用于預(yù)防或治療炎性腸病尤其是克羅恩病的拮抗劑的制作方法

專利名稱：用于預(yù)防或治療炎性腸病尤其是克羅恩病的拮抗劑的制作方法
用于預(yù)防或治療炎性腸病尤其是克羅恩病的拮抗劑
本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療炎性腸病尤其是克羅恩病的肽或多肽拮抗劑。本發(fā)明還涉及用于診斷這種疾病的方法。
炎性腸病(Inflammatorybowel disease, IBD)主要由潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn' s disease,⑶)這兩種疾病組成,在西方國家這兩者結(jié)合起來的患病率為約每100，000人150-200例。IBD中觀察到的異常炎性反應(yīng)需要宿主遺傳因子與腸微生物叢(miciObiota)之間的相互作用[1，2]。多條證據(jù)支持這樣的看法IBD由對腸共生生物的過度免疫應(yīng)答引起[1，3]。但是，該疾病可由導(dǎo)致全身或局部微生態(tài)失衡的微生物群落(microflora)組成的問題引起。在⑶患者中觀察到粘膜相關(guān)大腸桿菌(E.coli)的數(shù)量增加[4，5，6，7，8，9]。這些粘膜相關(guān)大腸桿菌(稱為粘附-侵襲性大腸桿菌，Adherent-1nvasive Escherichiacoli, AIEC)能夠粘附到并且侵襲腸上皮細胞(IEC) [6，10]，并且能夠定殖在⑶患者的回腸粘膜[11]。在患回腸⑶的遺傳傾向性患者中，AIEC能夠通過誘導(dǎo)作為這些細菌之受體的CEACAM6(癌胚抗原相關(guān)細胞粘附分子6， carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6)的表達增力口來促進其自身的定殖[12]。
W02006/040481描述了患有克 羅恩病患者回腸水平的CEACAM6 (癌胚抗原相關(guān)細胞粘附分子6)受體的異常過表達，以及這種受體與大腸桿菌AIEC菌株之間的顯著親和力。 其還描述了基于評估待測試對象的樣品中這種受體之表達來診斷克羅恩病的體外方法，以及甘露糖苷或者抗CEACAM6抗體或肽作為預(yù)防治療克羅恩病的藥物的用途。
在AIEC菌株攜帶的毒力因子中，外膜囊泡(outer membranevesicles, 0MV)通過將細菌效應(yīng)因子遞送至宿主細胞而在AIEC參照菌株LF82的侵襲能力中發(fā)揮作用[13]。通過其與真核細胞的相互作用，0MV(50-200nm的脂蛋白體)可以將囊泡組分和毒力因子遞送至宿主細胞或宿主細胞內(nèi)[14，15]。OMV表面膜上的主要蛋白質(zhì)之一是OmpA蛋白，其為在粘附、侵襲和細胞內(nèi)細菌持久性中具有多種作用的多面(multifaceted)蛋白質(zhì)[16，17，18]。 在其生物學(xué)作用中，其與腦膜炎相關(guān)大腸桿菌通過與內(nèi)皮細胞糖蛋白EcGp96的相互作用來侵襲腦微血管內(nèi)皮細胞(BMEC)的能力有關(guān)[19，20]。IEC表達EcGp96糖蛋白的同源物 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)定位的應(yīng)激應(yīng)答伴侶蛋白Gp96 [21]。有趣的是，在編碼轉(zhuǎn)錄因子XBPl (ER應(yīng)激應(yīng)答的關(guān)鍵組分)的XBPl基因內(nèi)發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性之后，最近有報道指出ER應(yīng)激在UC 和⑶患者中都發(fā)揮關(guān)鍵作用[22，23]。
