。在一些實施方案中，所述丁醇生物合成途徑包含至少一種對宿主細胞是異源的基因。在一些實施方案中，所述丁醇生物合成途徑包含一種以上對宿主細胞是異源的基因。在一些實施方案中，所述丁醇生物合成途徑包含異源基因，所述異源基因編碼的多肽對應于生物合成途徑的每一步驟。
本文描述了具有催化所指示的底物向產物的轉化的能力的某些適當的蛋白質，并且本領域中提供了其他適當的蛋白質。例如，以引用方式并入本文的美國專利公開申請公布2008/0261230、2009/0163376和2010/0197519描述了乙酰羥酸異構還原酶；以引用方式并入本文的美國專利公開申請公布2010/0081154描述了二羥酸脫水酶；以引用方式并入本文的美國專利公開申請公布2009/0269823描述了醇脫氫酶。
本領域的技術人員充分理解許多水平的序列一致性對鑒定來自其它物種的多肽有用，其中此類多肽具有相同或相似功能或活性，并且適用于本文所述的重組微生物。百分比同一性的有用實例包括但不限于75%、80%、85%、90%、或95%、或從75%至100% 的任何整數百分比，它們可用于描述本發明，例如75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %, 82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %, 97%、98%或 99%。
適用的菌株包括在某些引用并以引用方式并入本文的專利申請、以及在提交于 2010年9月7日的美國臨時申請61/380，563中描述的那些。本文提供了某些適用菌株的構建，包括在實施例中使用的那些。
啤酒糖酵母菌株BP1083( “NGCI-070” PNY1504)的構律
所述菌株BP1064 來源于 CEN. PK 113-7D (CBS 8340 ；Centraalbureauvoor Schimme lcultures (CBS) Fungal Biodiversity Centre, Netherlands)并包含下列基因的缺失山狀3、!1153、？0(1、？005、？006和6 02。BP1064 用質粒 pYZ090 (SEQ ID NO :1，描述于美國臨時申請61/246，844)和pLH468(SEQ ID NO 2)進行轉化以產生菌株NGCI-070 (BP1083， PNY1504)。
缺失，即完全移除整個編碼序列，其通過與聚合酶鏈反應片段同源性重組而創建， 所述聚合酶鏈反應片段包含靶基因的上游和下游同源性區以及用于選擇轉化子的G418抗性標記或URA3基因。其側翼為的G418抗性標記，用Cre重組酶移除。通過同源性重組移除所述URA3基因以創建無痕缺失，或如果側翼為IoxP位點則用Cre重組酶移除。
所述無痕的缺失步驟改編自Akada等人(Yeast 23 =399-405,2006)。一般來講， 每個無痕缺失的聚合酶鏈反應盒是通過重疊聚合酶鏈反應組合四個片段，A-B-U-C，得到的。所述聚合酶鏈反應盒包含可選的/反可選的標記，URA3(片段U)，其包含原生CEN.PK 113-7D URA3基因，連同啟動子(URA3基因上游250bp)和終止子(URA3基因下游150bp)。 片段A和C每個長500bp，它們對應于緊接靶基因(片段A)上游的500bp和靶基因3'的 500bp(片段C)。片段A和C用于通過同源重組將盒整合到染色體中。片段B(500bp長) 對應于緊接靶基因下游的500bp并用于通過同源性重組，從染色體上切除URA3標記和片段 C，在盒整合到染色體時生成作為對應片段B的直接重復序列使用PCR產物ABUC盒，首先將URA3標記整合進基因組，然后通過同源重組從基因組中切除。初始整合刪除了除3'的 500bp之外的基因。在切除時，也刪除了所述基因3'的500bp區域。對于使用這個方法的基因整合，將要整合的基因包含在聚合酶鏈反應和的片段A和B之間。
URA3 缺失
為刪除內源URA3編碼區，ura3: :loxP-kanMX-loxP以盒聚合酶鏈反應擴增自 pLA54模板DNA(SEQ ID NO :3)。pLA54包含乳酸克魯維酵母TEFl啟動子和kanMX標記，并且側翼序列為OxP位點，允許Cre重組酶參與重組并移除標記。使用Phusionl! DNA聚合酶 (New England BioLabs Inc.，Ipswich, MA)和引物 BK505 與 BK506 (SEQ ID NO :4 和 5)進行PCR。所述每個引物的URA3部分來源于URA3啟動子上游5'區，和編碼區下游3'區，使得loxP-kanMX-loxP標記的整合導致URA3編碼區的替換。使用標準基因技術將所述聚合酶鏈反應產物轉化到 CEN. PK 113-7D 中(Methods inYeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor,NY,第 201-202 頁)并且轉化子在 30°C包含G418 (100 μ g/mL)的YPD上選擇。篩選的轉化子的正確整合通過聚合酶鏈反應來驗證， 使用引物 LA468 和 LA492(SEQ ID NO :6 和 7)，并命名為 CEN. PK 113-7D Λ ura3: : kanMX。
HI S3 缺失
