卷曲蛋白結合藥劑及其應用的制作方法

專利名稱：卷曲蛋白結合藥劑及其應用的制作方法
技術領域：
本發明的領域主要涉及與人類卷曲受體(frizzled receptors)結合的多肽及其他藥劑，還涉及使用所述多肽或其他藥劑來治療諸如癌癥等疾病的方法。
背景技術：
在發達國家中癌癥是引起死亡的主要原因之一，僅在美國每年就有超過一百萬人被診斷患有癌癥并有500，000人死亡。據估算，總體上每3個人中有超過I個人在其一生中將發展某種形式的癌癥。有200種或多種不同類型的癌癥，其中4種——乳腺癌、肺癌、結腸直腸癌和前列腺癌——占所有新病例的一半以上(Jemal等，2003，CancerJ. Clin. 53:5-26)。已經將Wnt信號傳導途徑鑒定為癌癥療法的潛在靶點。Wnt信號傳導途徑是胚胎模式形成、胚后組織維持和干細胞生物學的若干關鍵調控途徑之一。更具體而言，Wnt信號傳導在細胞極性產生和包括干細胞群的自我更新在內的細胞命運特化中起重要作用。Wnt途徑的非調控活化與多種人類癌癥有關，其中該活化能夠改變腫瘤細胞的發育命運，從將腫瘤細胞保持在未分化且增殖的狀態。因此癌的發生能夠通過篡奪體內平衡機制來進行，所述體內平衡機制控制通過干細胞而進行的正常發育和組織修復(綜述見于Reya和Clevers, 2005, Nature 434:843 ;Beachy 等，2004，Nature432:324)。在果蠅發育無翅(Wg)突變體中首次闡明了 fct信號傳導途徑，該途徑來自鼠原癌基因 int-Ι (現名為 Wntl) (Nusse 和 Varmus, 1982，Cell 31:99-109 ；Van Ooyen和 Nusse, 1984, Cell 39:233-40 ；Cabrera 等，1987，Cell 50:659-63 ；Rijsewijk 等，1987，(^1150:649-57)。1社基因編碼分泌型脂質修飾糖蛋白，其中19種已在哺乳動物中鑒定出。這些分泌型配體激活由卷曲(Frizzled，Fzd)受體家族成員和低密度脂蛋白(LDL)受體相關蛋白5或6(LPR5/6)組成的受體復合體。Fzd受體是屬于G蛋白偶聯受體(GPCR)超家族的具有7個跨膜結構域的蛋白，其包含具有10個保守半胱氨酸的大型細胞外N端配體結合結構域，即富含半胱氨酸的結構域(CRD)或Fri結構域。人類FZD受體有10種FZD1MFZDlO0對于特定的Wnt，不同的Fzd CRD具有不同的親和力(Wu和Nusse, 2002，J. Biol.Chem. 277:41762-9)，而且已將Fzd受體劃分為活化下文所描述的經典β -catenin途徑的Fzd受體和活化非經典途徑的Fzd受體(MiIIer等，1999，Oncogene 18:7860-72)。為了形成可結合FZD配體的受體復合體，FZD受體與LRP5/6相互作用，LRP5/6是具有由6個YWTD氨基酸重復序列分隔的四個細胞外EGF樣結構域的單次穿膜蛋白(Johnson等,2004，J. BoneMineral Res. 19:1749)。經典Wnt信號傳導途徑在結合受體時被激活，并且由直接與Fzd受體相互作用的散亂蛋白(Dishevelled, Dsh, 一種細胞質蛋白)介導，導致β -catenin在細胞質中穩定和積累。在無Wnt信號的情況下，β-catenin定位于細胞質中的降解復合體(destructioncomplex),該降解復合體包括腫瘤抑制蛋白結腸腺瘤息肉蛋白(APC)和軸蛋白(Axin)。這些蛋白發揮下述功能作為關鍵骨架使糖原合成酶激酶(GSK)-3i3結合并磷酸化β -catenin，從而將其標記以便通過泛素/蛋白酶體途徑進行降解。Dsh的活化導致GSK3 0的磷酸化和降解復合體的解離。積累的細胞質β-catenin隨后輸送至細胞核，在細胞核中β -catenin與Tcf/Lef家族的DNA結合蛋白相互作用，從而激活轉錄。除經典信號傳導途徑外，Wnt配體還激活β-catenin非依賴型途徑(Veeman等，
2003,Dev. Cell 5:367-77) 0已表明非經典Wnt信號傳導參與多種過程，但其中最有說服力的是通過與果蠅平面細胞極性(PCP)途徑相似的機制來參與原腸胚形成活動。非經典Wnt信號傳導的其他潛在機制包括鈣流動、JNK和小G蛋白及異源三聚體G蛋白。在經典途徑和非經典途徑之間經常觀察到拮抗作用，一些證據表明非經典信號傳導能夠抑制癌的形成(Olson和 Gibo, 1998, Exp. Cell Res. 241:134 ;Topol 等，2003，J. CellBiol. 162:899-908)。因此，在某些背景下，Fzd受體可作為經典Wnt信號傳導途徑的負調節因子。舉例而言，FZD6 在與FZDl共表達時通過TAKl-NLK途徑抑制Wnt-3a所引起的經典信號傳導(Golan等，
2004,JBC 279:14879-88)。類似地，Fzd2 在 Wnt_5a 存在的情況下通過 TAKl-NLK MAPK 級聯對經典Wnt信號傳導起到拮抗作用(Ishitani等，2003，Mol. Cell. Biol. 23:131-9)。經典Wnt信號傳導途徑還在小腸和結腸干細胞群的維持中起核心作用，該途徑的不當激活在結腸直腸癌中起主導作用(Reya和Clevers, 2005，Nature 434:843)。腸吸收上皮的構造為絨毛和隱窩。干細胞居于隱窩中并緩慢分裂產生快速增殖的細胞，后者產生上行離開隱窩并占據腸絨毛的所有分化細胞群。fct信號傳導級聯在控制沿隱窩-絨毛軸的細胞命運中起主導作用，并且對維持干細胞群而言必不可少。同源重組所造成的Tcf7/2遺傳丟失(Korinek等，1998，Nat. Genet. 19:379)或強分泌型Wnt抗結劑 Dickkopf-I(Dkkl)(Pinto 等，2003，Genes Dev. 17:1709-13 ；Kuhnert 等，2004，Proc.Nat’ I. Acad. Sci. 101:266-71)的過表達會破壞Wnt信號傳導，從而致使腸干細胞群耗盡。結腸直腸癌最常見是由Wnt信號傳導級聯中的激活性突變引發的。在全部結腸直腸癌中大約5%至10%是遺傳性的，其中一種主要形式是家族性腺瘤息肉病(FAP)，該病是一種常染色體顯性疾病，其中約80%的患病個體具有結腸腺瘤息肉病(APC)基因的種系突變。在包括Axin和β-catenin在內的其他Wnt途徑組分中也已經鑒定出了突變。個別腺瘤是含有第二失活等位基因的上皮細胞的無性系長出物，而大量的FAP腺瘤通過在致癌基因和/或腫瘤抑制基因增加突變而不可避免地導致腺癌的發展。此外，fct信號傳導途徑的激活，包括APC和β -catenin的功能獲得性突變，能夠在小鼠模型中引發增生性發生和腫瘤生長(Oshima 等，1997，Cancer Res. 57:1644-9 ；Harada 等，1999，EMBO J. 18:5931-42)。隨著在通過鼠病毒的近位插入而轉化的乳腺腫瘤中將Wntl (原inti)鑒定為癌基因，首次揭示了 fct信號傳導在癌癥中的作用(Nusse和Varmus, 1982，Cell31:99-109)。之后已積累了 fct信號傳導在乳腺癌中作用的其他證據。舉例而言，乳腺中β-catenin的轉基因過表達導致增生和腺癌(Imbert等，2001，J. Cell Biol. 153:555-68 ；Michaelson和Leder, 2001, Oncogene 20:5093-9),而Wnt信號傳導的丟失則破壞正常的乳腺發育(Tepera 等，2003，J. Cell Sci. 116:1137-49 ;Hatsell 等，2003，J. Mammary Gland Biol.Neoplasia 8:145-58)。最近已顯示Wnt信號傳導可激活乳腺干細胞(Liu等,2004，Proc.Nat’ I Acad. Sci. 101:4158)。在人類乳腺癌中，β-catenin的積累在超過50%的癌中意味著激活的fct信號傳導，雖然未鑒定出特異性突變，但是已觀察到了卷曲受體表達的上調(Brennan 和 Brown, 2004，J. Mammary Gland Neoplasia9:119-31 ；Malovanovic 等，
2004,Int. J. Oncol. 25:1337—42)。FZD10、FZD8、FZD7、FZD4和FZD5是10種已鑒定的人類Wnt受體中的5種。在肺中FzdlO與Wnt7b共表達，而且細胞轉染研究已表明FzdlO/LRP5共受體在響應于Wnt7b 時激活經典 Wnt 信號傳導途徑(Wang 等，2005，Mol. Cell Biol. 25:5022-30)。在包括子宮頸、胃和成膠質細胞瘤細胞系在內的多種癌細胞系中，以及在包括約40%的原發性胃癌、結腸癌和滑膜肉瘤在內的原發性癌中，FZD10 mRNA發生上調(Saitoh等，2002, Int. J. Oncol. 20:117-20 ；Terasaki 等，2002, Int. J. Mol. Med. 9:107-12 ；Nagayama等，2005，Oncogene 1-12)。在若干人類癌細胞系、原發性胃癌和腎癌中FZD8發生上調(Saitoh 等，2001，Int. J. Oncol. 18:991-96 ；Kirikoshi 等，2001，Int. J. Oncol. 19:111-5 ；Janssens等，2004，Tumor Biol. 25:161-71)。FZD7的表達遍及胃腸道，并且在6例人類原 發性胃癌中的一例中發生上調(Kirikoshi等，2001，Int. J. Oncol. 19:111-5)。結腸癌細胞系中FZD7胞外域的表達引起形態學變化，并且在異種移植模型中使腫瘤生長下降(Vincan等，2005，Differentiation 73:142-53)。在卵黃囊和胎盤血管發生中FZD5發揮必不可少的作用(Ishikawa等,2001，Dev. 128:25-33)，并且在與Wnt/ β -catenin信號傳導的活化有關的腎癌中發生上調(Janssens等，2004，TumorBiology 25:161-71)。FZD4在腸隱窩上皮細胞中高度表達，并且是在正常組織中相對于瘤組織顯示差異表達的若干因子中的一種(Gregorieff 等，2005, Gastroenterologyl29:626-38)。因此，將 FZD 受體鑒定為癌干細胞(cancer stem cell)的標記物,使得這些蛋白成為癌癥療法的理想祀點。

發明內容
本發明提供與一種或多種人類卷曲受體(FZD)結合的新型藥劑，所述藥劑包括但不限于與兩種或多于兩種人類卷曲受體結合的抗體或其他藥劑，以及這些藥劑的使用方法。本發明還提供新型多肽，例如與一種或多種卷曲受體結合的抗體、此類抗體的片段和與此類抗體有關的其他多肽。在某些實施方式中，所述藥劑、抗體、其他多肽或與FZD結合的藥劑，與在本文中稱為生物學結合部位(BBS)的FZD區域結合，本發明人現已將所述區域首次鑒定為用于抑制fct信號傳導和/或腫瘤生長的靶點。還提供了具有與多于一種FZD結合的抗原結合部位的抗體和其他多肽。還提供了包含編碼所述多肽的核酸序列的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸的載體。另外提供了含有本發明的多肽和/或多核苷酸的細胞。還提供了包含所述新型FZD結合藥劑或抗體的組合物(例如,藥物組合物)。此外還提供制造和使用所述新型FZD結合藥劑或抗體的方法，例如使用所述新型FZD結合藥劑或抗體來抑制腫瘤生長和/或治療癌癥的方法。因此，在一個方面中，本發明提供與人類卷曲受體特異性結合的藥劑。在某些實施方式中，所述藥劑抑制配體(例如fct)與人類卷曲受體生物學結合部位(BBS)的結合。在某些實施方式中，所述藥劑與人類卷曲受體內生物學結合部位(BBS)的至少一部分結合。在某些實施方式中，所述藥劑與BBS的結合導致了對Wnt信號傳導和/或腫瘤生長的抑制。在某些實施方式中，人類卷曲受體是FZD8，并且所述藥劑與下述(a)、(b)和/或(c)的至少一部分結合(a)由氨基酸72 (F)、74至75 (PL)、78⑴、92⑴、121至122 (LM)和129至132(WPDR(SEQ ID NO:70))構成的 FZD8 的構象表位；(b)由序列 QDEAGLEVHQFWPL(SEQ IDNO:67)組成的FZD8的區域；(c)由序列QYGFA(SEQ ID NO:66)組成的FZD8的區域。在某些實施方式中，由所述藥劑結合的人類卷曲受體選自由FZDl、FZD2、FZD5、FZD7或FZD8組成的組，并且所述藥劑與所述人類卷曲受體中的序列Q(DE/ED)AGLEVHQF(Y/W)PL(SEQ IDNO:24)的至少一部分結合。舉例而言，在某些實施方式中，人類卷曲受體是FZD8，并且所述藥劑與FZD8中的序列QDEAGLEVHQFWPL (SEQ ID NO: 67)的至少一部分結合。在某些實施方式中，所述藥劑與序列GLEVHQ(SEQ ID NO:25)的至少一部分結合。