W02009/113074涉及組成型表達且通常存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的熱休克或應(yīng)激蛋白 Gp96。Gp96是被大量研究的應(yīng)激蛋白。TLR是有助于先天免疫并調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫的重要受體家族。TLR表達或功能的缺陷可導(dǎo)致對多種病原體感染的易感性增加。相反，過度或不適當?shù)腡LR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與病理過程(如敗血癥中LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素休克、某些自身免疫和炎性病癥以及和癌癥)有關(guān)。因此，調(diào)節(jié)TLR表達和功能的機制對于調(diào)整對病原體的免疫和病理性免疫反應(yīng)都至關(guān)重要。最近的證據(jù)證明Gp96是TLR的獨有且專一的主伴侶蛋白。 其對通過TLR1-9的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)必不可少[30]。根據(jù)這些和現(xiàn)有技術(shù)中Gp96或TLR4的強制表達可參與誘導(dǎo)自身免疫疾病的發(fā)現(xiàn)，推測Gp96活性的抑制可被用作治療目標以減輕多種疾病狀況中的TLR功能失常。在TLR功能失?？梢鸬募膊≈?，W02009/113074描述了變態(tài)反應(yīng)、動脈粥樣硬化、敗血癥中的心臟功能失調(diào)、充血性心力衰竭、缺血性損傷、急性異體移植排斥、感染相關(guān)的早產(chǎn)、癌癥、敗血癥期間對侵襲病原體的全身應(yīng)答、炎性病癥等。 W02009/113074提出過去的研究策略集中于開發(fā)能夠抑制先天免疫應(yīng)答以潛在地治療大量免疫調(diào)節(jié)疾病的TLR拮抗劑，并且集中于靶向CD91(Gp96的受體)。而W02009/113074提出，拮抗Gp96可以是治療這些疾病狀態(tài)的有效途徑。該文件因而提出了旨在使用Gp96拮抗劑來調(diào)節(jié)TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的非特異性治療途徑。其以完全非特異性的理論性方式提出拮抗 Gp96對以下多種極為不同的病癥、失調(diào)和疾病有治療價值敗血癥、膿毒性休克、內(nèi)毒素休克、內(nèi)毒素血癥(endotoxinaemia)、全身炎性應(yīng)答綜合癥(SIRS)、自身免疫疾病(在大量自身免疫疾病中提到IBD和CD)、涉及呼吸道炎癥的疾病、自身炎性疾病、缺血再灌注損傷相關(guān)疾病、心血管疾病、重金屬引起的疾病、腎病、傳染病、癌癥、炎癥誘導(dǎo)的癌癥、早產(chǎn)、手術(shù)并發(fā)癥、急性異體移植排斥。Gp96抑制劑可以是源自Gp96的肽、抗體和融合蛋白。
仍然需要與炎性腸病尤其是克羅恩病更密切相關(guān)且對其有特異性的治療和診斷途徑。
發(fā)明概述
本發(fā)明人的工作對組織陣列進行免疫組織化學(xué)表明，Gp96在50%的⑶患者的回腸上皮細胞頂端質(zhì)膜處強表達，并且在對照中不表達。在抗Gp96抗體的存在下或者在用 Gp96siRNA轉(zhuǎn)染腸-407細胞之后，侵襲實驗表明Gp96通過識別外膜蛋白OmpA使得OMV與腸上皮細胞融合，對促進AIEC參照菌株LF82的侵襲必不可少。Gp96在⑶患者回腸上皮細胞的頂端表面上過表達，并且作為OMV的宿主細胞受體來促進 AIEC侵襲。根據(jù)本文所示的結(jié)果，認為AIEC細菌可利用⑶患者中異常表達的Gp96來侵襲回腸粘膜。[31]中也公開了這些結(jié)果，其內(nèi)容通過整體引用并入本文。
因此，本發(fā)明作者致力于鑒定用于預(yù)防或治療炎性腸病的化合物，優(yōu)選肽或多肽化合物。本發(fā)明的核心是，本發(fā)明人證明了在炎性腸病尤其是克羅恩病患者中回腸水平的 Gp96受體的這種異常過表達；該受體與大腸桿菌AIEC菌株的外蛋白膜OmpA之間的顯著親和力；以及使用可與Gp96或OmpA結(jié)合的化合物(優(yōu)選肽或多肽化合物)來阻斷或減少這種相互作用的意義。
基于抑制腸上皮細胞與大腸桿菌AIEC之間的特異性相互作用，并且基于抑制這種微生物和/或可同時存在的其它病原體對這些細胞的可能侵襲，其為預(yù)防和/或治療這些疾病的新治療方法開通了道路。這種新治療方法可有益于在腸上皮細胞(尤其是回腸水平，特別在回腸上皮細胞的頂端質(zhì)膜處)具有Gp96表達的患者，并且更特別有益于存在大腸桿菌AIEC或者也表達能夠識別Gp96之外膜蛋白A的其它病原菌的患者。
因此，本發(fā)明的一個目的是Gp96受體與大腸桿菌AIEC菌株之間相互作用的拮抗劑，其用于預(yù)防或治療炎性腸病，例如潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)。