無痕HIS3缺失的聚合酶鏈反應盒的四個片段的擴增使用PhllSionli'高保真聚合酶鏈反應 Master Mix (New England BioLabs Inc. , Ipswich, MA)并以 CEN. PK 113-7D 基因組 DNA 為模板,用Gentra15 Puregeneu Yeast/Bact 試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)制備。 HIS3 片段 A 采用引物 oBP452(SEQID NO : 14)和引物 oBP453 (SEQ ID NO 15)進行擴增， 其包含與HIS3片段B的5'端同源的5'尾。HIS3片段B使用以下引物進行擴增引物 oBP454 (SEQ ID NO : 16)，其包含與HIS3片段A的V端同源的Y尾，和引物oBP455 (SEQ ID NO: 17)，其包含與HIS3片段U的5'端同源的5'尾。HIS3片段U使用以下引物進行擴增引物oBP456(SEQ ID NO :18)，其包含與HIS3片段B的3'端同源的5'尾，和引物 oBP457 (SEQ ID NO : 19)，其包含與HIS3片段C的5'端同源的5'尾。HIS3片段C使用以下引物進行擴增引物oBP458(SEQ ID NO :20)，其包含與HIS3片段U的3'端同源的5' 尾，和引物 oBP459(SEQ ID NO :21)。使用 PCR 純化試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)純化 PCR 產物。HIS3片段AB通過重疊聚合酶鏈反應生成，通過混合HIS3片段A和HIS3片段B并用引物 oBP452(SEQID NO 14)和 oBP455 (SEQ ID NO 17)進行擴增。HIS3 片段 UC 通過重疊聚合酶鏈反應生成，通過混合HIS3片段U和HIS3片段C并用引物oBP456(SEQ ID NO 18)和oBP459(SEQ ID NO 21)進行擴增。所得聚合酶鏈反應產物在瓊脂糖凝膠上電泳，然后通過Gel Extraction試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)純化。HIS3ABUC盒通過重疊聚合酶鏈反應生成，通過混合HIS3片段AB和HIS3片段UC并用引物oBP452(SEQ ID NO 14)和 oBP459 (SEQ ID NO 21)進行擴增。PCR 產物用 PCR 純化試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)進行純化。
制備CEN. PK 113-7D Δ ura3: : kanMX的感受態細胞，并用HIS3 ABUC聚合酶鏈反應盒轉化，使用 Frozen-EZ Yeast Transformation II 試劑盒(Zymo Research Corporation, Irvine, CA)。轉化混合物在30°C接種到缺乏尿卩密唳輔以2%的葡萄糖的合成完全培養基上。具有his3敲除的轉化子用聚合酶鏈反應進行篩選，所用引物為oBP460(SEQ ID NO 22)和 oBP461 (SEQ ID NO 23)，所用的基因組 DNA 用Gentrau Puregene" Yeast/ Bact.試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)制備。正確的轉化子選擇為菌株CEN. PK113-7D Δ ur a3::kanMXΔhis3::URA30
從A ura3位點移除KanMX標記以及從A his3位點移除URA3標記
所述KanMX 標記通過轉化 CEN. PK 113_7DAura3: : kanMX Δ his3: :URA3with pRS423: :PGALl-cre(SEQ ID NO :66，如美國臨時申請61/290，639中所述)而移除，使用 Frozen-EZ Yeast Transformation II 試劑盒(ZymoResearch Corporation, Irvine, CA) 并在30°C接種到缺乏組氨酸和尿嘧啶輔以2%的葡萄糖的合成完全培養基上。轉化子在 30°C的輔以I %的半乳糖的YP上生長6個小時以誘導Cre重組酶和KanMX標記切除，并在30°C接種到YPD(2%葡萄糖)平板上以復蘇。分離物過夜生長在YPD中并在30°C接種到包含5-氟-乳清酸(5-F0A，0. 1% )的合成完全培養基上，以選擇失去了 URA3標記的轉化子的分離物。抗5-氟-乳清酸的分離物生長和接種到YPD中以移除pRS423: :PGALI-ere 質粒。檢測分離物中KanMX標記和URA3標記的丟失，并通過在YPD+G418平板、缺乏尿嘧啶的合成完全培養基平板、和缺乏組氨酸的合成完全培養基平板的生長檢測，檢測 IpRS423: :PGALI-ere質粒的丟失。對G418敏感并為尿嘧啶和組氨酸營養缺陷性的正確的分離物被選為菌株CEN. PK 113-7DAura3: :loxPAhis3并命名為BP857。所述缺失和標記移除通過聚合酶鏈反應和測序確認，所用引物為oBP450 (SEQ ID NO 24)和oBP451(SEQ ID NO :25)，用于 Aura3，以及引物 oBP460(SEQ ID NO 22)和 oBP461(SEQ ID NO 23), 用于 Δhis3,使用的基因組 DNA 用 GentraPuregeneli Yeast/Bact.試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)制備。
PDC6 缺失
用于無痕H)C6缺失的聚合酶鏈反應盒的四個片段的擴增使用洲把如/高保真聚合酶鏈反應 Master Mix (New England BioLabs Inc. , Ipswich, MA)并以 CEN. PK 113-7D 基因組 DNA 為模板,用 Gentra Puregene Yeast/Bact.試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)制備。PDC6片段A使用以下引物進行擴增oBP440(SEQ ID NO :26)，和引物oBP441 (SEQ ID N0:27)，其包含與H)C6片段B的5'端同源的5'尾。TOC6片段B使用以下引物進行擴增 oBP442 (SEQ ID NO :28)，其包含與TOC6片段A的3'端同源的5'尾，和引物oBP443 (SEQ ID NO :29)·，其包含與H)C6片段U的5'端同源的5'尾。TOC6片段U使用以下引物進行擴增oBP444(SEQ ID NO :30)，其包含與TOC6片段B的3 '端同源的5'尾，和引物 oBP445 (SEQ IDNO :31)，其包含與TOC6片段C的5'端同源的5'尾。