在某些實施方式中，人類卷曲受體是FZDI、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD9或FZDIO，并且所述藥劑與對應于由QDEAGLEVHQFWPL (SEQ ID NO: 67)組成的FZD8的區域的人類卷曲受體的區域的至少一部分結合。在某些實施方式中，所述藥劑與？2014202、？205、？207和/或？2058中的序列(K/Q) (F/Y)GF(Q/A) (SEQ IDNO:69)的至少一部分結合。舉例而言，在某些實施方式中，人類卷曲受體是FZD8，并且所述藥劑與FZD8中的序列QYGFA(SEQ ID NO:66)的至少一部分結合。在某些實施方式中，人類卷曲受體是FZDI、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD9或FZD10，并且所述藥劑與對應于由QYGFA(SEQ ID NO:66)組成的FZD8區域的人類卷曲受 體區域的至少一部分結合。在某些實施方式中，所述藥劑特異性地結合兩種或更多種、三種或更多種或四種或更多種人類卷曲受體。在某些實施方式中，所述藥劑特異性地結合包括FZD5和FZD8在內的人類卷曲受體。在某些替代性實施方式中，所述FZD結合藥劑是與人FZD受體(如，FZD8)在其生物學結合部位(BBS)的裂縫(cleft)中結合的藥劑。作為非限制性的實例而言，所述藥劑可以與表16中列出的一個或多個裂縫(cleft)殘基結合。在某些實施方式中，所述藥劑結合FZD8的L75。在某些實施方式中，所述藥劑包含多肽，所述多肽包含與選自由SEQ IDN0:98至SEQ ID NO: 111和SEQ ID NO: 113至SEQ ID NO: 116組成的組的序列具有至少約80%的序列同一性的序列。在某些實施方式中，所述藥劑包含SEQID NO: 112。在一些實施方式中，所述藥劑可以包含SEQ ID NO: 108。在另一個方面中，本發明提供與抗體競爭對人類卷曲受體的特異性結合的藥劑(例如，在體外競爭性結合測定中)，其中所述抗體具有包含SEQ ID N0:10的重鏈可變區和包含SEQ ID N0:12或SEQ ID NO: 14的輕鏈可變區。在某些實施方式中，所述抗體具有包含SEQ ID NO: 10的重鏈可變區和包含SEQ ID NO: 14的輕鏈可變區。在某些實施方式中，所述藥劑競爭對兩種或更多種、三種或更多種或四種或更多種人類卷曲受體的特異性結合。在某些實施方式中，所述藥劑競爭與？201、？2024205、？207或？208的特異性結合。在再一個方面中，本發明提供與抗體競爭對FZD5和/或FZD8的特異性結合的藥齊U，其中所述抗體具有包含SEQ ID NO:85的重鏈可變區和包含SEQ ID NO:86的輕鏈可變區。在另外一個方面中，本發明提供了 FZD結合藥劑，該藥劑(a)與多肽競爭結合FZD8的BBS ;和/或(b)能夠將多肽從FZD8上置換下來，所述多肽與FZD8的BBS結合。在某些實施方式中，所述多肽包含與選自由SEQ ID N0:98至SEQ ID NO: 111和SEQ ID NO: 113至SEQ ID NO: 116組成的組的序列具有至少80%的同一性的序列。在某些替代性實施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO: 112.的序列。
在又一個方面中，本發明提供與兩種或更多種人類卷曲受體特異性地結合的藥齊U。在某些實施方式中，所述兩種或更多種卷曲受體包括(a)FZDl和選自由FZD2、FZD5、FZD7和FZD8組成的組的第二卷曲受體；(b)FZD2和選自由FZD5、FZD7和FZD8組成的組的第二卷曲受體；(c)FZD5和FZD7 ;或(d)FZD7和FZD8。在某些實施方式中，所述藥劑特異性地結合三種或更多種(即3、4或5種)人類卷曲受體，其中所述三種或更多種人類卷曲受體包括FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8。在某些實施方式中，所述三種或更多種人類受體包括FZD5和FZD8。在某些實施方式中，所述三種或更多種人類卷曲受體還包括FZD3、FZD4、FZD6、FZD9 和 / 或 FZDlO。在另外一個方面中，本發明提供與人類卷曲受體特異性結合的多肽，其中所述多肽具有包含下述(a)、(b)和/或(c)的重鏈可變區(a)包含GFTFSHYTLS (SEQ ID NO: I)或其具有1、2、3或4個氨基酸取代的變體的重鏈⑶Rl ； (b)包含VIS⑶GSYTYYADSVKG(SEQID NO: 2)或其具有1、2、3或4個氨基酸取代的變體的重鏈⑶R2 ； (c)包含NFIKYVFAN(SEQID NO:3)或其具有1、2、3或4個氨基酸取代的變體的重鏈⑶R3。在某些實施方式中，所述 多肽特異性地結合FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8。在某些實施方式中，所述多肽特異性地結合包括FZD5和FZD8在內的兩種或更多種人類卷曲受體。在某些實施方式中，所述氨基酸取代是保守性取代。在另一個方面中，本發明提供與人類卷曲受體特異性結合的多肽，其中所述多肽具有包含下述(a)、(b)和/或(c)的輕鏈可變區(a)輕鏈CDR1，所述輕鏈CDRl包含 S⑶KLGKKYAS (SEQ ID N0:4)或 SGDNIGSFYVH(SEQ ID 勵:7)，或者具有1、2、3或4個氨基酸取代的SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 7的變體；(b)輕鏈CDR2，所述輕鏈CDR2包含EKDNRPSG (SEQ ID NO: 5)或 DKSNRPSG (SEQ ID NO: 8)，或者具有 I、2、3 或 4 個氨基酸取代的SEQ ID NO: 5 或SEQ ID NO:8 的變體；(c)輕鏈CDR3，所述輕鏈CDR3包含 SSFAGNSLE(SEQ IDN0:6)或QSYANTLSL(SEQ ID NO: 9)，或者具有I、2、3或4個氨基酸取代的SEQ ID NO: 6或SEQ ID N0:9的變體。在某些實施方式中，所述多肽特異性地結合FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8。在某些實施方式中，所述多肽特異性地結合包括FZD5和FZD8在內的兩種或更多種人類卷曲受體。在某些實施方式中，所述氨基酸取代是保守性取代。在另一個方面中，本發明提供具有下述(a)和/或(b)的多肽(a)包含GFTFSHYTLS (SEQ ID NO: I)的重鏈 CDR1、包含 VIS⑶GSYTYYADSVKG(SEQ ID NO: 2)的重鏈CDR2 和包含 NFIKYVFAN(SEQ ID NO: 3)的重鏈 CDR3 ; (b)包含 S⑶KLGKKYAS (SEQ ID NO:4)或 S⑶NIGSFYVH(SEQ ID NO: 7)的輕鏈CDRl、包含EKDNRPSG (SEQ ID NO: 5)或DKSNRPSG (SEQID NO: 8)的輕鏈 CDR2 和包含 SSFAGNSLE(SEQID NO: 6)或 QSYANTLSL (SEQ ID NO: 9)的輕鏈CDR3。在某些實施方式中，所述多肽特異性地結合人類卷曲受體。在某些實施方式中，所述多肽特異性地結合兩種或更多種(例如至少FZD5和FZD8)、三種或更多種或四種或更多種人類卷曲受體。在又一個方面中，本發明提供與人類卷曲受體特異性地結合的抗體，其中所述人類卷曲受體選自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8組成的組，其中所述抗體具有重鏈可變區，所述重鏈可變區含有(a)包含GFTFSHYTLS (SEQ ID NO: I)或其具有1、2、3或4個氨基酸取代的變體的重鏈CDRl ;包含VIS⑶GSYTYYADSVKG(SEQID NO: 2)或其具有1、2、3或4個氨基酸取代的變體的重鏈⑶R2 ;和包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO: 3)或其具有1、2、3或4個氨基酸取代的變體的重鏈⑶R3 ;和/或(b)輕鏈⑶Rl，所述輕鏈⑶Rl包含S⑶KLGKKYAS (SEQID N0:4)、S⑶NIGSFYVH(SEQ ID NO: 7)，或者具有1、2、3或4個保守性氨基酸取代的SEQID NO:4 或 SEQID NO: 7 的變體；輕鏈 CDR2，所述輕鏈 CDR2 包含 EKDNRPSG (SEQ ID NO: 5)、DKSNRPSG (SEQ ID N0:8)，或者具有1、2、3或4個保守性氨基酸取代的SEQ ID N0:5或SEQID NO: 8 的變體；輕鏈 CDR3，所述輕鏈 CDR3 包含 SSFAGNSLE (SEQ IDNO: 6)、QSYANTLSL (SEQID NO: 9)，或者具有I、2、3或4個保守性氨基酸取代的SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 9的變體。在某些實施方式中，所述抗體具有(a)包含GFTFSHYTLS (SEQ ID NO: I)的重鏈CDR1、包含 VIS⑶GSYTYYADSVKG(SEQ IDNO:2)的重鏈 CDR2 和包含 NFIKYVFAN(SEQ ID NO:3)的重鏈 CDR3 ;和/或(b)包含 SGDKLGKKYAS (SEQ ID NO:4)或 SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO: 7)的輕鏈 CDRl、包含 EKDNRPSG (SEQ ID NO: 5)或 DKSNRPSG (SEQ ID NO: 8)的輕鏈 CDR2 和包含SSFAGNSLE (SEQ ID NO: 6)或 QSYANTLSL (SEQ ID NO: 9)的輕鏈 CDR3。在某些實施方式中，所述抗體具有(a)包含GFTFSHYTLS (SEQ ID NO: I)的重鏈CDR1、包含VIS⑶GSYTYYADSVKG(SEQID NO: 2)的重鏈 CDR2 和包含 NFIKYVFAN (SEQ IDNO: 3)的重鏈 CDR3 ;和 / 或(b)包含S⑶NIGSFYVH(SEQ ID NO: 7)的輕鏈 CDRl、包含 DKSNRPSG (SEQ ID NO: 8)的輕鏈 CDR2 和包含 QSYANTLSL (SEQ ID NO: 9)的輕鏈 CDR3。 在另一個方面中，本發明提供包含下述(a)和/或(b)的多肽(a)與SEQ IDNO: 10的序列同一性至少為約80%的多肽；(b)與SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 14的序列同一性至少為約80%的多肽。在某些實施方式中，本發明提供包含下述(a)和/或(b)的多肽(a)與SEQ ID NO: 10的序列同一性至少為約80%的多肽；(b)與SEQ ID NO: 14的序列同一性至少為約80%的多肽。在某些實施方式中，所述多肽特異性地結合人類卷曲受體。在某些實施方式中，所述多肽特異性地結合兩種或更多種、三種或更多種或四種或更多種人類卷曲受體。在某些實施方式中，人類卷曲受體選自由FZDI、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8組成的組。在又一個方面中，本發明提供例如與人類FZD5和/或FZD8特異性地結合的抗體等藥劑，其中所述抗體具有(a)包含GFTFSSYYIT(SEQ ID NO:77)或其具有1、2、3或4個保守性氨基酸取代的變體的重鏈CDRl ;包含TISYSSSNTYYADSVKG(SEQID NO:78)或其具有1、2、3或4個保守性氨基酸取代的變體的重鏈⑶R2 ;和包含SIVFDY (SEQ IDNO:79)或其具有1、2、3或4個保守性氨基酸取代的變體的重鏈CDR3 ;和/或(b)包含SGDALGNRYVY(SEQ ID N0:80)或其具有1、2、3或4個保守性氨基酸取代的變體的輕鏈⑶Rl ；包含SG (SEQ ID N0:81)或其具有1、2、3或4個保守性氨基酸取代的變體的輕鏈⑶R2 ；包含GSWDTRPYPKY(SEQ ID NO:82)或其具有1、2、3或4個保守性氨基酸取代的變體的輕鏈CDR3。在某些實施方式中，所述抗體具有(a)包含GFTFSSYYIT(SEQ ID NO: 77)的重鏈CDR1、包含 TISYSSSNTYYADSVKG(SEQ ID NO: 78)的重鏈 CDR2 和包含 SIVFDY(SEQ IDNO: 79)的重鏈 CDR3 ;和 / 或(b)包含 SGDALGNRYVY (SEQ ID NO: 80)的輕鏈 CDRl、包含 SG (SEQ IDNO:81)的輕鏈 CDR2 和包含 GSWDTRPYPKY(SEQ ID NO:82)的輕鏈 CDR3。在另一個方面中，本發明提供與FZD5和/或FZD8特異性地結合的多肽，其中所述多肽包括(a)與SEQ ID NO:85的同一性至少為約80%的多肽；和/或(b)與SEQ IDNO:86的同一性至少為約80%的多肽。在又一個方面中，本發明提供與下述IgG抗體中的任一個競爭對人類FZDl、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8的特異性結合的藥劑，所述IgG抗體為18R8、18R5、18R4605和18R4805。在再一個方面中，本發明提供與抗FZD的IgG抗體44R24競爭對人類FZD5和/或FZD8的特異性結合的藥劑。在每個前述方面以及本文所述的其他方面的某些實施方式中，所述藥劑或多肽是抗體。在某些替代性實施方式中，所述藥劑不是抗體。在每個前述方面以及本文所述的其他方面的某些實施方式中，所述藥劑或多肽或抗體與其所結合的一種或多種人類卷曲受體的細胞外結構域(ECD)特異性地結合。在每個前述方面以及本文所述的其他方面的某些實施方式中，所述藥劑或多肽或抗體與其所結合的一種或多種人類卷曲受體的Fri結構域(Fri)特異性地結合。