特別地，本發(fā)明的一個目的是用作Gp96受體與AIEC菌株(尤其是其外蛋白膜 OmpA)之間相互作用的抑制劑的這種拮抗劑。更特別地，這種拮抗劑被用作Gp96受體與大腸桿菌AIEC菌株(尤其是其外蛋白膜OmpA)之間相互作用的抑制劑，來預(yù)防或治療炎性腸病例如潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)。
本發(fā)明還有一個目的是用于抑制大腸桿菌AIEC菌株侵襲腸上皮細胞的這種拮抗劑。這是為了預(yù)防或治療炎性腸病，例如潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)。
OmpA與Gp96受體的結(jié)合還可有助于其它病原體侵襲腸上皮細胞。因此，本發(fā)明的另一個目的是用于抑制大腸桿菌AIEC菌株和/或其它病原體(例如胃腸道腔內(nèi)存在的病原菌)侵襲腸上皮細胞的這種拮抗劑。
本發(fā)明的另一個目的是這種拮抗劑和針對CEACAM6與大腸桿菌AIEC菌株之間相互作用的拮抗劑的組合用于預(yù)防和/或治療炎性腸病，例如潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病 (CD)。
本發(fā)明的另一個目的是用于診斷炎性腸病(例如潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病 (CD))，或者確定人患炎性腸病(例如潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD))的傾向的體外方法，其中測定待測試對象的生物樣品中Gp96表達水平是否高于對照樣品中的表達水平， 這指示炎性腸病或被測試對象患炎性腸病的傾向。
本發(fā)明的另一個目的是篩選用于預(yù)防或治療炎性腸病(例如潰瘍性結(jié)腸炎(UC) 和克羅恩病(CD))的候選物質(zhì)的體外方法，其包括
(i)在待測試物質(zhì)的存在下，使可溶形式或表達在細胞表面的Gp96受體與至少一種大腸桿菌AIEC菌株相接觸；
(ii)測定所述物質(zhì)特異性抑制Gp96受體與所述菌株之間相互作用的能力，并且選擇和/或鑒定所述物質(zhì)。
發(fā)明詳述
本發(fā)明的第一目的是Gp96受體與大腸桿菌AIEC菌株之間相互作用的拮抗劑，其用于預(yù)防或治療炎性腸病，更特別地用于預(yù)防或治療克羅恩病。
根據(jù)第一實施方案，所述拮抗劑為肽或多肽拮抗劑，其特異性阻斷Gp96受體與大腸桿菌AIEC菌株之間的相互作用或?qū)⑵浣档椭辽?0%。
在一個實施方案中，所述肽或多肽拮抗劑是特異性阻斷或降低Gp96受體與大腸桿菌AIEC菌株外膜囊泡(OMV)之間相互作用的拮抗劑。OMV是存在于細菌表面的OMV和/ 或從細菌脫離的游離0MV。
根據(jù)另一實施方案，所述肽或多肽拮抗劑特異性地阻斷或降低Gp96受體與大腸桿菌AIEC菌株外蛋白膜OmpA之間的相互作用。OmpA存在于細菌表面和/或是從細菌脫離的游離OMV。
根據(jù)一個實施方案,所述肽或多肽拮抗劑為抗Gp96抗體。
根據(jù)另一實施方案，所述肽或多肽拮抗劑為抗OmpA抗體。
根據(jù)另一實施方案，所述肽或多肽拮抗劑包含抗OmpA抗體和抗Gp96抗體二者。
“抗體”廣義地指可與Gp96或OmpA結(jié)合的任何抗體，其中這種結(jié)合使得與Gp96與 OmpA之間的結(jié)合變得不可能。在一個實施方案中，所述抗體對OmpA的Gp96特異性結(jié)合氨基酸序列或Gp96的OmpA特異性結(jié)合氨基酸序列具有特異性?！翱贵w”包括單克隆抗體、多克隆抗體、單鏈抗體和表現(xiàn)出期望生物活性的這些抗體的抗原結(jié)合片段。單克隆抗體可以是鼠的、嵌合的或人源化的。術(shù)語“抗體”指任何全長抗體或抗體的功能性片段(由或不由遺傳工程獲得)，它包含至少一個抗原結(jié)合位點或者由其組成，使得所述抗體能與抗原化合物的至少一個抗原決定簇結(jié)合。作為抗體片段的例子，可提及的是片段Fab、Fab’、F(ab’)2 和單鏈可變片段(scFv鏈)。用于本發(fā)明的抗體是對抗原特異的抗體。它們優(yōu)選為單克隆抗體或單特異性多克隆抗體，即它們只特異性識別一種表位。用于本發(fā)明上下文的單克隆抗體或單特異性多克隆血清或者通過篩選基因組文庫得到的抗體的生產(chǎn)是常規(guī)技術(shù)。