TOC6片段C使用以下引物進行擴增oBP446(SEQ ID NO :32)，其包含與TOC6片段U的3'端同源的5'尾，和引物 oBP447(SEQ ID NO :33)。使用 PCR 純化試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)純化 PCR 產物。H)C6片段AB通過重疊聚合酶鏈反應生成，通過混合H)C6片段A和H)C6片段B并用引物 oBP440(SEQ ID NO 26)和 oBP443 (SEQ ID NO 29)進行擴增。PDC6 片段 UC 通過重疊聚合酶鏈反應生成，通過混合roC6片段U和roC6片段C并用引物oBP444(SEQ ID NO 30) 和oBP447(SEQ ID NO 33)進行擴增。所得聚合酶鏈反應產物在瓊脂糖凝膠上電泳，然后通過Gel Extraction試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)純化。所述FiDCGABUC盒通過重疊聚合酶鏈反應生成，通過混合H)C6片段AB和H)C6片段UC并用引物oBP440(SEQID NO 26)和 oBP447 (SEQ ID NO 33)進行擴增。PCR 產物用 PCR 純化試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)進行純化。
制備CEN. PK 113_7DAura3: :loxPAhis3 的感受態細胞，并用 PDC6ABUC 聚合酶鏈反應盒轉化，使用 Frozen-EZ Yeast Transformation II 試劑盒(Zymo Research Corporation, Irvine, CA)。轉化混合物在30 °C接種到缺乏尿卩密唳輔以2 %的葡萄糖的合成完全培養基上。帶有Pdc6敲除的轉化子通過聚合酶鏈反應進行篩選，所用引物為 oBP448 (SEQ ID NO 34)和 oBP449 (SEQ ID NO : 35)，所用的基因組 DNA 用 Gentrak Puregene1* Yeast/Bact.試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)制備。正確的轉化子被選為菌株 CEN.PK 113-7DAura3: :loxP Ahis3 Apdc6: :URA3。CN 102947457 A書明說28/66 頁
CEN. PK 113_7DAura3::loxPAhis3Apdc6::URA3 分離物過夜生長在 YPD 中并在30°C接種到包含5-氟-乳清酸(O. 1% )的合成完全培養基上，以選擇失去了 URA3標記的轉化子的分離物。所述缺失和標記移除通過聚合酶鏈反應和測序確認， 所用引物為 oBP448 (SEQ ID NO 34)和 oBP449 (SEQID NO : 35)，所用的基因組 DNA 用 Gentrali Pliregeneli Yeast/Bact.試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)制備。來自分離物的 roce基因的缺乏通過聚合酶鏈反應陰性結果來證明，所用roce的編碼區的特異性引物為 oBP554(SEQ ID NO 36)和 oBP555 (SEQ ID NO :37)。正確的分離物被選為菌株 CEN. PK 113-7DAura3: :loxPAhis3Apdc6 并被命名為 BP891。
PDCl 缺失 i IvDSm 糖合
所述roCl基因被刪除并被ilvD替換，其編碼區來自變異鏈球菌(Str印tococcus mutans) ATCC 700610。所述A片段接著ilvD編碼區,其來自變異鏈球菌(Streptococcus mutans),對于用于F1DCl缺失-ilvDSm整合的聚合酶鏈反應盒使用Phusionli High Fidelity PCR Master Mix (New EnglandBioLabs Inc. , Ipswich, MA)進行擴增并用 NYLA83 基因組DNA 作為模板，所述基因組DNA用Gentra Puregene Yeast/Bact.試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)制備。NYLA83是攜帶roCl缺失-ilvDSm整合的菌株(其構建如美國專利申請公布 201 10124060所述，其全文以引用方式并入本文)，如美國專利公開申請公布2009/0305363 所述(該文獻全文以引用方式并入本文)。roci片段A-iIvDSm(SEQ ID N0:69)用引物 oBP513(SEQ ID NO :38)和引物oBP515 (SEQ ID NO :39)擴增，后者包含與TOCl 片段B 的 Y 端同源的5,尾。用于roCl缺失-iIvDSm整合的PCR盒的B、U和C片段用PhusioiiK High Fidelity PCR Master Mix (New EnglandBioLabs Inc.，Ipswich, MA)和作為模板的 CEN. PK 113-7D 基因組 DNA 進行擴增，用Gentrau Puregene" Yeast/Bact.試劑盒(Qiagen， Valencia, CA)制備。PDCl片段B使用以下引物進行擴增oBP516 (SEQ ID N0:40)，其包含與roCl片段A-ilvDSm的3'端同源的5,尾，和引物oBP517 (SEQ IDNO :41)，其包含與 roCl片段U的5'端同源的5'尾。roCl片段U使用以下引物進行擴增oBP518(SEQ ID N0:42)，其包含與roCl片段B的3'端同源的5,尾，和引物oBP519 (SEQ ID N0:43)，其包含與roci片段C的5'端同源的5'尾。roci片段C使用以下引物進行擴增oBP520(SEQ IDNO :44)，其包含與roCl片段U的3'端同源的5,尾，和引物oBP521 (SEQ ID NO :45)。聚合酶鏈反應產物用聚合酶鏈反應純化試劑盒(Qiagen，Valencia, CA進行純化。