在每個前述方面以及本文其他部分所述的其他方面的某些實施方式中，所述抗體或其他多肽的單個抗原結合部位特異性地結合(或能夠結合)多于一種人類卷曲受體。在每個前述方面以及本文所述的其他方面的某些實施方式中，所述藥劑或多肽或抗體抑制配體與人類卷曲受體的結合。在某些實施方式中，所述配體是fct，包括但不限于Wnt3a0在每個前述方面以及本文所述的其他方面的某些實施方式中，與FZD結合的藥劑或多肽或抗體是該FZD的拮抗劑。在每個前述方面以及本文所述的其他方面的某些實施方式中，所述藥劑或多肽或抗體抑制Wnt信號傳導。在某些實施方式中，受到抑制的Wnt信號傳導是經典Wnt信號傳導。在一些實施方式中，FZD結合藥劑所抑制的Wnt信號傳導是非經典Wnt信號傳導。在某些實施方式中，fct信號傳導是非經典Wnt信號傳導。在每個前述方面以及本文所述的其他方面的某些實施方式中，FZD結合藥劑或多肽或抗體抑制腫瘤生長。本發明還提供抗體18R8、18R5、18R4605、44R24和18R4805及其片段。本發明還提供包含FZD結合藥劑、多肽或抗體的組合物(例如，藥物組合物)。本發明提供在受試者中抑制Wnt信號傳導(例如經典Wnt信號傳導)和/或抑制腫瘤生長的方法，所述方法包括施用治療有效量的FZD結合藥劑或多肽或抗體。還提供了降低腫瘤的致瘤性的方法，所述腫瘤含有癌干細胞。在某些實施方式中，所述方法包括對具有腫瘤的受試者施用治療有效量的FZD結合藥劑或多肽或抗體。在某些實施方式中，通過施用所述抗體減少了腫瘤中癌干細胞的頻率。在某些實施方式中，FZD結合藥劑的施用使得腫瘤中的致瘤性細胞分化為非致瘤狀態。還提供了誘導受試者腫瘤中的細胞進行分化的方法，所述方法包括對所述受試者施用治療有效量的FZD結合藥劑、多肽或抗體。另外提供了治療受試者的癌癥的方法，所述方法包括對所述受試者施用治療有效量的FZD結合藥劑、多肽或抗體。此外，還提供了降低實體瘤基質中的成肌纖維細胞活化的方法，所述方法包括使所述基質接觸治療有效量的FZD結合藥劑、多肽或抗體。在其他方面中，提供了治療與Wnt信號傳導活化有關的疾病的方法。在某些實施方式中，所述方法包括對有需要的受試者施用有效量的FZD結合藥劑、多肽或抗體。在某些實施方式中，所述疾病是癌癥。在某些實施方式中，所述疾病是多囊腎病。在某些實施方式中，所述FZD結合藥劑是與一種或多種人類FZD受體的BBS結合的多肽。在某些實施方式中，所述FZD結合多肽包含與選自由SEQ ID N0:98至SEQID N0:111和SEQ ID NO: 113至SEQ ID NO: 116組成的組的序列具有至少80%同一性的序列。在一些實施方式中，所述FZD結合多肽包含SEQ ID NO: 112的序列。在某些替代性實施方式中，所述FZD結合多肽是18R5。在某些實施方式中，包括施用FZD結合藥劑、多肽或抗體的方法還包括對受試者施用第二抗癌藥劑(例如化療劑)。在某些實施方式中，所述第二藥劑是吉西他濱(gemcitabine)、依立替康(irinotecan)或紫杉醇。在某些實施方式中，所述第二藥劑是血管發生抑制劑和/或Notch信號傳導抑制劑。在另一個方面中，本發明提供包含選自由SEQ ID NO: 10至15組成的組的序列的多肽。同樣提供了包含選自由SEQ ID N0:85至86組成的組的序列的多肽。還提供了包含編碼所述多肽的核酸序列的多核苷酸。
在又一個方面中，本發明提供包含選自由SEQ ID NO: 17至12組成的組的序列的多核苷酸。另外提供了包含選自由SEQ ID N0:87至90、92和94至95組成的組的序列的
多核苷酸。在再一個方面中，本發明提供多核苷酸，所述多核苷酸包含在高嚴謹度條件下與選自由SEQ ID勵17、19、21、87至90、92和94至95組成的組的多核苷酸雜交或者與編碼選自由SEQ ID NO: 10、12、14和85至86組成的組的多肽的多核苷酸雜交的多核苷酸。在某些實施方式中，本發明包括在高嚴謹度條件下與由SEQ ID N0:17、19或21組成的多核苷酸雜交或者與編碼SEQ ID NO: 10、12或14的多核苷酸雜交的多核苷酸。在每個前述方面以及本文所述的其他方面的某些實施方式中，對所述藥劑或多肽或抗體或多核苷酸進行了分離。在某些實施方式中，所述藥劑或多肽或抗體或多核苷酸基本純凈。本發明還提供Wnt基因標簽(gene signature),可用于鑒定可能會對用FZD結合藥劑(例如，人類卷曲受體的拮抗劑和/或fct信號傳導抑制劑)或Wnt信號傳導的其他抑制劑進行的治療產生應答的腫瘤和/或患者。還提供了使用fct基因標簽來選擇可用FZD結合藥劑或fct信號傳導的其他抑制劑治療的患者的方法。在某些實施方式中，所述方法涉及對fct基因標簽中的一種或多種基因的水平進行評估。還提供了篩選可對抗利用fct基因標簽所鑒定的腫瘤的候選藥物的方法。還提供了在所述方法中有用的陣列、試劑盒和其他組合物。本發明還提供篩選Wnt信號傳導抑制劑、潛在候選藥物或其他藥劑的方法。這些方法包括但不限于包括對第一實體瘤中的一種或多種分化標記物的水平和第二實體瘤中的一種或多種分化標記物的水平進行比較的方法，所述第一實體瘤已暴露于所述藥劑，而第二實體瘤未暴露于所述藥劑。在某些實施方式中，這些方法包括(a)使第一實體瘤暴露于所述藥劑，而第二實體瘤不暴露于所述藥劑；(b)對第一實體瘤和第二實體瘤中的一種或多種分化標記物的水平進行評估；和(C)對第一實體瘤和第二實體瘤中的一種或多種分化標記物的水平進行比較。在某些替代性實施方式中，所述方法涉及FZD受體或包含BBS中的一個或多個取代的FZD受體的衍生物，或者已被鑒定為與BBS的一部分結合的多肽或藥劑的應用。正如提供了將這些藥劑用于抑制fct信號傳導和/或治療的方法，同樣也提供了使用篩選方法鑒定的藥劑，或者具有使用所述篩選方法鑒定的藥劑的特性的藥劑。在一個方面中，本發明提供了篩選具有作為Wnt信號傳導抑制劑的活性或可能的活性的測試化合物的方法。在某些實施方式中，所述方法包括將(a)測試化合物對于第一多肽的結合親和力與(b)該化合物對于第二多肽的結合親和力進行比較，所述第一多肽包含在其BBS中具有一個或多個取代的人類FZD受體(例如，FZD8)的Fri結構域，所述第二多肽包含野生型Fri結構域。如果該測試化合物對于所述第二多肽具有比對于所述第一多肽更高的親和力，則該化合物被鑒定為fct信號傳導抑制劑或fct信號傳導的可能抑制劑。在某些實施方式中，所述方法還包括先確定該測試化合物對于所述第一和第二多肽的結合親和力的另外的步驟。還提供了包括突變體Fri結構域的可用于所述法的試劑。還提供了通過這樣的方法鑒定為fct信號傳導抑制劑(或至少為潛在Wnt抑制劑)的藥劑。在另一個方面中，本發明提供了篩選具有作為Wnt信號傳導抑制劑的活性或可能的活性的測試化合物的方法，該方法包括確定所述測試化合物是否能夠與FZD結合藥劑 (該藥劑與BBS結合)競爭對人類FZD受體的結合。在某些實施方式中，該化合物與所述多肽競爭結合的能力表明了該化合物具有作為fct信號傳導抑制劑的活性或可能的活性。在再一個方面中，本發明提供了篩選具有作為Wnt信號傳導抑制劑的活性或可能的活性的測試化合物的替代性方法。在某些實施方式中，所述方法包括確定該測試化合物是否能夠將FZD結合藥劑(該藥劑與BBS結合)從與其結合的所述人類FZD受體上置換下來。如果該測試化合物能夠置換所述FZD結合藥劑，則該化合物具有作為fct信號傳導抑制劑的活性或可能的活性。還提供了在以上所指出的競爭性結合以及置換測定中有用的試劑，所述試劑包括但并不限于下述多肽該多肽包含與選自由SEQ ID N0:98至SEQ IDNO: 111和SEQ ID NO: 113至SEQ ID NO: 116組成的組的序列具有至少約80%的同一性的序列。同樣也提供了通過這種競爭性結合以及置換測試鑒定為fct信號傳導抑制劑(或至少為潛在Wnt抑制劑)的藥劑。在本發明的方面或實施方式用馬庫什組或可選要素的其他分組進行描述時，本發明不僅涵蓋作為一個整體列出的整個組，而且還單獨涵蓋該組中的每個成員以及大組的所有可能的小組，以及缺少一個或多個組成員的大組。本發明還包括在要求保護的發明中明確排除該組中的任何一個或多個成員。


圖I :18R8結合多種人類卷曲受體。FACS分析展示了 18R8與瞬時轉染的HEK293細胞上的FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8序列結合。顯示了 18R8與HEK293細胞結合的FACS繪圖，所述HEK293細胞轉染有編碼所示FZD的表達載體和GFP表達載體。共轉染(GFP陽性)細胞群中染色的升高表明18R8的結合。FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8的FACS繪圖用粗線加框，從而突出這些顯示與18R8結合的FZD。圖2 :抗FZD抗體18R5與細胞上的多種人類卷曲受體結合。FACS分析展示了 18R5同18R8 —樣與細胞上的FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8序列結合。將不同濃度的抗體18R8和18R5與過表達所示FZD的HEK293細胞進行共溫育，并通過流式細胞術評估了抗體的結合。雖然18R8和18R5都與FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8結合，但是18R5的結合具有更高的親和力。圖3 :在穩定表達與熒光素酶連接的8xTCF啟動子元件的STF293細胞中進行了熒光素酶報告基因測定。用含有Wnt3A以及不同濃度的18R8和18R5的條件培養基處理細胞，并隨后在18小時后使用Dual-Glo熒光素酶檢測報告系統(Promega)來進行測定。結果表明18R8和18R5均抑制Wnt信號傳導，而且18R5的結合親和力比18R8更高。圖4 :18R8通過多個Wnt阻斷TCF信號傳導。在穩定表達與熒光素酶連接的8xTCF啟動子元件的STF293細胞中進行熒光素酶報告基因測定。通過使用Fugene 6 (Roche)以編碼所示Wnt蛋白的表達載體轉染HEK293細胞(ATCC)來產生各種過表達Wnt的細胞。用18R8處理STF293細胞并添加過表達Wnt的HEK293細胞，隨后在18小時后使用Dual-Glo熒光素酶檢測報告系統來進行測定。圖5 18R8直接抑制Wnt與FZD的結合。在穩定表達8xTCF啟動子元件的STF293細胞中進行熒光素酶報告基因測定。在用或不用蛋白A瓊脂糖微球的情況下，將如圖所示 含有Wnt3A條件培養基、純化的FZD8-FC和/或18R8的混合物于4°C共溫育2小時。溫育后移除蛋白A瓊脂糖凝膠微球并將其加至STF293細胞。18小時后使用Dual-Glo熒光素酶測定報告系統對經處理的STF293細胞進行測定。該實驗顯示，在無18R8的情況下Fzd8-Fc能夠抑制Wnt3A刺激信號傳導的能力，但是18R8能夠阻斷FZD8與Wnt3A結合的能力，當使用瓊脂糖A微球從共溫育物中除去FZDS-Fc (和18R8)時信號傳導的恢復即證明了這一點。圖6 :對18R8與突變FZD8 (與野生型FZD8相比)的結合的FACS分析。為了評估FZD上的18R8表位，進行了表位作圖研究。在瞬時轉染研究中將編碼GFP的表達載體與表達構建體共同使用，所述表達構建體能夠表達帶N端FLAG標簽和C端⑶4跨膜結構域及細胞內結構域的人類FZD8的Fri結構域。還制備了該表達載體的多種變體，所述變體具有在FZD8序列內的選定氨基酸取代，用來編碼在不與18R8結合的其他特定FZD的Fri結構域中對應位置的氨基酸。隨后通過流式細胞術來評估18R8結合這些FZD8序列變體的能力。如共轉染(GFP陽性)細胞群中的染色降低所示，發現18R8的結合需要FZD8的某些位置的氨基酸，包括FZD8的氨基酸66至71和126至127。以線框突出了顯示18R8與共轉染的細胞群結合的FACS繪圖區域，以粗線顯示表現出顯著下降的18R8結合的氨基酸取代的線框。圖7 :顯示出18R5和18R8在人類FZD8上具有相似的結合表位。使用此前顯示出可破壞18R8結合的一系列氨基酸變體，通過流式細胞術來評估18R5與18R8結合表位的類似表位結合的能力。如共轉染(GFP陽性)細胞群中的染色降低所示，發現與18R8和18R5結合均需要包括FZD8的氨基酸66至71和126至127在內的位置。