尤其地，可以通過以下過程得到抗Gp96的多克隆抗體根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員本身已知方法，借助可溶性Gp96受體或其抗原片段免疫動物(例如兔、小鼠等)，收集抗血清然后在例如包含所述受體的免疫吸附劑上消耗得到的抗血清。
已開發(fā)并銷售幾種抗Gp96單克隆或多克隆抗體
-抗Grp94H_212，Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA ；
-大鼠抗Grp94 單克隆抗體(9G10)，產(chǎn)品號 SPA-850，StrCSSgCIlK, Assay Designs，Ann Arbor, Ml 48108USA ；
-大鼠抗Grp94單克隆抗體(9G10)Dylight488綴合物；產(chǎn)品號SPA-850-488， StrCSSgCIl K；, Assay Designs，Ann Arbor, Ml 48108USA ；
-大鼠抗Grp94 單克隆抗體(9G10)產(chǎn)品號 SPA-850, StlTSSgeil , Assay Designs，Ann Arbor, Ml 48108USA
-兔抗Gp96(N 端)單克隆抗體，Clone ZMD. 287，Invitrogen, Carlsbad， California，USA
天然Gp96氨基酸序列如SEQ ID NO :1中所示，并且可全部或部分用于設(shè)計抗體。 也可如下所述使用變體序列。
如圖5所示，LF82和K_12的氨基酸序列相差5個氨基酸。兩者中的任一種序列都可用于設(shè)計所述抗體?；蛘?，使用包含至少一個以下氨基酸變化的完整LF82氨基酸序列或者片段Valll5、Phel32、Aspl33、Thr223、Ala269。在一些具體實施方案中，氨基酸序列包含Aspl33和Thr223，或者Phel32、Aspl33和Thr223。也可如下所述使用變體序列。
通常，根據(jù)IOihler和Milstein(1975)描述的淋巴細胞融合和雜交瘤培養(yǎng)的常規(guī)方法，可以得到另一些單克隆抗體。已知用于制備單克隆抗體的其他方法(Harlow等編著， 1988 “Antibodies :a laboratorymanual”)。可以通過免疫哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、 兔或甚至人等)然后使用淋巴細胞融合技術(shù)產(chǎn)生雜交瘤來制備單克隆抗體(Kiihlcr和 Milstein,1975)。
存在這種常規(guī)技術(shù)的替代技術(shù)。例如，可通過表達克隆自雜交瘤的核酸來生產(chǎn)單克隆抗體。也可通過噬菌體展示技術(shù)通過將抗體的cDNA引入載體來生產(chǎn)抗體，所述載體通常為在噬菌體表面顯示基因文庫V的絲狀噬菌體(例如，大腸桿菌的fUSE5，Scott，1990)。 在Marks等(1991)中描述了構(gòu)建這些抗體文庫的方案。
在一個實施方案中，所述拮抗劑是Gp96或OmpA多肽。
天然Gp96氨基酸序列如SEQ ID NO 1中所述。
大腸桿菌AIEC LF82的天然OmpA氨基酸序列如SEQ ID NO 2中所述。
大腸桿菌K-12的天然OmpA氨基酸序列如SEQ ID NO 3中所述。
“Gp96或OmpA多肽”包括Gp96或OmpA天然序列多肽、Gp96或OmpA多肽變體以及嵌合Gp96或OmpA多肽。
“Gp96或OmpA天然序列多肽”包括與發(fā)現(xiàn)或來源于人的相應(yīng)Gp96或OmpA多肽的氨基酸序列相同的多肽。Gp96或OmpA天然序列多肽可以是天然的(即分離自人)、重組的 (即通過重組方法產(chǎn)生)或合成的(即通過合成產(chǎn)生)。
Gp96或OmpA天然序列多肽涵蓋發(fā)現(xiàn)自人類的相應(yīng)Gp96或OmpA多肽的全長氨基酸序列，或者天然截短或分泌形式。其還涵蓋了能夠結(jié)合其靶標OmpA或Gp96的全長氨基酸序列的片段。
“Gp96或OmpA多肽變體”意指氨基酸序列不同于相應(yīng)的Gp96或OmpA天然序列多肽且保留全長序列與其靶標特異性結(jié)合之功能的多肽。這種全長Gp96或OmpA多肽變體或片段與相應(yīng)的全長或部分(片段)Gp96或OmpA天然序列多肽可以有至少約80、81、82、83、 84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或 99% 的氨基酸序列同一性。