TOCl片段 A-iIvDSm-B通過重疊聚合酶鏈反應生成，通過混合I3DCl片段A-ilvDSm和TOCl片段B并用引物 oBP513(SEQ ID NO 38)和 oBP517(SEQ ID NO 41)進行擴增。PDCl 片段 UC 通過重疊聚合酶鏈反應生成，通過混合roci片段U和roci片段C并用引物OBP518 (SEQ ID NO: 42)和oBP521(SEQ ID NO 45)進行擴增。所得聚合酶鏈反應產物在瓊脂糖凝膠上電泳，然后通過 Gel Extraction 試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)純化。所述 F1DCl A-ilvDSm-BUC 盒 (SEQ ID NO 70)通過重疊聚合酶鏈反應生成，通過混合I3DCl片段A_iIvDSm-B和TOCl片段 UC 并使用引物 oBP513 (SEQ ID NO 38)和 oBP521(SEQ ID NO 45)進行擴增。PCR 產物用PCR純化試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)進行純化。
制備CEN. PK 113-7D Aura3::loxP Ahis3 Δpdc6 的感受態細胞，并用 PDCl A-ilvDSm-BUC 聚合酶鏈反應盒轉化，使用 Frozen-EZ YeastTransformation II 試劑盒34(Zymo Research Corporation, Irvine, CA)。轉化混合物在30°C接種到缺乏尿卩密唳輔以 2%的葡萄糖的合成完全培養基上。具有roCl敲除-ilvDSm整合的轉化子用聚合酶鏈反應進行篩選，所用引物為oBP511(SEQ ID NO :46)和oBP512 (SEQ ID NO :47)，所用的基因組 DNA 用Gentrau Puregene!! Yeast/Bact.試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)制備。來自分離物的roci基因的缺乏通過聚合酶鏈反應陰性結果來證明，使用roci編碼區特異性的引物 oBP550 (SEQ ID NO 48)和 oBP551 (SEQID NO 49)。正確的轉化子被選為菌株CEN. PK 113-7D Δ ura3::IoxP Δ his3 Δ pdc6 Δpdcl::ilvDSm_URA3。
CEN.PK 113-7D Aura3: :loxP Ahis3 Apdc6 Λ pdcl: : ilvDSm_URA3 過夜生長在 YPD中并在30°C接種到包含5-氟-乳清酸(O. 1% )的合成完全培養基上，以選擇失去了 URA3標記的轉化子的分離物。所述roCl的缺失、ilvDSm的整合以及標記的移除通過聚合酶鏈反應和測序來確認，所用引物為oBP511 (SEQ ID NO 46)和oBP512(SEQ ID NO 47), ^ 用的基因組DNA川Gentrali Puregenel!lYeast/Bact.試劑盒(Qiagen,Valencia,CA)制備。 正確的分離物被選為菌株 CEN. PK 113-7D Δ ura3: : IoxP Δ his3 Δ pdc6 Δ pdcl: : ilvDSm 并命名為BP907。
PDC5 缺失 sadB 糖合
所述PDC5gene被刪除并被sadB編碼區替換，所述編碼區來自木糖氧化無色桿菌 (Achromobacter xylosoxidans)。對于F*DC5缺失-sadB整合的聚合酶鏈反應盒的一個片段首先克隆到質粒PUC19-URA3MCS中。
pUC19-URA3MCS是基于pUC19的并包含處于多克隆位點(MCS)內的URA3基因，其來自釀酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)。pUC19包含pMBl復制子和一個編碼β-內酸胺酶的基因，該基因負責在大腸桿菌中的復制與選擇。除URA3的編碼序列外，該基因的上游至下游序列都被包括用于在酵母中表達URA3。所述載體能用于克隆的目的，并且能用做酵母整合載體。
所述DNA涵蓋了 URA3編碼區，連同URA3編碼區上游250bp和下游150bp，所述序列來自釀酒酵母(Saccaromyces cerevisiae), CEN. PK 113-7D基因座DNA的擴增所用引物為 oBP438(SEQ ID NO : 12)，其包含 BamHI、AscI、PmeI 和 Fsel，和 oBP439 (SEQ ID NO: 13)， 其包含 XbaI、PacI 和 NotI 限制性位點，使用 PhusiorT'HighFidelity PCR Master Mix (New England BioLabs Inc. , Ipswich, MA)。基因組 DNA 用Gentral!_Puregeiie'U· Yeast/Bact.試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)制備。在使用BamHI和XbaI消化后,所述聚合酶鏈反應產物和pUC19(SEQ ID NO :71)用T4DNA連接酶連接生成載體pUC 19-URA3MCS。所述載體通過聚合酶鏈反應和測序確認，所用引物為oBP264 (SEQ ID NO 10)和oBP265 (SEQ IDNO :11)。