以線框突出了顯示18R8與共轉染的細胞群結合的FACS繪圖區域，并且加粗了對應于表現出顯著下降的18R8和18R5結合的氨基酸取代的線框。圖8 :各人類卷曲受體Fri結構域序列的部分氨基酸序列間的比較。具有保守殘基的位點以黑色陰影標出；具有相似氨基酸殘基的位點以灰色陰影標出。18R8和18R5的FZD表位包含由下劃線標出且標記為“上邊緣”和“下邊緣”的區域。基于對Fri結構域晶體結構的細查，可認識到這些區域位于FZD蛋白表面上的裂縫兩側，術語“上邊緣”和“下邊緣”則反映了這種認識。所述裂縫包含多個高度保守的殘基。構成該裂縫的氨基酸由比對結果中每個對應位置上的三角形狀符號突出顯示。之前并未認識到該區域的特定功能。對與該區域結合的抗體的發現，對這些抗體抑制fct結合及Wnt信號傳導的發現，以及本發明人對該裂縫的保守性的認識，已使得本發明人能夠將該區域鑒定為FZD蛋白的關鍵功能性部分。圖9 =FZD的生物學結合部位(BBS)。顯示了 Fzd Fri結構域的結構圖像。該圖像基于對之前報導的小鼠FZD8晶體結構的分析(Dann CE等，Nature 412(6842)86-90, 2001)和使用軟件程序Pymol完成的分析。在左上圖中顯示了 FZD Fri結構域的表面視圖，其中Fzd蛋白區域包含以白色橢圓圈出的本發明人已發現的生物學結合部位(BBS)。該區域即抗體18R8和18R5所結合的區域。該區域包含被本發明人稱為“上邊緣”、“下邊緣”和“裂縫”的結構元件。在該圖底部的分開的圖像中用較深的表面著色突出顯示了各所述結構元件。右上圖用較深色表面突出顯示了在10個人類Fzd家族成員的9個或10個中保守的殘基，并且突出了以下認識在兩側為與抑制Fzd功能的抗體結合的表位的“裂縫”區域的中心內出現了這些殘基的明顯集群。圖10 :通過抗FZD的mAb防止Wnt依賴型腫瘤生長。每周對注射有50，000個MMTVWNTl腫瘤來源細胞的N0D/SCID小鼠和腫瘤生長進行監視，直至檢測到生長，隨后每周對腫 瘤生長進行兩次測量。用18R8或作為對照的對照抗體對10只具有已建立腫瘤的小鼠進行治療。與在用對照抗體治療的動物中所觀察到的相比，在用18R8治療的動物中，幾乎消除了腫瘤生長。圖11 :通過18R5與依立替康的組合治療減少0MP-C28異種移植腫瘤的生長。對N0D/SCID小鼠注射10，000個0MP-C28結腸腫瘤細胞，在第24天，將腫瘤平均體積為129mm3的小鼠隨機分組并開始進行所示的治療。每周對腫瘤生長進行監視。在用18R5治療的動物中，腫瘤生長明顯減少。此外，18R5與依立替康的組合與單獨使用其中任何一個藥劑進行的治療相比顯示出明顯的減少。圖12 :通過18R5與吉西他濱的組合治療減少0MP-PN4異種移植腫瘤的生長。對N0D/SCID小鼠注射50，000個0MP-PN4胰腺腫瘤細胞，在第38天，將腫瘤平均體積為約120mm3的小鼠隨機分組并在2天后開始進行所示的治療。與單獨使用吉西他濱的治療相比，在用18R5與吉西他濱組合治療的動物中腫瘤生長明顯減少。圖13 :18R8和18R5的重鏈和輕鏈氨基酸序列，包括VH和VL序列。圖14 :編碼18R8和18R5的重鏈和VH序列的核苷酸序列。圖15 :編碼18R8和18R5的輕鏈和VL序列的核苷酸序列。圖16 :FZD7E⑶Fe蛋白的氨基酸序列及編碼該蛋白的核苷酸序列。圖17 :人類 FZDl (SEQ ID NO: 26)、FZDl 的細胞外結構域(ECD) (SEQ ID NO: 27，顯示為SEQ ID NO:26中帶下劃線的氨基酸I至321)和FZDl的Fri結構域(SEQ IDNO:28)的氨基酸序列。圖18 :人類 FZD2(SEQ ID N0:30)、FZD2 的細胞外結構域(ECD) (SEQ ID NO: 31，顯示為SEQ ID NO:30中帶下劃線的氨基酸I至250)和FZD2的Fri結構域(SEQ IDNO:32)的氨基酸序列。圖19 :編碼人類FZDl的核苷酸序列。圖20 :編碼人類FZD2的核苷酸序列。圖21 :人類 FZD3(SEQ ID N0:34)、FZD3 的細胞外結構域(ECD) (SEQ ID NO: 35，顯示為SEQ ID NO:34中帶下劃線的氨基酸I至204)和FZD3的Fri結構域(SEQ IDNO:36)的氨基酸序列。圖22 :人類 FZD4(SEQ ID N0:38)、FZD4 的細胞外結構域(ECD) (SEQ ID NO: 39，顯示為SEQ ID NO:38中帶下劃線的氨基酸I至224)和FZD4的Fri結構域(SEQ IDNO:40)的氨基酸序列。圖23 :編碼人類FZD3的核苷酸序列。圖24 :編碼人類FZD4的核苷酸序列。圖25 :人類 FZD5(SEQ ID N0:42)、FZD5 的細胞外結構域(ECD) (SEQ ID NO: 43，顯示為SEQ ID NO:42中帶下劃線的氨基酸I至233)和FZD5的Fri結構域(SEQ IDNO:44)的氨基酸序列。圖26 :人類 FZD6(SEQ ID N0:46)、FZD6 的細胞外結構域(ECD) (SEQ ID NO: 47，顯示為SEQ ID NO:46中帶下劃線的氨基酸I至207)和FZD6的Fri結構域(SEQ IDNO:48) 的氨基酸序列。圖27 :編碼人類FZD5的核苷酸序列。圖28 :編碼人類FZD6的核苷酸序列。圖29 :人類 FZD7(SEQ ID N0:50)、FZD7 的細胞外結構域(ECD) (SEQ ID NO: 51，顯示為SEQ ID NO:50中帶下劃線的氨基酸I至255)和FZD7的Fri結構域(SEQ IDNO:52)的氨基酸序列。圖30 :人類 FZD8(SEQ ID N0:54)、FZD8 的細胞外結構域(ECD) (SEQ ID NO: 55，顯示為SEQ ID NO:54中帶下劃線的氨基酸I至277)和FZD8的Fri結構域(SEQ IDNO:56)的氨基酸序列。圖31 :編碼人類FZD7的核苷酸序列。圖32 :編碼人類FZD8的核苷酸序列。圖33 :人類 FZD9(SEQ ID N0:58)、FZD9 的細胞外結構域(ECD) (SEQ ID NO: 59，顯示為SEQ ID NO:58中帶下劃線的氨基酸I至230)和FZD9的Fri結構域(SEQ IDNO:60)的氨基酸序列。圖34 :人類 FZDlO (SEQ ID NO: 62)、FZD10 的細胞外結構域(ECD) (SEQ IDNO:63, M示為SEQ ID N0:62中帶下劃線的氨基酸I至227)和FZDlO的Fri結構域(SEQ ID NO:64)的氨基酸序列。圖35 :編碼人類FZD9的核苷酸序列。圖36 :編碼人類FZDlO的核苷酸序列。圖37 :用18R5抗體與紫杉醇的組合治療減少PE-13乳腺腫瘤的生長。對N0D/SCID小鼠注射10，000個PE-13乳腺腫瘤細胞，在第22天，將腫瘤平均體積為約120mm3的小鼠隨機分組。隨后用對照抗體(“對照Ab”)、18R5抗體(“抗FZD”)、紫杉醇(“Taxol”)或18R5抗體與紫杉醇的組合(“抗FZD+Taxol”)對小鼠進行治療。用18R5抗體與紫杉醇的組合進行的治療具有抗腫瘤活性。圖38 :在用18R5抗體與紫杉醇進行組合治療的個體動物中的乳腺腫瘤生長。用18R5抗體與紫杉醇進行的組合治療導致已建立的乳腺腫瘤的衰退。圖39 :在用對照抗體、18R5抗體、依立替康或18R5抗體與依立替康的組合進行治療后對結腸直腸腫瘤細胞的流式細胞術分析。
圖40 :在植入30、90、270或810個腫瘤細胞后的小鼠中的腫瘤生長，所述腫瘤細胞從已經用對照抗體(“對照”)、18R5抗體(“抗FZD”)、吉西他濱(“吉西他濱”)或18R5與吉西他濱的組合(“組合”)治療41天的小鼠中獲得。圖41 :在用對照抗體(“對照Ab”)、僅用18R5抗體(“抗FZD”)、僅用吉西他濱(“吉西他濱”)或18R5抗體與吉西他濱的組合(“組合”)進行治療后通過有限稀釋分析確定的PN-4胰腺腫瘤中的癌干細胞(CSC)頻率。圖42 :在已用對照抗體(“LZ-1”)、僅用18R5抗體(“18R5”)、僅用吉西他濱(“吉西他濱”)或吉西他濱與18R5的組合(“組合”)進行治療的胰腺腫瘤細胞中的嗜鉻粒蛋白(Chromatogram)基因表達。圖43 :用抗FZD抗體18R5進行的治療促使腫瘤細胞分化為非增殖粘液性細胞。對N0D/SCID小鼠注射50，000個0MP-PN13胰腺腫瘤細胞，在第23天，將腫瘤平均體積為約107mm3的小鼠隨機分組并在4天后開始用對照抗體或18R5進行治療。20天后收集腫瘤并 切片。來自經18R5治療的小鼠或經對照抗體治療的小鼠的腫瘤切片用阿爾新藍染料進行染色以顯示粘液性細胞，并通過用ki67的抗體的免疫組化顯示增殖細胞。用箭頭突出顯示了示例性的粘液性細胞和增殖細胞。圖44 :單獨使用抗FZD抗體18R5或與Taxol (紫杉醇)組合使用的抗FZD抗體18R5抑制0MP-LU24異種移植腫瘤的生長。用對照抗體(“對照Ab ”)、抗FZD的18R5( “18R5”)、Taxol ( “Taxol”)或 18R5 與Taxol 的組合(“ 18R5+Taxol”)對攜帶有0MP-LU24人類肺腫瘤的小鼠進行治療。圖45 單獨使用抗FZD抗體18R5或與Avastin (貝伐單抗)組合使用的抗FZD抗體18R5抑制0MP-LU33異種移植腫瘤的生長。用對照抗體(方形)、Avastin (指向上方的三角形)、抗FZD的18R5(指向下方的三角形)或18R5與Avastin 的組合(圓形)對攜帶有0MP-LU33人類肺腫瘤的小鼠進行治療。圖46 :抗FZD抗體18R5與Herc印tin (曲妥單抗)的組合抑制T3異種移植腫瘤的生長。用對照抗體(方形)、抗FZD的18R5 (三角形),Herceptin (實心圓)或18R5與Herc印tin 的組合(空心圓)對攜帶有T3人類乳腺腫瘤的小鼠進行治療。圖47 :18R5和44R24的Fzd結合圖譜。表示每個mAb與Fzdl、2、5、7和8的結合的劑量響應曲線(Dose-reponse curve) 圖48 18R5和44R24對STF細胞中Wnt3a所誘發的報告基因活性的抑制作用(劑量響應曲線)。圖49 18R5和44R24對axin2基因表達的本底水平的抑制作用。圖50 :對經18R5和44R24治療的0MP-PN13腫瘤中的Mucl6的IHC檢測。圖51 :對經18R5治療的胰腺腫瘤中平滑肌肌動蛋白的抑制作用。A.通過微陣列檢測到的ACTA2基因表達水平。B.對經對照mAb (上圖)和18R5 (下圖)治療的0MP-PN4腫瘤的SMA檢測。圖52 :測試經18R5誘導的Mucl6+0MP_PN13細胞的致瘤性。A.進行Mucl6染色的Iin消減的(lin-cbpleted)0MP-PN13腫瘤細胞的FACS作圖。兩個分選的群用圓圈圈出。B.因注射Mucl6-(上圖)和Mucl6+(下圖)細胞而產生的腫瘤的代表圖。C.腫瘤生長曲線。
圖53 :在PE13乳腺腫瘤異種移植物中抗FZD的mAb 18R5對腫瘤復發的抑制作用。圖54 :抗FZD的mAb 18R5使乳腺的癌干細胞頻率降低。圖55 :在PM胰腺腫瘤異種移植物中抗FZD的mAb 18R5對腫瘤復發的抑制作用。圖56 :在PM胰腺腫瘤異種移植物中抗FZD的mAb 44R24與吉西他濱的組合對腫瘤生長的抑制作用。圖57 :抗FZD的mAb 44R24與突變FZD8 (相對于野生型FZD8)的結合的FACS分析。用線框突出了顯示44R24與共轉染的細胞群結合的FACS圖區域。箭頭標出了那些顯示出顯著下降的44R24結合的氨基酸取代的線框。圖58 :在C25結腸腫瘤異種移植物中抗FZD的抗體44R24和18R5的抗腫瘤活性。圖59 :在用抗FZD的抗體44R24或18R5治療過的C28結腸腫瘤異種移植物中的 細胞角蛋白7表達的誘導。圖60 0MP-18R5結合部位內的殘基影響Wnt結合。A.顯示了 Fzd fri結構域的結構圖。所述圖基于之前報道的小鼠FZD8的晶體結構的分析(Dann CE等，Nature412 (6842) 86-90, 2001)和使用軟件程序Pymol完成的分析。該區域包含了我們稱之為“上邊緣”、“下邊緣”以及“裂縫”的結構元件。左上圖像中顯示了 Fzd fri結構域的表面視圖，其中Fzd蛋白的區域突出顯示了在人類卷曲受體中的9個或10個成員中保守的殘基。右上圖突出顯示了被18R5結合的一些殘基。B.所示的圖像通過灰色突出的顯示描述了在所述裂縫區域中的4個氨基酸取代的位置。列出了人類FZD8中的所述位置和氨基酸取代(單字母氨基酸代碼)。C.研究了在裂縫區域中包含氨基酸取代的變體的FZD-Fc融合蛋白作為水溶性誘餌分子與fct3A結合的能力。在穩定表達8個拷貝的TCF啟動子元件的STF293細胞中進行了熒光素酶報告基因測定。細胞暴露于含有fct3A的培養基以及包含FZD-Fc變體的一系列稀釋培養基18小時，然后使用Dual-Glo熒光素酶檢測報告系統(Promega)來測定熒光素酶活性。結果表明具有所述裂縫區域的氨基酸取代的FZD-Fc的變體與Wnt 3A的結合能力較弱，因此抑制了其通過所述STF293細胞引發Wnt信號傳導的能力。