所述sadB編碼序列和PDC5片段B克隆到pUC19_URA3MCS生成PDC5A-sadB_BUC 聚合酶鏈反應盒的sadB-BU部分。所述sadB編碼序列擴增以pLH468_sadB (SEQ ID NO 67) 作為模板，所用引物為oBP530(SEQID NO :50)，其包含AscI限制性位點，和引物oBP531 (SEQ ID N0:51)，其包含與H)C5片段B的5'端同源的5'尾。TOC5片段B擴增所用引物為 oBP532 (SEQ ID NO :52)，其包含與 sadB 的 3'端同源的 Y 尾，和引物 oBP533 (SEQ ID NO: 53)，其包含PmeI限制性位點。聚合酶鏈反應產物用聚合酶鏈反應純化試劑盒(Qiagen， Valencia, CA)進行純化。sadB_PDC5片段B通過重疊聚合酶鏈反應生成,通過混合sadB片段 U 和 H)C5 片段 B 并用引物 oBP530(SEQ ID NO 50)和 oBP533 (SEQ ID NO 53)進行擴增。 在用合適的酶消化后，所得聚合酶鏈反應產物經AscI和PmeI消化用T4DNA連接酶連接到 PUC19-URA3MCS對應的位點上。所得質粒用作模板以擴增sadB-片段B-片段U,所用弓I物為 oBP536 (SEQ ID NO 54)和 oBP546 (SEQ ID NO :55)，其包含與 TOC5 片段 C 的 5'端同源的 5'尾。PDC5片段C擴增所用引物為oBP547(SEQ ID NO :56)，其包含與PDC5sadB_片段B-片段U的3'端同源的5,尾，和引物oBP539(SEQ ID NO :57)。使用PCR純化試劑盒(Qiagen， Valencia, CA)純化PCR產物。H)C5 sadB-片段B-片段U-片段C通過重疊聚合酶鏈反應生成，通過混合PDC5 sadB-片段B-片段U和PDC5片段C并用引物oBP536(SEQ ID NO 54) 和oBP539(SEQ ID NO 57)進行擴增。所得聚合酶鏈反應產物在瓊脂糖凝膠上電泳，然后通過 Gel Extraction 試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)純化。所述 PDC5A-sadB_BUC 盒(SEQ ID NO :72)通過擴增H)C5 sadB-片段B-片段U-片段C而生成，所用引物為oBP542 (SEQ ID NO :58)，其包含與原生H)C5編碼序列上游50個核苷酸同源的5'尾，和oBP539 (SEQ IDNO 57)。PCR產物用PCR純化試劑盒(Qiagen, Valencia, CA)進行純化。
制備CEN. PK 113-7D Δ ura3: : IoxP Δ his3 Δ pdc6 Δ pdcl:: ilvDSm 的感受態細胞，并用F*DC5A-sadB-BUC聚合酶鏈反應盒轉化，使用Frozen-EZ YeastTransformation II 試劑盒(Zymo Research Corporation, Irvine, CA) 轉 化混合物在30°C接種到缺乏尿嘧啶輔以I %的乙醇(無葡萄糖)的合成完全培養基上。具有pdc5敲除sadB整合的轉化子通過聚合酶鏈反應進行篩選，所用引物為oBP540 (SEQ ID NO 59)和oBP541 (SEQ ID NO: 60),所用的基因組DNA用Gentra^ Puregene Yeast/Bact.試劑盒(Qiagen, Valencia, CA) 制備。來自分離物的rocs基因的缺乏通過聚合酶鏈反應陰性結果來證明，使用rocs編碼區特異性的引物oBP552(SEQ ID NO 61)和oBP553 (SEQ ID NO :62)。正確的轉化子被選為菌株 CEN. PK 113-7D Δ ura3: : IoxP Δ his3 Δ pdc6 Δ pdcl: : ilvDSm Δ pdc5: : sadB_URA3。
CEN.PK 11 3-7D Δ ura3 : : IoxP Δ h i s 3 Δ p dc 6 Δ pdc I : : i IvDSm Apdc5: :sadB-URA3過夜生長在YPD(0. I %乙醇)中并在30°C接種到合成完全培養基上，輔以乙醇(無葡萄糖)并包含包含5-氟-乳清酸(O. 1% )，以選擇失去了 URA3標記的分離物。所述FOC5缺失、sadB整合以及標記移除是通過聚合酶鏈反應確認的， 所用引物為 oBP540(SEQ ID NO 59)和 oBP541 (SEQ ID NO :60)，所用的基因組 DNA 用 Gentrali Puregene'1* Yeast/Bact.試劑盒(Qiagen, Valencia,CA)制備。所述正確的分離物被選為菌株CEN. PK 113-7D Δ ura3: : IoxP Δ his3 Δ pdc6 Δ pdcl: : ilvDSm Δ pdc5: : sadB 并命名為BP913。
GPD2 缺失
為刪除內源的GPD2 編碼區，gpd2: :1oxP-URA3-1oxP 盒(SEQ ID NO 73)進行聚合酶鏈反應擴增，使用 loxP-URA3-loxP(SEQ ID NO :68)作為模板 DNA。1oxP-URA3_1oxP 包含來自(ATCC編號77107)的URA3標記，其側翼序列為IoxP重組酶位點。使用Phusion DNA 聚合酶(NewEngland BioLabs Inc.，Ipswich, MA)和引物 LA512 與 LA513(SEQ ID NO 8和9)。每個引物的GPD2部分來源于GPD2編碼區上游5'區和編碼區下游3'區，使得 10XP-URA3-10XP標記的整合導致GPD2編碼區的替換。所述聚合酶鏈反應產物轉化成BP913 并且轉化子在缺乏尿嘧啶的輔以1%乙醇(無葡萄糖)的合成完全培養基上篩選。篩選的轉化子的正確整合通過聚合酶鏈反應驗證，所用引物為OBP582和AA270(SEQ ID NO 63和3664)。
所述URA3 標記的循環是通過轉化 pRS423: :PGALI-ere (SEQ ID NO 66)并在 30°C 接種到缺乏組氨酸，輔以I %的乙醇的合成完全培養基上。在輔以I %的乙醇的，并包含 5-氟-乳清酸(0.1%)的合成完全培養基上，轉化子是有條斑紋狀的，并且在30°C孵育以選擇失去了 URA3標記的轉化子的分離物。抗5-氟-乳清酸的分離物生長在YPE (I %乙醇) 上以移除pRS423: :PGALI-ere質粒。通過聚合酶鏈反應確認缺失和標記移除，所述聚合酶鏈反應具有引物oBP582(SEQ ID NO :63)和oBP591 (SEQ ID NO :65)。所述正確的分離物被選為菌株 CEN.PK 113-7D Δ ura3: : IoxP Δ his3 Δ pdc6 Δ pdcl: : ilvDSm Δ pdc5: : sadB Δ gpd2: : IoxP 并命名為 PNY1503 (BP1064)。
BP1064 用質粒 pYZ090(SEQ ID NO 1)和 pLH468 (SEQ ID NO 2)進行轉化以產生菌株 NGCI-070 (BP1083 ；PNY1504)。
此外，盡管本發明的多個實施方案已如上描述，但是應當理解它們僅僅以舉例的方式存在，并且不受限制。對相關領域的技術人員將顯而易見的是能夠在不脫離本發明的實質和范圍下能夠對其進行形式和細節的多種變型。因此，本發明的廣度和范圍應不受任何上述示例性實施方案的限制，但應僅僅根據所述權利要求及其等同物限定。
在本說明書中提及的所有公布、專利和專利申請均指示本發明所屬領域的技術人員的技術水平，并且以引用方式 并入本文至如同每個單獨的公布、專利或專利申請被具體且單獨地指明為以引用方式并入的相同程度。實施例
以下非限制性實施例將進一步示出本發明。應當理解，當以下實施例涉及用玉米作為原料時，其他生物質來源可用作原料，這不背離本發明的精神。
如本文所用，使用的縮寫的含義如下“g”指克，“kg”指千克，“L”指升，“mL”指毫升，“ μ L”指微升，“mL/L”指毫升每升，“mL/min”指毫升每分鐘，“DI”指去離子，“uM”指微米，“nm”指納米，“w/v”指重量/體積，“0D”指光密度，"OD600"指在波長600nM的光密度，“dew”指干細胞重量，“rpm”指每分鐘轉數，“ V ”指攝氏度，“ V /min”指每分鐘攝氏度， “slpm”指標準升每分鐘，“ppm”指每百萬份數，“pdc”指丙酮酸脫羧酶酶數。
實施例I
制備玉米醪
使用30L玻璃帶夾套樹脂釜分三等批制備大約IOOkg液化玉米醪。所述釜帶有機械攪拌、溫度控制和PH控制機構。所有三批使用的規程如下(a)混合玉米粉與自來水 (以干燥基計30重量％的玉米)，(b)將所述漿液加熱到55°C，同時攪拌，(c)用氫氧化鈉或H2SO4將漿液pH調節至5. 8，(d)加入α -淀粉酶(以干燥玉米基計O. 02重量％ )，(e) 加熱漿液至85°C，(f)調節pH至5. 8，(g)將漿液保持在85°C 2小時，同時保持pH在5. 8， 并且(h)冷卻漿液至25 °C。
使用的玉米是完整的來自Pioneer (3335)的黃玉米粒。它在錘磨機中使用Imm的篩網碾碎。測得玉米粉的含水量為12重量％，并且測得玉米粉的淀粉含量為以干燥玉米基計 71. 4 重量 ％。α -淀粉酶為 Liquozymeu SO)S,購自 Novozymes (Franklinton, NC)。 所有三批一起使用的成分總量為33. 9kg的玉米粉(12 %的水分)，65. 4kg的自來水，和O. 006kg的Liquozyme'u' SC DS。加入總計O. 297kg的氫氧化鈉(17重量％ )以控制pH。不需要H2S04。從三個30L的批中回收的液化玉米醪的總量為99. 4kg。
實施例2
移除固體
通過在大型落地式離心機中離心從實施例I中產生的醪中移除固體,所述離心機包含六個IL的瓶子。73. 4kg的醪在25°C以8000rpm離心20min，產生44. 4kg的濃縮物和 26. 9kg濕餅。測得濃縮物包含< I重量％的懸浮固體，并且濕餅包含大約18重量％的懸浮固體。這暗示初始的液化醪包含大約7重量％的懸浮固體。這與玉米負荷和使用的玉米的淀粉含量一致，假定大多數淀粉液化。如果所有淀粉均液化，直接從離心機中回收的44. 4kg 濃縮物將已經包含大約23重量％的液化的低聚糖(液化淀粉)。將約O. 6kg的i-BuOH加到35. 4kg的濃縮物中以保存它。所得36. Okg的濃縮物包含I. 6重量％的i_BuOH，將其用作原液。
實施例3
不溶解固體對傳質速率的效應
進行以下實驗以測量不溶解固體對來自水相的i-BuOH的傳質速率效應，所述水相模擬來源于玉米醪的發酵液體培養基的組成，其大約一半通過SSF (同步糖化和發酵)發酵(即，大約50%轉化成低聚糖)以模擬SSF分批發酵的液相的平均組成。來自實施例2 的濃縮物模擬SSF開始時的液相組成。因此，它的一部分用等量的H2O基于質量稀釋以生成模擬約50%轉化率的SSF的濃縮物。加入更多的i-BuOH以使在稀釋濃縮物中的i-BuOH 的最終濃度為3. O重量％ (約30g/L)。
如下制備稀釋的濃縮物來自實施例2的18kg濃縮物原液包含I. 6重量％的 i-Bu0H，它與18kg自來水混合并加入0. 82kg I-BuOH0所得36. 8kg稀釋濃縮物的溶液由大約11重量％的低聚糖和大約30g/L的i-BuOH組成。這種溶液模擬玉米醪發酵(SSF)的液相，所述發酵有大約50%的低聚糖轉化率和30g/L i-BuOH的含水滴度。
實施例4
移除不溶解固體對傳質的效應
使用在實施例3中獲得的溶液進行傳質測試，將所述溶液作為水相以模擬液體培養基的傳質性能，所述液體培養基來源于移除大部分不溶解固體后的液化玉米醪。傳質測試的目的在于測量不溶解固體對將來自模擬液體培養基的i-BuOH傳遞到通過模擬液體培養基增大的溶劑(提取劑)液滴的分散體中的總體積傳質系數(k#)的效應，所述液體培養基來源于液化玉米醪。k#與運行參數的關鍵設計的關聯可用于促進傳質運行。應盡可能保持恒定以產生k#與更小級別數據(所述數據用于級聯放大)關聯的參數的實例是相的物理特性和決定液滴尺寸的設計參數(例如噴嘴直徑、通過噴嘴分散相的速度)。
使用一個6英寸直徑、7英尺高度的帶夾套的玻璃塔來測量將i-BuOH從低聚糖 (來源于液化玉米醪)的水溶液(具有或不具有懸浮醪固體)轉移到通過模擬液體培養基增大的油醇(OA)液滴分散體的k^i。將i-BuOH加到水相中以提供初始濃度為大約30g/L 的i-BuOH。使包含大約11重量％的低聚糖和大約30g/L的i-BuOH的一定量的水相(通常約35kg)進入所述塔，用流過夾套的熱H2O來將所述塔加熱到30°C。在測試期間無水相流入或流出所述塔。
通過單個噴嘴將新的油醇(80/85%等級，來自Cognis)噴灑到所述塔底部以產生提取劑液滴的分散體，所述液滴流經水相。在到達水相頂部時，形成分離有機相的提取劑液滴，所述有機相然后從所述塔頂部溢出并匯集在接收器中。通常在單次測試中3至5加侖的OA流經所述塔。