圖61 :鑒定與FZD結合的肽。顯示了測試表達肽的單噬菌體克隆與FZD8-FC或陰性對照蛋白DLL4-FC的結合能力的ELISA數據。箭頭以示例的方式突出了一些陽性克隆。圖62 :FZD結合肽序列的分析。顯示了被發現與FZD特異性地結合的肽序列。鑒定的既有環狀的肽序列也有線狀的肽序列。所述環狀肽顯示出能夠定義共有序列的明顯的序列相似性。由于所述肽文庫不可能含有與該共有序列相關的所有可能的氨基酸變體，因此在該共有序列之外的其他變體有可能也能與FZD結合。所述線狀的肽并沒有顯示較強的共有相似性。然而，這些序列中的一些序列(例如，2#克隆，DTLSALIERGLM(SEQ ID NO: 112))是與FZD的18R5結合區域結合的強有力的FZD結合劑(binders)，并且發現它們在結合對于Wnt-FZD相互作用比較重要的裂縫區域中結合。圖63 =FZD結合肽在18R5結合/Wnt結合區域中的“裂縫”中結合。為了研究所述FZD結合肽與18R5結合區域中的所述“裂縫”相互作用的能力，進行ELISA來測試表達肽的單噬菌體克隆與FZD8-FC或含有在所述裂縫中的氨基酸取代的FZD8-FC變體(Mut 2)，或陰性對照蛋白DLL4-FC結合的能力。所述肽中有許多與FZD8-Mut 2蛋白的結合遠不及與野生型FZD8的結合。一些如箭頭所突出的肽即使與FZD8-Mut 2的結合，也顯示出幾乎沒有的結合能力，表明它們特異性地在所述“裂縫”中結合。所述肽的實例2#克隆具有序列DTLSALIERGLM(SEQ ID NO:112)。圖64:與FZD結合的肽對Wnt信號傳導的抑制作用。顯示了 fct依賴的熒光素酶報告基因研究的結果，所述研究檢測兩條肽(2#和24#克隆)抑制Wnt信號傳導的能力。所述兩條肽通過化學合成產生。將所述肽溶解于二甲亞砜(DMSO)，然后在所述已報告的測定中將其以所示濃度稀釋。所述報告基因檢測利用HEK293細胞，所述HEK293細胞轉染有含響應Wnt的8個拷貝的熒光素酶報告基因的質粒。細胞接觸于fct3A以及所示的肽，接著溫育16小時。使用雙突光素酶測定法(Dual-glo luciferaseassay,Promega)來確定Wnt的活性。圖65 :人類FZD1-5的最小Fri結構域。圖66 :人類FZD6-10的最小Fri結構域.圖67 =^iFZD抗體18R5抑制了一些Wnt誘導經典的信號傳導的能力。 圖68:18R5與FZD的結合抑制了 WNT與FZD的相互作用。
具體實施例方式本發明提供新型藥劑，包括但不限于與一種或多種人類卷曲受體(FZD)結合的多肽(例如抗體)。還提供了相關多肽和多核苷酸、含有FZD結合藥劑的組合物以及制備所述FZD結合藥劑的方法。另外提供了該新型FZD結合藥劑的使用方法，例如抑制腫瘤生長和/或治療癌癥的方法。本發明在部分上基于對人類卷曲受體中的一個區域的鑒定，所述區域是結合FZD的抗癌藥劑的適合靶標。發現兩種抗FZD抗體，18R8和18R5，與FZD7特異性地結合，還與FZD1、FZD2、FZD5和FZD8發生交叉反應(下文實施例I和2)。用18R8抗體進行的體外實驗表明該抗體能夠抑制fct信號傳導(下文實施例3)并抑制Wnt配體與FZD8的結合(下文實施例4)。在基于細胞的測定中，還已顯示18R5抗體同樣能夠抑制Wnt信號傳導(下文實施例3和20)。用18R5抗體進行的體內實驗表明該抗體能夠抑制腫瘤生長或復發(下文實施例7、17和23)。本發明人還展示了抗FZD抗體18R5能夠降低腫瘤中的癌干細胞頻率(下文實施例8和23)并誘發腫瘤細胞的分化和/或降低腫瘤細胞致瘤性(下文實施例16、21、22和25)。用這些活性18R8和18R5抗體進行的表位作圖實驗表明這些抗體均可與FZD8中的序列GLEVHD(SEQ IDNO:25)的至少一部分和序列YGFA(SEQ ID NO:74)的至少一部分結合(下文實施例5)。根據所展示的這兩種抗體的生物活性，對小鼠卷曲蛋白8的晶體結構(Dann等，Nature, 412:86-90 (2001))進行了分析，并將包含這些此前并未認為有任何特殊功能的序列的卷曲蛋白的細胞外區域首次鑒定為在FZD生物學和Wnt信號傳導中起到重要功能性作用(實施例6)。人類卷曲受體的稱為生物學結合部位(BBS)的這一區域是抗癌治療的適合靶標。此外，發現第三種抗體44R24特異性地結合人類FZD5和FZD8 (下文實施例19)。已另外顯示，該抗體能夠在基于細胞的測定中抑制fct信號傳導(下文實施例20)并在體內具有抗腫瘤效用(下文實施例23和25)。和用抗FZD抗體18R8和18R5進行的治療相同，用44R24對腫瘤進行的治療致使該腫瘤中的分化標記物水平升高(下文實施例25)。表位作圖還已顯示，抗FZD抗體44R24的表位與抗FZD抗體18R8和18R5的表位存在重疊。更具體而言，已顯示44R24與BBS中的區域YGFA (SEQ IDNO: 74)的至少一部分結合(下文實施例24)。I.定義為了便于理解本發明，下文定義了多個術語和短語。術語“抗體”指免疫球蛋白分子，其通過在該免疫球蛋白分子可變區內的至少一個抗原識別部位識別并特異性地結合靶標，例如蛋白、多肽、肽、糖類、多核苷酸、脂質或其組合。本文所用的術語“抗體”涵蓋完整多克隆抗體、完整單克隆抗體、抗體片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段)、單鏈Fv(ScFv)突變物、從至少兩種完整抗體產生的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體、含有抗體的抗原決定部位的融合蛋白以及含有抗原識別部位的任何其他經修飾的免疫球蛋白分子，只要這些抗體顯示出所需的生物活性即可。根據抗體的重鏈恒定域(分別稱為α、δ、ε、Y和μ)，抗體可以是5種主要類別的免疫球蛋白(IgA、IgD, IgE, IgG和IgM)或其亞類(同型)(例如IgGl、 IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)中的任何一種。不同類別的免疫球蛋白具有不同且公知的亞基結構和三維構造。抗體可以是裸抗體，或者與諸如毒素、放射性同位素等其他分子偶聯。術語“抗體片段”指完整抗體的一部分，和指完整抗體的抗原決定可變區。抗體片段的實例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、線狀抗體、單鏈抗體以及由抗體片段形成的多特異性抗體。“單克隆抗體”指參與高特異性地識別并結合單一抗原決定簇或表位的同源抗體群。與之相反的多克隆抗體則通常包括針對不同抗原決定簇的不同抗體。術語“單克隆抗體”涵蓋完整全長單克隆抗體和抗體片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、單鏈(scFv)突變物、含有抗體部分的融合蛋白以及含有抗原識別部位的任何其他經修飾的免疫球蛋白分子。另外，“單克隆抗體”指以包括但不限于雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達和轉基因動物的多種方式制成的此類抗體。術語“人源化抗體”指含有最少的非人類(例如鼠類)序列的非人類(例如鼠類)抗體形式，所述形式有特異性免疫球蛋白鏈、嵌合免疫球蛋白或其片段。通常，人源化抗體是人類免疫球蛋白，其中來自互補決定區(CDR)的殘基被來自非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠)的CDR的具有所需的特異性、親和力和能力的殘基所替換(Jones等，1986，Nature, 321:522-525 ;Riechmann 等，1988，Nature, 332:323-327 ；Verhoeyen 等，1988，Science, 239:1534-1536)。在一些情況中，用來自非人類物種的具有所需的特異性、親和力和能力的抗體的殘基替換人類免疫球蛋白的Fv骨架區(FR)的相應殘基。通過在Fv骨架區和/或已替換的非人類殘基中進行附加殘基的取代，可以進一步修飾人源化抗體，從而改進和優化抗體特異性、親和力和/或能力。一般而言，人源化抗體會基本上完整地包含至少一個、通常為兩個或三個可變區，所述可變區含有全部或基本上全部與非人類免疫球蛋白對應的CDR區，然而全部或基本上全部FR區都屬于人類免疫球蛋白共有序列。人源化抗體還可以包含免疫球蛋白(通常為人類免疫球蛋白)的恒定區或結構域(Fe)的至少一部分。在美國專利第5，225，539號中描述了用來產生人源化抗體的方法的實例。術語“人類抗體”指由人類產生的抗體，或者是用任何本領域已知的技術制備的具有與人類所產生的抗體對應的氨基酸序列的抗體。人類抗體的這種定義包括完整或全長抗體、其片段和/或包含至少一個人類重鏈和/或輕鏈多肽的抗體(例如包含鼠類輕鏈和人類重鏈多肽的抗體)。術語“嵌合抗體”指免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自兩種或更多種物種的抗體。通常，其輕鏈和重鏈的可變區對應于源自一種哺乳動物物種(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所需的特異性、親和力和能力的抗體的可變區，而恒定區則與源自另一物種(通常為人類)的抗體中的序列同源，從而避免在該物種中引起免疫應答。術語“表位”或“抗原決定簇”在本文中可互換使用，指能夠被特定抗體識別并特異性地結合的抗原的部分。當抗原是多肽時，表位能夠由連續氨基酸構成，也能夠由通過蛋白的三級結構折疊而并置的不連續氨基酸構成。由連續氨基酸構成的表位通常在蛋白變性時得以保留，然而通過三級結構折疊形成的表位通常在蛋白變性時丟失。表位通常包括具有獨特空間構象的至少3個、更常見為至少5個或8至10個氨基酸。抗體“特異性地結合”表位或蛋白是指該抗體與表位或蛋白的反應或聯結比替代 性物質(包括無關蛋白)更頻繁、更快速、時間更長、親和力更強或上述情況的某些組合。在某些實施方式中，“特異性地結合”是指，例如，抗體與蛋白結合的KD值為約O. ImM以下，但更常見為小于約ΙμΜ。在某些實施方式中，“特異性結合”指抗體與蛋白結合的KD有時為至少約O. I μ M以下，而在其他時候為至少約O. 01 μ M以下。由于不同物種中同源蛋白之間的序列同一性，特異性結合可以包括對多于一種的物種中的特定蛋白(例如卷曲受體)進行識別的抗體。同樣，由于不同FZD受體(例如，FZD5和FZD8)之間在這些受體多肽序列的某些區域中存在同源性，特異性結合可以包括對多于一種的卷曲受體進行識別的抗體(或其他多肽或藥劑)。應了解的是，與第一靶標特異性結合的抗體或結合部分，可以與或可以不與第二靶標特異性結合。如此而言，“特異性結合”不必需要(雖然其可以包括)排他性結合，即與單一靶標結合。因此，在某些實施方式中，抗體可以特異性結合多于一種的靶標(例如人類FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8)。在某些實施方式中，抗體上的相同抗原結合部位可以結合多個靶標。舉例而言，在某些情況中，抗體可以含有兩個相同的抗原結合部位，其中每個部位都特異性地結合兩種或更多種人類卷曲受體(例如人類FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8)。在某些替代性實施方式中，抗體可以是雙特異性的，并且含有特異性不同的至少兩個抗原結合部位。以非限制性的實例而言，雙特異性抗體可以具有一個識別一種卷曲受體(例如人類FZD5)上的表位的抗原結合部位，并且還具有識別第二種卷曲受體(例如人類FZD8)上的不同表位的另一不同的抗原結合部位。一般而言，但不必需，述及結合是指特異性結合。“已分離的”多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物是指處于非自然發現形式的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物。已分離的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物包括經純化達到不再處于其在自然中所發現形式的程度的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物。在一些實施方式中，已分離的抗體、多核苷酸、載體、細胞或組合物基本純凈。本文所用的“基本純凈”指為至少50%純凈(即無雜質)、更優選為至少90%純凈、再優選為至少95%純凈、再更優選為至少98%純凈、進一步優選為至少99%純凈的材料。術語“癌癥”和“癌癥的”是指或用于描述哺乳動物的生理病癥，其中一群細胞的特征在于失調的細胞生長。癌癥的實例包括但不限于癌腫、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤和白血病。