在整個測試過程中分多次將水相樣品從塔中取出，并且在測試末期取出從溢流中收集的總“富含”OA的復合樣品。使用HP-6890GC分析所有樣品的i-BuOH。使用水相中的 i-BuOH濃度分布(S卩，i-BuOH濃度對時間)計算在給定運行條件下的k#。在測試期間收集的總“富含” OA的最終復合樣品用于檢查i-BuOH的質量余量。
改變噴嘴尺寸和噴嘴速度(0A通過進料噴嘴的平均速度)來觀察它們對k#的效應。使用移除醪固體的低聚糖水溶液(稀釋從液化玉米醪中獲得的濃縮物得到)進行一系列測試。在重新加入醪固體以模擬在SSF中央的液化玉米醪(包括不溶解固體)后，使用相同的低聚糖水溶液進行一系列類似的測試。注意到在一些運行條件下(例如更高的OA流速下)，在塔頂部的相分離不佳，這使得難以獲取在測試期間收集的總“富含” OA的代表性復合樣品。也注意到在一些運行條件下，水相樣品包含顯著量的有機相。使用特殊的樣品處理和制備技術以獲取水相樣品，該樣品在被取樣時是塔中盡可能有代表性的水相樣品。
測定出塔中的水相實際上被“充分混合”，因為i-BuOH的濃度在給定時間點上在整個塔中變化不大。假定溶劑液滴相也被充分混合，塔中從水相到溶劑相的i-BuOH的總體傳質可近似于下式
權利要求
1.方法，包括 提供包含可發酵碳源、不溶解固體和水的生物質原料漿液； 從所述漿液中分離所述不溶解固體的至少一部分，從而產生α)包含可發酵碳源的水溶液和(ii)包含固體的濕餅共產物；以及 將所述水溶液加到在發酵容器中包含重組微生物的發酵液體培養基中，從而產生發酵產物；其中改善了所述生物質加工生產能力。
2.根據權利要求I所述的方法，其中所述改善的生物質加工生產能力包括相對于在不溶解固體存在的情況下產生的發酵產物改善的發酵產物和共產物的可回收能力。
3.根據權利要求I所述的方法，其中所述改善的生物質加工生產能力包括下列中的一個或多個提聞的工藝流再循環能力、提聞的發酵te體積效率、以及提聞的生物質原料負荷供給。
4.根據權利要求I所述的方法，還包括使所述發酵液體培養基與提取劑接觸，其中所述提取劑相對于包含不溶解固體的發酵液體培養基具有提高的提取效率。
5.根據權利要求4所述的方法，其中提高的提取效率包括下列中的一個或多個穩定的提取劑分配系數、增加的提取劑與發酵液體培養基的相分離、增加的液-液傳質系數、提高的提取劑回收和再循環能力、以及用于回收和再循環的保存的提取劑。
6.根據權利要求4所述的方法，其中所述提取劑是有機提取劑。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述提取劑包括一種或多種不可混溶的有機提取劑，所述不可混溶的有機提取劑選自C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、C12-C22脂肪酰胺、以及它們的混合物。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述提取劑包括來源于玉米油的C12-C22脂肪酸。
9.根據權利要求I所述的方法，其中所述不溶解固體通過臥式螺旋-碟式離心、三相臥螺離心、盤疊式離心、過濾離心、潷析器離心、過濾、真空過濾、帶式過濾器、壓濾、使用篩網的過濾、篩分、柵濾、多孔柵濾、浮選、水力旋流器、壓濾器、螺旋壓榨器、重力沉降器、渦旋分離器、或它們的組合從原料漿液中分離。
10.根據權利要求I所述的方法，還包括液化原料以產生生物質原料漿液的步驟；其中所述原料選自玉米粒、玉米棒、作物殘余物如玉米殼、玉米秸桿、草、玉米、小麥、黑麥、小麥秸桿、大麥、大麥秸桿、干草、稻桿、柳枝稷、廢紙、甘蔗渣、高粱、甘蔗、大豆、由谷物的研磨獲得的組分、纖維素材料、木質纖維素材料、樹、枝、根、葉、木片、木屑、灌木和灌叢、蔬菜、水果、花、動物糞肥、以及它們的混合物。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述原料是玉米。
12.根據權利要求10所述的方法，其中所述原料是分級的或未分級的。
13.根據權利要求10所述的方法，其中所述原料是濕磨的或干磨的。
14.根據權利要求10所述的方法，還包括在液化期間提高反應溫度的步驟。
15.根據權利要求10所述的方法，其中所述原料漿液包含來自所述原料的油，并且從所述漿液中分離所述油。
16.根據權利要求15所述的方法，其中所述濕餅包含原料油。
17.根據權利要求I所述的方法，其中用水洗滌所述濕餅以回收存在于所述濕餅中的低聚糖。
18.根據權利要求17所述的方法，其中將所述回收的低聚糖加到所述發酵容器中。
19.根據權利要求I所述的方法，其中進一步加工所述濕餅以提供改善的共產物。
20.根據權利要求19所述的方法，其中進一步加工所述共產物以形成動物飼料產品。
21.根據權利要求I所述的方法，其中用溶劑洗滌所述濕餅以回收存在于所述濕餅中的油。
22.根據權利要求21所述的方法，其中所述溶劑選自己烷、丁醇、異丁醇、異己烷、乙醇和石油餾分。
23.根據權利要求I所述的方法，其中所述發酵產物是產物醇，所述產物醇選自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、以及它們的異構體。
24.根據權利要求I所述的方法，其中所述重組微生物包含工程化的丁醇生物合成途徑。
25.根據權利要求I所述的方法，還包括 至少部分地蒸發所述發酵液體培養基和產物以及任選的CO2，其中產生蒸氣流，并且從所述蒸氣流中回收所述產物。
26.根據權利要求25所述的方法，還包括使所述蒸氣流與吸收液相接觸，其中所述蒸氣流的至少一部分被吸收到所述吸收液相中； 其中在所述蒸氣流被吸收到所述吸收液相中的開始的溫度大于在所述吸收液相不存在的情況下冷凝所述蒸氣流的開始的溫度。
27.根據權利要求25所述的方法，其中所述蒸發和接觸步驟在真空條件下進行。
28.根據權利要求25所述的方法，其中從所述漿液中分離所述不溶解固體的主要部分提供了所述發酵液體培養基的相對于包含不溶解固體的發酵液體培養基的更高的蒸氣壓。