此類癌癥更特定的實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀上皮腫瘤、腹膜癌、肝細胞癌(h印atocellular cancer)、胃腸癌、胰腺癌、成膠質細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝細胞瘤、乳腺癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜瘤或子宮瘤、唾液腺瘤、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝臟癌(hepaticcarcinoma)以及各類型的頭頸部癌癥。“腫瘤”和“贅生物”是指因過度細胞生長或增殖而產生的任何良性(非癌性)或包括癌前病灶在內的惡性(癌性)組織團塊。術語“癌干細胞”、“腫瘤干細胞(tumor stem cell) ”或“實體瘤干細胞(solidtumor stem cell) ”在本文中可互換使用，是指來自實體瘤的具有下述特征的細胞群(I)具有較強的增殖能力；(2)能夠進行非對稱細胞分裂從而產生一種或多種具有減弱的增殖或發育潛能的分化的后代；和(3)能夠進行對稱分裂用于自我更新或自我維持。在對免疫功能低下的小鼠進行連續移植時，“癌干細胞”、“腫瘤干細胞”或“實體瘤干細胞”的這些性質使這些癌干細胞與大多數不能形成腫瘤的腫瘤細胞相比能夠形成可觸知的腫瘤。相對于分 化，癌干細胞以無序的方式進行自我更新，從而形成具有異常細胞類型的腫瘤，所述異常細胞類型在發生突變時能夠隨時間發生變化。術語“癌細胞”、“腫瘤細胞”和語法上等價的詞語是指源自腫瘤或癌前病灶的總細胞群，包括非致瘤性細胞(其包括大量的腫瘤細胞群)和致瘤干細胞(癌干細胞)。在僅述及缺少更新及分化能力的那些腫瘤細胞時，以術語“非致瘤”修飾本文所用的術語“腫瘤細胞”，從而將這些腫瘤細胞與癌干細胞區分開。術語“致瘤性”是指實體瘤干細胞的功能性特征，其包括自我更新性質(產生額外的致瘤性癌干細胞)和增殖以產生使實體瘤干細胞形成腫瘤的全部其他腫瘤細胞(產生分化的因而不具有非致瘤性的腫瘤細胞)的性質。在對免疫功能低下的小鼠進行連續移植時，這些自我更新和增殖以產生全部其他腫瘤細胞的性質使得癌干細胞與非致瘤性腫瘤細胞相比能夠形成可觸知的腫瘤，所述非致瘤性腫瘤細胞在進行連續移植時不能形成腫瘤。已觀察到，在從實體瘤獲得腫瘤細胞后對免疫功能低下的小鼠進行初次移植時，非致瘤性腫瘤細胞可以形成腫瘤，但是進行連續移植時，這些非致瘤性腫瘤細胞不產生腫瘤。術語“受試者”是指任何動物(例如，哺乳動物)，包括但不限于人類、非人類靈長動物和嚙齒動物等，其將是特定治療的接受者。通常，術語“受試者”和“患者”在述及人類受試者時可在本文中互換使用。“制藥上可接受的鹽”是指在制藥上可接受的化合物的鹽，其具有母化合物的所需
藥理學活性。“制藥上可接受的賦形劑、運載體(carrier)或佐劑”是指能夠與本發明的至少一種抗體一起對受試者進行施用、不破壞其藥理學活性而且在以足以遞送治療量的化合物的劑量施用時無毒性的賦形劑、運載體或佐劑。“制藥上可接受的載質”是指與本發明的至少一種抗體一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或運載體。術語“治療有效量”是指用來有效地“治療”受試者或哺乳動物的疾病或病癥的抗體、多肽、多核苷酸、有機小分子或其他藥物的量。對于癌癥，治療有效量的藥物能夠減少癌細胞數量；減小腫瘤尺寸；抑制或阻止癌細胞浸潤至周邊器官，所述浸潤包括例如癌擴散至軟組織和骨中；抑制并阻止腫瘤轉移；抑制或阻止腫瘤生長；一定程度上減輕與癌癥相關的一種或多種癥狀；降低發病率和死亡率；提高生命質量；降低腫瘤的致瘤性、致瘤率或致瘤能力；減少腫瘤中癌干細胞的數量或頻率；使致瘤性細胞分化為非致瘤狀態；或者這些效果的組合。對于藥物防止生長和/或殺死已存在的癌細胞的情況，可稱之為細胞抑制和/或細胞毒性。諸如“治療，，(“treating，，或“treatment，，或“treat”)或“減輕，，(“alleviating”或“alleviate”)等術語是指I)治愈、緩解、減少已診斷出的病理狀態或病癥的癥狀和/或使所述病理狀態或病癥停止進展的治療措施，和(2)預防和/或減緩目標病理狀態或病癥的發展的預防性或防止性措施。因此，需要治療的對象包括已經患有病癥的對象、易于患有病癥的對象和要防止病癥的對象。在某些實施方式中，如果患者顯示出一種或多種的下述現象，則根據本發明的方法對受試者成功地進行了癌癥“治療”，所述現象為癌細胞數量 減少或完全消失；腫瘤尺寸減小；癌細胞向周邊器官的浸潤受到了抑制或消失，所述浸潤包括例如癌擴散至軟組織和骨中；使腫瘤轉移受到了抑制或消失；使腫瘤生長受到了抑制或消失；使與特定癌癥相關的一種或多種癥狀減輕；發病率和死亡率降低；提聞生命質量；腫瘤的致瘤性、致瘤率或致瘤能力降低；腫瘤中癌干細胞的數量或頻率減少；致瘤性細胞分化為非致瘤狀態；或者這些效果的某種組合。“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互換使用，指任何長度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。所述核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾的核苷酸或堿基和/或其類似物、或者能夠通過DNA聚合酶或RNA聚合酶引入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包括經修飾的核苷酸，例如甲基化核苷酸及其類似物。如果存在對核苷酸結構的修飾，其可以在聚合物裝配之前或之后進行。非核苷酸成分可以中斷核苷酸序列。在聚合后可以進一步對多核苷酸進行修飾，例如通過與標記成分偶聯。其他類型的修飾包括例如“封端”;用類似物取代一種或多種天然存在的核苷酸；核苷酸間修飾，例如具有無電荷鍵的修飾(例如甲基磷酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物、氨基甲酸酯等)和帶電鍵的修飾(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、含有懸突部分(pendant moiety)例如蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、多聚L-賴氨酸等)的修飾、以嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素等)進行的修飾、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的修飾、含有烷化劑的修飾、帶有經修飾鍵(例如α異頭核酸等)的修飾；以及多核苷酸的未修飾形式。另外，對于通常存在于糖中的任何羥基，可以將其置換為例如膦酸酯基團、磷酸酯基團，可以用標準保護基對其進行保護，或者可以將其激活從而制備與其他核苷酸的額外鍵，或者可以使其與固體支持物偶聯。可以用胺或含有I至20個碳原子的有機封端基團部分來取代或磷酸化5’端和3’端0Η。還可以使其他羥基衍生為標準保護性基團。多核苷酸還可以包含本領域中公知的核糖或脫氧核糖的類似物形式，包括例如2’ -O-甲基核糖、2’ -O-烯丙基核糖、2’ -氟代核糖、2’ -疊氮基核糖、碳環糖類似物、α異頭糖、差向異構糖(例如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、無環類似物以及非堿基核苷類似物(例如甲基核糖苷)。可以用替代性連接基團來置換一個以上的磷酸二酯鍵。這些替代性連接基團包括但不限于下述實施方式其中用P (O) S ( “硫代酯”)、P (S) S ( “二硫代酯”)、” (O) NR2 ( “酰胺化物”)、Ρ (O)R、P(0)0R’、C0*CH2( “甲乙縮醛”)置換磷酸酯，其中R或R’各自獨立地為H或者為具有取代基或不具有取代基的烷基(I至20C)并可選地包含醚(一0—)鍵、芳基、鏈烯基、環烷基、環烯基或芳烷基(araldyl)。在一個多核苷酸中并不需要所有鍵都相同。以上描述對本文述及的所有多核苷酸(包括RNA和DNA)都適用。抗體的“可變區”可以單獨指抗體輕鏈的可變區或抗體重鏈的可變區，也可以指其組合。重鏈和輕鏈的可變區各自由4個框架區(FR)組成，所述4個框架區由三個互補決定區(CDR)(也稱高變區)連接。FR使每個鏈中的CDR近距離地聚集在一起，所述CDR與另一條鏈的CDR—起促成抗體的抗原結合部位的形成。至少有兩種用于確定⑶R的技術(1)基于跨物種序列變異性的方法(即Kabat等，Sequences of ProteinsofImmunological Interest,(第 5 版，1991，National Institutes of Health, BethesdaMd.));和(2)基于對抗原-抗體復合體的晶體學研究的方法(ΑΙ-lazikani等，(1997)J. Molec. Biol. 273:927-948)。此外，在本領域中有時使用這兩種方法的組合來確定CDR。術語“載體”是指能夠在宿主細胞中傳遞、優選表達一種或多種所感興趣的基因或 序列的構建體。載體的實例包括但不限于病毒載體、裸DNA或RNA表達載體、質粒、粘粒或噬菌體載體、與陽離子凝縮劑(cationic condensing agent)聯結的DNA或RNA表達載體、包裹在脂質體中的DNA或RNA表達載體以及某些真核生物細胞(例如產病毒細胞(producercell))。術語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互換使用，用來指任何長度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是鏈狀或分枝狀，可以包含經修飾的氨基酸，并且可以由非氨基酸中斷。該術語還涵蓋經天然修飾或干預修飾的氨基酸聚合物；例如，二硫鍵的形成、糖基化、月旨化、乙酰化、磷酸化或任何其他操縱或修飾(例如與標記成分偶聯)。本定義還包括例如含有一個或多個氨基酸類似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本領域中已知的其他修飾的多肽。應了解的是，因為本發明的多肽以抗體為基礎，在某些實施方式中，該多肽可以作為單個的鏈或聯結的鏈出現。在述及兩個以上核酸或多肽時，術語“同一的”或百分比“同一性”是指在進行比較和比對(如有必要則引入空位)以獲得最大對應時，兩個以上的序列或子序列相同或具有特定比例的相同核苷酸或氨基酸殘基，且未將任何保守性氨基酸取代考慮為序列同一性的一部分。使用序列比較軟件或算法或者通過目視檢查，可以測量百分比同一性。可以用來獲得對氨基酸或核苷酸序列的比對的各種算法和軟件在本領域中是已知的。序列比對算法的一個這種非限制性實例是在Karlin等，1990, Proc.Natl. Acad. Sci, 87:2264-2268 中描述的算法，并在 Karlin 等，1993, Proc. Natl. Acad.Sci, 90:5873-5877中對其進行了修改，且整合到了 NBLAST和XBLAST程序中(Altschul等，1991，Nucleic Acids Res.，25:3389-3402)。在某些實施方式中，可以使用在 Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.，25:3389-3402 中所描述的空位 BLAST (Gapped BLAST)。BLAST-2、WU-BLAST-2 (Altschul 等，1996，Methods in Enzymology，266:460-480)、ALIGN、ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California)或 Megalign (DNASTAR)是能夠用來進行序列比對的其他公用軟件程序。在某些實施方式中，使用GCG軟件中的GAP程序(例如，使用NWSgapdna. CMP矩陣，且空位權重為40、50、60、70或90，長度權重為1、2、3、4、5或6)來確定兩個核苷酸序列間的百分比同一性。在某些替代性實施方式中，可以使用整合有Needleman 和 Wnsch 的算法(J. Mol. Biol. (48) :444-453(1970))的 GCG 軟件包中的 GAP 程序來確定兩個氨基酸序列間的百分比同一'丨生(例如，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，且空位權重為16、14、12、10、8、6或4，長度權重為1、2、3、4、5)。作為另一種選擇，在某些實施方式中，使用Myers和Miller算法(CABIOS，4:11-17 (1989))來確定核苷酸或氨基酸序列間的百分比同一性。舉例而言，可以使用ALIGN程序(2.0版)來確定百分比同一性，其中使用帶殘基表的PAM120，且空位長度罰分為12，空位罰分為4。本領域技術人員能夠確定適合的參數來獲得特定比對軟件的最大比對。在某些實施方式中，使用比對軟件的缺省參數。在某些實施方式中，第一氨基酸序列相對于第二序列氨基酸的百分比同一性“X”用100X (Y/Z)計算，其中Y是在第一和第二序列的比對(通過目視檢查或特定序列比對程序所做的比對)中評分為相同匹配的氨基酸殘基數，而Z是第二序列中的殘基總數。