29.根據權利要求28所述的方法，其中所述更高的蒸氣壓提供更有效的蒸發產物回收。
30.根據權利要求29所述的方法，其中所述更有效的蒸發產物回收包括下列中的一個或多個更低的資金投資，更小的蒸發、吸收、壓縮和冷卻設備，改善的傳質速率，更少的蒸發能量，以及更低的吸收劑流速。
31.生產丁醇的方法，包括 提供原料； 液化所述原料以產生原料漿液，其中所述原料漿液包含低聚糖、油和不溶解固體；從所述原料漿液中分離不溶解固體以產生(i)包含低聚糖的水溶液，( )包含不溶解固體的濕餅，和(iii)油相； 在發酵罐中使所述水溶液與發酵液體培養基接觸； 發酵所述發酵罐中的低聚糖以產生丁醇；以及 當所述丁醇產生時，從所述發酵液體培養基中進行所述丁醇的原位移除， 其中從所述原料漿液中移除所述不溶解固體提高所述丁醇生產的效率。
32.根據權利要求31所述的方法，其中所述原料是玉米，并且所述油是玉米油。
33.根據權利要求32所述的方法，其中所述不溶解固體包括胚芽、纖維和谷蛋白。
34.根據權利要求33所述的方法，還包括干磨所述原料。
35.根據權利要求32所述的方法，其中所述玉米是未分級的。
36.根據權利要求31所述的方法，其中所述不溶解固體通過臥式螺旋-碟式離心、三相臥螺離心、盤疊式離心、過濾離心、潷析器離心、過濾、真空過濾、帶式過濾器、壓濾、使用篩網的過濾、篩分、柵濾、多孔柵濾、浮選、水力旋流器、壓濾器、螺旋壓榨器、重力沉降器、渦旋分離器、或它們的組合進行分離。
37.根據權利要求31所述的方法，其中從所述原料漿液中分離不溶解固體的步驟包括離心所述原料漿液。
38.根據權利要求37所述的方法，其中離心所述原料漿液將所述原料分離成包含所述水溶液的第一液相、包含所述濕餅的固相、以及包含所述油的第二液相。
39.根據權利要求38所述的方法，其中用水洗滌所述濕餅以回收存在于所述濕餅中的低聚糖。
40.根據權利要求31所述的方法，其中所述原位移除包括液-液提取。
41.根據權利要求40所述的方法，其中用于所述液-液提取的提取劑是有機提取劑。
42.根據權利要求31所述的方法，其中糖化所述水溶液中的低聚糖與發酵所述發酵罐中的低聚糖同時發生。
43.根據權利要求31所述的方法，還包括在液化期間提高反應溫度的步驟。
44.根據權利要求31所述的方法，還包括在發酵所述發酵罐中的低聚糖之前糖化所述低聚糖。
45.根據權利要求44所述的方法，其中從所述原料漿液中移除不溶解固體的步驟包括離心所述原料漿液。
46.根據權利要求45所述的方法，其中在糖化所述糖之前離心所述原料漿液。
47.根據權利要求31所述的方法，其中所述發酵液體培養基包含重組微生物，所述重組微生物包含丁醇生物合成途徑。
48.根據權利要求31所述的方法，其中所述丁醇是異丁醇。
49.根據權利要求31所述的方法，其中從所述原料漿液中移除不溶解固體的步驟通過提高所述丁醇從所述發酵液體培養基到所述提取劑的液-液傳質系數而提高所述丁醇生廣的效率；通過提聞所述丁醇用提取劑的提取效率而提聞所述丁醇生廣的效率；通過提聞所述發酵液體培養基和提取劑之間的相分離速率而提高所述丁醇生產的效率；通過提高提取劑的回收和再循環而提高所述丁醇生產的效率；或通過降低提取劑的流速而提高所述丁醇生產的效率。
50.生產丁醇的體系，包括 被構造成液化原料以產生原料漿液的液化容器，所述液化容器包括 用于接納所述原料的入口 ；和 用于排出原料漿液的出口，其中所述原料漿液包含糖和不溶解固體； 離心機，其被構造成從所述原料漿液中移除所述不溶解固體以產生(i)包含所述糖的水溶液和(ii)包含所述不溶解固體部分的濕餅，所述離心機包括 用于接納所述原料漿液的入口； 用于排出所述水溶液的第一出口 ；和 用于排出所述濕餅的第二出口 ；和 被構造成發酵所述水溶液以產生丁醇的發酵罐，所述發酵罐包括用于接納所述水溶液的第一入口； 用于接納提取劑的第二入口； 用于排出所述富含丁醇的提取劑的第一出口 ；和 用于排出發酵液體培養基的第二出口。
51.根據權利要求50所述的體系，其中所述離心機還包括用于排出油的第三出口，所述油是在從所述原料漿液中移除所述不溶解固體時產生的。
52.根據權利要求50所述的體系，還包括被構造成糖化所述原料漿液中的糖的糖化容器，所述糖化容器包括 用于接納所述原料漿液的入口 ；和 用于排出所述原料漿液的出口。
53.根據權利要求52所述的體系，還包括被構造成糖化所述水溶液中的 糖的糖化容器，所述糖化容器包括 用于接納所述水溶液的入口 ；和 用于排出所述水溶液的出口。
54.根據權利要求50所述的體系，還包括被構造成碾磨所述原料的干磨機，所述干磨機包括 用于接納所述原料的入口 ；和 用于排出經碾磨的原料的出口。
55.組合物，包含 20-35重量％的粗蛋白， 1-20重量％的粗脂肪， 0-5重量％的甘油三酯， 4-10重量％的脂肪酸，和 2-6重量％的脂肪酸異丁酯。
56.組合物，包含 25-31重量％的粗蛋白， 6-10重量％的粗脂肪， 4-8重量％的甘油三酯， 0-2重量％的脂肪酸，和 1-3重量％的脂肪酸異丁酯。
57.組合物，包含 20-35重量％的粗蛋白， 1-20重量％的粗脂肪， 0-5重量％的甘油三酯， 4-10重量％的脂肪酸，和 2-6重量％的脂肪酸異丁酯。
58.組合物，包含 26-34重量％的粗蛋白， 15-25重量％的粗脂肪，12-20重量％的甘油三酯，1-2重量％的脂肪酸，2-4重量％的脂肪酸異丁酯，I-2重量％的賴氨酸，II-23重量 ％的 NDFJP5-11重量％的ADF。·
全文摘要
本發明提供了利用原位產物提取高效地生產發酵產物醇如丁醇的方法和體系。通過在液化給定原料后、在發酵前分離(例如通過離心)不溶解固體產生原料來獲得所述效率。所述不溶解固體的移除避免了與在原位生產提取期間存在的不溶解固體相關聯的問題，從而提高醇生產的效率。
文檔編號C07C29/86GK102947457SQ201180030096
公開日2013年2月27日 申請日期2011年6月17日 優先權日2010年6月18日
發明者B.M.雷施, K.H.伯萊夫, J.W.哈拉姆, D.J.洛維, J.J.扎赫 申請人:布特馬斯先進生物燃料有限責任公司