如果第一序列的長度長于第二序列，則第一序列相對于第二序列的百分比同一性將長于第二序列相對于第一序列的百分比同一性。作為非限制性的實例，在某些實施方式中，使用Bestfit程序(WisconsinSequenceAnalysis Package,版本 8(用于 Unix 平臺),Genetics ComputerGroup, UniversityResearch Park, 575Science Drive, Madison, WI 53711)能夠確定任何 特定的多核苷酸是否具有相對于參照序列的某個百分比的序列同一性(例如，至少80%同一性、至少85%同一性、至少90%同一性、以及在一些實施方式中至少95%、96%、97%、98%或 99% 同一性)。Bestf it 使用 Smith 和 Waterman, Advances in Applied Mathematics2:482489(1981)的局部同源性算法來發現兩個序列間的最佳同源性片段。當使用Bestfit或任何其他序列比對程序來確定特定序列與本發明的參照序列是否具有例如95%同一性時，對參數進行設置從而使得基于參照核苷酸序列的全長來計算同一性的百分比，并且允許同源性中的空位最多為參照序列中核苷酸總數的5%。在一些實施方式中，本發明的兩種核酸或多肽基本一致，即在進行比較和比對以獲得最大對應時，通過用序列比較算法或目視檢查來測量的其核苷酸或氨基酸殘基同一性為至少70%、至少75%、優選至少80%、更優選至少85%、進一步優選至少90%以及在一些實施方式中為至少95%、96%、97%、98%、99%。優選的是，同一性存在于長度至少為約10個殘基、優選為約20個殘基、更優選為約40至60個殘基或其間任何整數值的序列區域，優選存在于長于60至80個殘基的區域，更優選為至少約90至100個殘基的區域，并且最優選為與所對比的序列全長基本相同的序列(例如核苷酸序列的編碼區)。“保守性氨基酸取代”是用具有相似側鏈的另一氨基酸殘基置換某個氨基酸殘基的取代。具有相似側鏈的氨基酸殘基家族在本領域已有界定，其包括堿性側鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、無電荷極性側鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分枝側鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香側鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。舉例而言，用苯丙氨酸取代酪氨酸是保守性取代。優選的是，本發明的多肽和抗體序列中的保守性取代并不會使含有該氨基酸序列的多肽或抗體與抗原(即，該多肽或抗體所結合的一種或多種人類卷曲受體)的結合消失。鑒定不會消除抗原結合的核苷酸和氨基酸保守性取代的方法已為本領域所公知(參見例如Brummell等，Biochem. 32:1180-1187 (1993)；Kobayashi 等，Protein Eng. 12(10) : 879-884 (1999)；和 Burks 等，Proc. Natl. Acad. SciUSA 94:· 412-417(1997))。
如在本公開和權利要求中所用的，除非上下文另外明確指出，否則單數形式“一”、“一個”和“一種”包括復數形式。應了解的是，在本文中用詞語“包括”來描述實施方式的任何情況下，還提供了用“由…組成”和/或“基本由…組成”描述的其他類似的實施方式。本文中在諸如“A和/或B”等短語中使用的術語“和/或”意在包括“A和B”、“A或B”、“A”和“B”。同樣地，在諸如“A、B和/或C”等短語中使用的術語“和/或”意在涵蓋每種下述實施方式:A、B和C ;A、B或C ;A或C ;A或B ;B或C ;A和C ;A和B ;B和C ;僅A ;僅B ;以及僅C。“高嚴謹度條件”可以通過以下條件來確定(I)采用低離子強度和高溫度來洗滌，例如O. 015M氯化鈉/0. 0015M檸檬酸納/0. 1%十二烷基硫酸鈉，50°C ； (2)在雜交過程中采用變性劑(例如甲酰胺)，例如含O. 1%牛血清白蛋白的50% (體積/體積)甲酰胺/0. 1%聚蔗 糖(Ficoll)A). 1%聚乙烯吡咯烷酮/含750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉的50mM磷酸納緩沖液(pH6. 5)，42°C;或(3)于 42°C采用 50% 甲酰胺、5 X SSC (O. 75MNaCl，0. 075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸納(PH6. 8)、O. 1%焦磷酸鈉、5 X Denhardt溶液、經超聲處理的鮭魚精子DNA (50 μ g/ml)、0. 1% SDS和10%硫酸葡聚糖，并且于42°C進行洗滌，于55°C置于O. 2 X SSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)和50%甲酰胺中，隨后于55 °C進行由含有EDTA的O. IXSSC組成的高嚴謹度洗滌。II. FZD結合藥劑本發明提供與一種或多種人類卷曲受體(FZD)特異性地結合的藥劑。在本文中將這些藥劑稱為“FZD結合藥劑”。在某些實施方式中，所述藥劑特異性地結合兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或十種卷曲受體。所述藥劑所結合的人類卷曲受體可以選自由 FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9 和 FZDlO 組成的組。在某些實施方式中，所述一種或多種人類卷曲受體包括FZDI、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8。在某些實施方式中，所述一種或多種人類卷曲受體包括FZD7。在某些實施方式中，所述一種或多種人類卷曲受體包括FZD5和/或FZD8。在某些實施方式中，所述藥劑特異性地結合FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8。FZDl至FZDlO的全長氨基酸(aa)和核苷酸(nt)序列在本領域中已知，并且還在本文中提供為SEQ ID NO: 26 (FZDI aa)、SEQ ID N0:30(FZD2aa), SEQ ID N0:34(FZD3 aa)、SEQ ID N0:38(FZD4 aa)、SEQ ID N0:42(FZD5 aa)、SEQ IDN0:46(FZD6aa)、SEQ ID N0:50(FZD7 aa)、SEQ ID N0:54(FZD8 aa)、SEQ ID N0:58(FZD9aa), SEQ ID N0:62(FZD10 aa)、SEQ ID NO: 29 (FZDI nt)、SEQ ID N0:33(FZD2 nt)、SEQIDN0:37(FZD3 nt)、SEQ ID N0:41(FZD4 nt)、SEQ ID N0:45(FZD5 nt)、SEQ IDNO :49 (FZD6nt),SEQ ID N0:53(FZD7 nt),SEQ ID N0:57(FZD8 nt),SEQ ID N0:61(FZD9 nt)和SEQ IDN0:65(FZD10 nt)。在某些實施方式中，本文所述的抗體或其他多肽或藥劑特異性地結合FZD7。在某些實施方式中，該抗體、多肽或藥劑還可以與一種或多種其他人類卷曲受體特異性地結合或發生交叉反應。在某些實施方式中，本文所述的抗體或其他多肽或藥劑特異性地結合FZD5。在某些實施方式中，該抗體、多肽或藥劑還可以與一種或多種其他人類卷曲受體特異性地結合或發生交叉反應。
在某些實施方式中，所述藥劑特異性地結合兩種或更多種人類卷曲受體。在某些實施方式中，所述兩種或更多種人類卷曲受體選自由FZD2、FZD5、FZD7和FZD8組成的組。在某些實施方式中，所述兩種或更多種人類卷曲受體包括FZDl和選自由FZD2、FZD5、FZD7和FZD8組成的組的第二種人類卷曲受體。在某些實施方式中，所述兩種或更多種人類卷曲受體包括FZD2和選自由FZD1、FZD5、FZD7和FZD8組成的組的第二種卷曲受體。在某些實施方式中，所述兩種或更多種人類卷曲受體包括FZD5和選自由FZD1、FZD2、FZD7和FZD8組成的組的第二種卷曲受體。在某些實施方式中，所述兩種或更多種人類卷曲受體包括FZD5和FZD8。在某些實施方式中，所述兩種或更多種人類卷曲受體包括FZD7和選自由FZD1、FZD2、FZD5和FZD8組成的組的第二種人類卷曲受體。在某些實施方式中，所述藥劑特異性地結合三種或更多種人類卷曲受體。在某些實施方式中，所述三種或更多種人類卷曲受體包括選自由FZDI、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8組成的組的三種或更多種卷曲受體。在某些實施方式中，所述藥劑還特異性地結合一種或多種其他人類卷曲受體。 在某些實施方式中，所述藥劑或抗體特異性地與其所結合的一種或多種人類卷曲受體中的細胞外結構域(ECD)結合。每種人類卷曲受體的細胞外結構域的序列在本領域中已知，且還將其提供為 SEQ ID N0:27(FZD1ECD)、SEQ ID N0:31(FZD2 ECD)、SEQ IDN0:35(FZD3 ECD)、SEQ ID N0:39(FZD4 ECD)、SEQ ID NO:43(FZD5ECD)、SEQ ID N0:47(FZD6ECD)、SEQ ID N0:51(FZD7 ECD)、SEQ ID NO:55(FZD8ECD)、SEQ ID N0:59(FZD9 ECD)和SEQID N0:63(FZD10 ECD)。在某些實施方式中，所述藥劑或抗體特異性地與其所結合的人類卷曲受體中的Fri結構域(FRI)(亦稱富含半胱氨酸的結構域(CRD))結合。每種人類卷曲受體的Fri結構域的序列在本領域中已知，且還將其提供為SEQ ID NO: 28 (FZD I FRI), SEQ IDN0:32(FZD2FRI),SEQ ID NO:36 (FZD3 FRI)、SEQ ID NO:40(FZD4 FRI),SEQ IDNO:44(FZD5 FRI)、SEQ IDNO:48(FZD6 FRI)、SEQ ID N0:52(FZD7 FRI),SEQ IDN0:56(FZD8 FRI)、SEQ ID N0:60(FZD9FRI)和 SEQ ID NO:64(FZD10 FRI)。在某些實施方式中，本文所述的FZD結合抗體或多肽的單個抗原結合部位結合或能夠結合一種、兩種、三種、四種或五種(或更多種)人類卷曲受體。在某些實施方式中，所述FZD結合抗體或多肽的單個抗原結合部位能夠特異性地結合選自由FZDl、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8組成的組一種、兩種、三種、四種或五種人類卷曲受體。在某些實施方式中，所述抗體或多肽的單個結合部位特異性地結合至少FZD5和FZD8。在某些實施方式中，所述FZD結合藥劑或抗體結合一種或多種(例如兩種或更多種、三種或更多種或四種或更多種)人類卷曲受體，且其解離常數(KD)為約IyM或更低、約IOOnM或更低、約40nM或更低、約20nM或更低或者約IOnM或更低。舉例而言，在某些實施方式中，本文所述的與一種或多種FZD結合的FZD結合藥劑或抗體，與這些FZD結合的KD為約IOOnM或更低、約20nM或更低或者約IOnM或更低。在某些實施方式中，FZD結合藥劑或抗體與FZDU FZD2、FZD5、FZD7和FZD8中的一種或多種(例如，1、2、3、4或5種)的每一種結合的解離常數為約40nM或更低。在某些實施方式中，FZD結合藥劑或抗體與FZDl、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8中的一種或多種的每一種結合的解離常數為約IOnM或更低。在某些實施方式中，FZD結合藥劑或抗體與FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8中的每一種結合的解離常數為約IOnM或更低。在某些實施方式中，所述藥劑或抗體與特定FZD結合的解離常數是通過使用固定在Biacore芯片上的FZD-Fc融合蛋白而確定的解離常數,所述融合蛋白含有FZD細胞外結構域或Fri結構域。在某些實施方式中，所述FZD結合藥劑或抗體以約InM至約IOnM的解離常數結合下述FZD中的一種或多種中的每一種FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8。作為另一種選擇，所述FZD結合藥劑或抗體以約InM至約IOnM的解離常數結合下述FZD中的兩種或更多種(或三種或更多種)？201420242054207和？208。在某些其他實施方式中，所述FZD結合藥劑或抗體以約InM至約IOnM的解離常數結合FZD5和FZD8中的每一種。在某些實施方式中，所述FZD結合藥劑或抗體以至少約3nM的解離常數與FZD8結合。在某些實施方式中，所述FZD結合藥劑或抗體以約3nM至30nM的解離常數與FZD8結合。在某些替代性實施方式中，結合FZD8解離常數的可以約為3nM至ΙΟηΜ。在某些實施方式中，FZD結合藥劑或抗體結合一種或多種(例如兩種或更多種、三 種或更多種或四種或更多種)人類卷曲受體，且其EC5tl為約I μ M或更低、約IOOnM或更低、約40ηΜ或更低、約20ηΜ或更低、約IOnM或更低或者約InM或更低。舉例而言，在某些實施方式中，本文所述的與多于一種FZD結合的FZD結合藥劑或抗體相對于這些FZD的EC5tl為約40ηΜ或更低、約20ηΜ或更低或者約IOnM或更低。在某些實施方式中，FZD結合藥劑或抗體相對于FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8中的一種或多種(例如，1、2、3、4或5種)的EC50為約20nM或更低。在某些實施方式中，FZD結合藥劑或抗體相對于FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8中的一種或多種(例如，1、2、3、4或5種)的EC50為約IOnM或更低。在某些實施方式中，FZD結合藥劑或抗體對于結合FZD5和/或FZD8的EC5tl為約40nM或更低或者20nM或更低。在某些實施方式中，FZD結合藥劑(例如抗體)與下述表位結合所述表位與具有包含SEQ ID NO: 10的重鏈可變區和包含SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 14的輕鏈可變區的抗體(例如，18R5或18R8 IgG抗體)的表位相同或重疊。在某些實施方式中，FZD結合藥劑或抗體與下述表位結合所述表位與具有包含SEQ ID NO: 11的重鏈和包含SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15的輕鏈的抗體的表位相同或重疊。在某些實施方式中，FZD結合藥劑與下述表位結合所述表位與具有包含SEQ ID NO:85的重鏈可變區和包含SEQ ID NO:86的輕鏈可變區的抗體(例如,44R24 IgG抗體)的表位相同或重疊。在某些實施方式中，在競爭性結合測定中FZD結合藥劑與抗體競爭對人類卷曲受體的特異性結合，其中所述抗體具有包含SEQ ID NO: 10的重鏈可變區和包含SEQID NO: 12或SEQ ID NO: 14的輕鏈可變區。在某些實施方式中，FZD結合藥劑與具有包含SEQ ID NO: 11的重鏈和包含SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15的輕鏈的抗體競爭，以獲得與人類卷曲受體的特異性結合。在某些實施方式中，與所述藥劑競爭對人類卷曲受體的特異性結合的抗體是18R5 IgG抗體。在某些替代性實施方式中，所述抗體是18R8 IgG抗體。在某些實施方式中，在競爭性結合測定中FZD結合藥劑與抗體競爭對人類卷曲受體的特異性結合，其中所述抗體具有包含SEQ ID NO:85的重鏈可變區和包含SEQID NO:86的輕鏈可變區。在某些實施方式中，所述FZD結合藥劑直接競爭Wnt對FZD的結合或直接抑制Wnt對FZD的結合。
在某些實施方式中，所述FZD結合藥劑或抗體與被本發明人命名為生物學結合部位(BBS)的人類卷曲受體的至少一部分區域結合(圖9，實施例6)。在人類FZD8(SEQIDNO :54)中，所述 BBS 由下述(a)、(b)和(c)組成(a)由氨基酸 72 (F)、74 至 75 (PL)、78 (I)、92 (Y)、121 至 122 (LM)和 129 至 132 (WPDR(SEQ ID NO:70))構成的構象表位(圖 8 和圖 9中所示的BBS的“裂縫”)；(b)由序列GLEVHQ(SEQ ID NO: 25)組成的FZD8的區域(圖8和圖9中所示的BBS的“上邊緣”)；和(c)由序列YGFA(SEQ ID NO:74)組成的FZD8的區域(圖8和圖9中所示的BBS的“下邊緣”)。位于FZDl至FZD7、FZD9和FZDlO上的BBS的相應殘基在下表I和圖8中示出。在某些實施方式中，阻斷配體(例如Wnt)與FZD結合的藥劑抑制該配體與BBS的結合。應了解的是，在某些實施方式中，與BBS的至少一部分結合的藥劑還結合人類卷曲受體上的一種或多種其他區域(即，在BBS之外)。換言之，在某些實 施方式中，FZD結合藥劑或抗體所結合的表位是位于FZD受體細胞外結構域中與BBS重疊但并不完全包含于BBS中的區域。在某些替代性實施方式中，FZD結合藥劑或抗體所結合的表位完全包含于BBS中(即，BBS包含FZD結合抗體或其他藥劑所結合的整個表位)。表I :FZD受體的生物學結合部位(BBS)。
權利要求
1.一種分離的多肽，所述多肽包含人類卷曲受體的Fri結構域，其中，所述Fri結構域與野生型Fri結構域相比具有在生物學結合部位(BBS)中的一個或多個取代。
2.如權利要求I所述的多肽，所述多肽與包含所述卷曲受體的所述野生型Fri結構域的多肽相比具有減弱的與fct的結合親和力。
3.如權利要求2所述的多肽，其中，所述Wnt是Wnt3A。
4.如前述權利要求中任一項所述的多肽，其中，所述野生型Fri結構域包括具有選自由SEQ ID NO. 117至SEQ ID NO. 126組成的組的序列的多肽。
5.如前述權利要求中任一項所述的多肽，其中，所述野生型Fri結構域包括具有選自由 SEQ ID NO. 28、32、36、40、44、48、52、56、60 和 64 組成的組的序列的多肽。
6.如前述權利要求中任一項所述的多肽，所述多肽包含在選自表16的裂縫殘基的部位處的取代。
7.如前述權利要求中任一項所述的多肽，其中，所述一個或多個取代包括在選自表17的部位處的一個或多個取代。
8.如前述權利要求中任一項所述的多肽，其中，所述一個或多個取代包括疏水性弱于在所述野生型FZD Fri結構域序列的相應位置處的氨基酸的疏水性的氨基酸殘基。
9.如前述權利要求中任一項所述的多肽，所述多肽還包括Fe區域。
10.如前述權利要求中任一項所述的多肽，其中，所述人類FZD受體是FZD4、FZD5或FZD8。
11.如前述權利要求中任一項所述的多肽，其中，所述人類FZD受體是FZD8。
12.如權利要求11所述的多肽，其中，所述一個或多個取代包括在F72、L75、178或L121處的取代。
13.如權利要求12所述的多肽，其中，所述一個或多個取代包括在L75處的取代。
14.如權利要求12或13所述的多肽，其中，所述一個或多個取代包括F72Y、L75S、I78S或 L121S。
15.一種篩選具有作為fct信號傳導抑制劑的可能活性的化合物的方法，所述方法包括 確定化合物對于第一多肽的結合親和力，所述第一多肽是前述權利要求中任一項所述的多肽； 確定所述化合物對于包含所述野生型Fri結構域的第二多肽的結合親和力； 將所述化合物對于所述第一多肽的結合親和力與所述化合物對于所述第二多肽的結合親和力進行比較； 其中，如果所述化合物對于所述第二多肽的親和力大于其對于所述第一多肽的親和力，則將該化合物鑒定為fct信號傳導的可能抑制劑。
16.一種分離的多肽，所述多肽包含下述序列該序列與選自由SEQ ID NO:98至SEQID NO: 111和SEQ ID NO: 113至SEQ ID NO: 116組成的組的序列具有至少為約80%的同一性。
17.一種分離的多肽，所述多肽包含選自由SEQ ID NO:98至SEQ ID NO:112組成的組的序列。
18.如權利要求17所述的多肽，所述多肽包含SEQID NO: 112。
19.如權利要求18所述的多肽，所述多肽包含SEQID NO: 108。
20.如權利要求17所述的多肽，所述多肽基本由選自由SEQID NO:98至SEQ IDNO: 112組成的組的環狀肽組成。
21.如權利要求20所述的多肽，所述多肽基本由環狀肽SEQID NO: 108組成。
22.—種分離的多肽，所述多肽包含選自由SEQ ID NO: 113至SEQ ID NO: 116組成的組的序列。
23.如權利要求22所述的多肽，所述多肽基本由選自由SEQID N0:113至SEQIDNO: 116組成的組的序列組成。
24.如權利要求16至19以及22中任一項所述的多肽，所述多肽長度小于約100個氨基酸。
25.如權利要求24所述的多肽，所述多肽長度為約5個氨基酸至約20個氨基酸。
26.如權利要求16至25所述的多肽，所述多肽是經修飾的多肽。
27.如權利要求26所述的多肽，所述多肽帶有標記。
28.如權利要求16至27中任一項所述的多肽，所述多肽是Wnt信號傳導抑制劑。
29.—種包含權利要求16至28中任一項所述多肽的藥劑。
30.一種篩選具有作為Wnt信號傳導抑制劑的可能活性的化合物的方法，所述方法包括 確定所述化合物是能否夠與權利要求16至28中任一項所述多肽競爭對人類FZD受體的結合，其中，所述化合物與所述多肽競爭結合的能力表明所述化合物具有作為fct信號傳導抑制劑的可能活性。
31.一種篩選具有作為fct信號傳導抑制劑的可能活性的化合物的方法，所述方法包括 確定所述化合物是否能夠將權利要求16至28中任一項所述的多肽從所述人類FZD受體的BBS中置換下來，其中所述化合物置換所述多肽的能力表明所述化合物具有作為Wnt信號傳導抑制劑的可能活性。
32.如權利要求30或31所述的方法，其中，所述人類FZD受體是FZD8。
33.如權利要求30至32中任一項所述的方法，其中，所述人類FZD受體是可溶性形式。
34.一種通過權利要求15和30至33中任一項所述的方法鑒定的藥劑。
35.一種與人類FZD受體結合的分離的藥劑，其中，所述藥劑對于權利要求I至14中任一項所述的多肽結合親和性與其對于包含人類FZD受體的野生型Fri結構域的多肽的結合親和力下降。
36.一種分離的藥劑，所述藥劑與權利要求16至28中任一項所述的多肽競爭對人類FZD受體結合。
37.如權利要求35至36中任一項所述的藥劑，其中，所述人類FZD受體是FZD8。
38.如權利要求34至37中任一項所述的藥劑，所述藥劑包括多肽。
39.如權利要求38所述的藥劑，所述藥劑包括抗體。
40.如權利要求38所述的藥劑，所述藥劑不是抗體。
41.如權利要求38所述的藥劑，其中，所述多肽長度小于約100個氨基酸。
42.如權利要求41所述的藥劑，其中，所述多肽長度為約5個氨基酸至20個氨基酸。
43.如權利要求38至42中任一項所述的藥劑，其中，所述多肽是經修飾的多肽。
44.如權利要求34至37中任一項所述的藥劑，其中，所述藥劑包括脂質。
45.如權利要求34至44中任一項所述的藥劑，所述藥劑具有小于約2000道爾頓的分子量。
46.如權利要求34至45中任一項所述的藥劑，所述藥劑抑制Wnt與人類FZD受體的結入口 ο
47.如權利要求46所述的藥劑，其中，所述Wnt是Wnt3a。
48.如權利要求34至47中任一項所述的藥劑，所述藥劑抑制經典的Wnt信號傳導。
49.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含權利要求16至29和34至48中任一項所述的多肽或藥劑。
50.—種抑制細胞中Wnt信號傳導的方法,所述方法包括用有效量的權利要求16至29和34至48中任一項所述的多肽或藥劑接觸所述細胞。
51.如權利要求50所述的方法，其中，所述Wnt信號傳導是經典的Wnt信號傳導。
52.—種誘導細胞分化的方法，所述方法包括用有效量的權利要求16至29和34至48中任一項所述的多肽或藥劑接觸所述細胞。
53.如權利要求50至52中任一項所述的方法，所述細胞是腫瘤細胞。
54.—種抑制腫瘤生長的方法，所述方法包括用有效量的權利要求16至29和34至48中任一項所述的多肽或藥劑接觸所述腫瘤。
55.一種治療與Wnt信號傳導的活化有關的疾病的方法，所述方法包括對受試者施用有效量的權利要求16至29和34至48任一項所述的多肽或藥劑。
56.如權利要求55所述的方法，其中，所述疾病是癌癥。
57.如權利要求55所述的方法，其中，所述疾病是多囊腎病。
58.一種治療多囊腎病的方法，所述方法包括對受試者施用有效量的與人類FZD受體的BBS結合的藥劑。
59.如權利要求58所述的方法，其中，所述藥劑是18R5。
60.一種降低腫瘤的致瘤性的方法，所述方法包括用有效量的如權利要求16至29和34至48中任一項所述的多肽或藥劑接觸所述腫瘤。
全文摘要
本發明提供了與人類卷曲受體結合的新型抗癌藥劑，所述藥劑包括但不限于抗體和其他多肽。還鑒定了人類卷曲受體中的適合作為抗癌藥劑靶標的新型表位。另外還提供了使用所述藥劑或抗體的方法，例如使用所述藥劑或抗體來抑制Wnt信號傳導和/或抑制腫瘤生長的方法。還提供了篩選方法。
文檔編號C07K14/00GK102971337SQ201180024546
公開日2013年3月13日 申請日期2011年4月1日 優先權日2010年4月1日
發明者奧斯丁·L·格尼 申請人:昂考梅德藥品有限公司