“嵌合Gp96或OmpA多肽”是與異源氨基酸序列融合的Gp96或OmpA多肽。本發(fā)明涵蓋了包含Gp96或OmpA多肽的一部分(例如，特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域)和補充氨基酸的嵌合 Gp96或OmpA多肽。
在一個實施方案中，嵌合Gp96或OmpA多肽是包含Gp96或OmpA多肽和免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的融合蛋白?！懊庖咔虻鞍捉Y(jié)構(gòu)域”意指Fe結(jié)構(gòu)域、重鏈或輕鏈。在一個優(yōu)選實施方案中，免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域為Fe序列。尤其可以是來自人IgGl的Fe。
根據(jù)另一實施方案，所述肽或多肽拮抗劑是能夠與大腸桿菌AIEC菌株的OmpA結(jié)合的天然或變體Gp96片段，所述結(jié)合阻斷或降低大腸桿菌AIEC菌株與腸上皮細胞表面 Gp96受體之間的相互作用。
根據(jù)另一實施方案，所述肽或多肽拮抗劑是能夠與Gp96結(jié)合的大腸桿菌AIEC菌株天然或變體OmpA的片段，所述結(jié)合阻斷或降低大腸桿菌AIEC菌株與腸上皮細胞表面 Gp96受體之間的相互作用。
“片段”意指本發(fā)明天然蛋白質(zhì)(Gp96或OmpA)或其變體之一的至少5個，優(yōu)選至少8個，更特別地至少10、15或20個連續(xù)氨基酸序列。
如圖5中所示，LF82與K-12的氨基酸序列相差5個氨基酸。兩者中的任一種序列可用于設(shè)計本發(fā)明的多肽或 肽拮抗劑，包括抗體。或者，使用包含至少一個以下氨基酸變化的完整LF82氨基酸序列或者片段Valll5、Phel32、Aspl33、Thr223、Ala269。在一些具體實施方案中，所述氨基酸序列包含Aspl33和Thr223，或者Phel32、Aspl33和Thr223。
根據(jù)另一實施方案，所述拮抗劑是使gp96基因沉默的siRNA。
小干擾RNA或siRNA是可具有10或50個核苷酸的長度且降低靶基因表達的雙鏈 RNA(dsRNA)。第一鏈的一部分與靶基因互補，即其具有足夠的互補性以與靶基因雜交，例如與靶基因或其部分有至少80%的同一性。
本發(fā)明的肽或多肽拮抗劑可以被整合入藥物組合物中，優(yōu)選用于經(jīng)口施用。
例如，這些組合物可以口服施用，例如以立即或控制釋放的片劑、膠囊或顆粒劑的形式。
用于經(jīng)口施用的固體組合物通過以下過程制備向肽或多肽拮抗劑中添加填充劑，適當時添加粘合劑、崩解劑、潤滑劑、著色劑或矯味劑；然后使混合物形成片劑、包衣片劑、顆粒劑、粉劑或膠囊。
填充劑的實例包括乳糖、玉米淀粉、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、結(jié)晶纖維素和二氧化硅，粘合劑的實例包括聚(乙烯醇)、聚(乙烯醚)、乙基纖維素、甲基纖維素、阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、蟲膠、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、檸檬酸鈣、糊精和果膠。
潤滑劑的實例包括硬脂酸鎂、滑石、聚乙二醇、硅石和硬化的植物油、著色劑可以是批準用于藥物的著色劑的任一種。
矯味劑的實例包括可可粉、草形式的薄荷、芳香粉末、油形式的薄荷、冰片和肉桂粉。應(yīng)理解，片劑或顆粒劑可合適地包被糖、明膠等。
在一個具體實施方案中，藥物組合物還包含針對CEACAM6受體與大腸桿菌AIEC菌株之間相互作用的拮抗劑。
該第二拮抗劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員可參照的W02006/0404481中所述的任何一種。如這個文件所公開的，這種拮抗劑可以是這種相互作用的任何肽或多肽拮抗劑。
在一個實施方案中，CEACAM66(在W02006/0404481命名為Cd66c)受體與大腸桿菌AIEC菌株之間相互作用的拮抗劑為抗CEACAM6抗體。
在另一實施方案中，所述拮抗劑是可以與AIEC菌株特異性相互作用并阻礙與 CEACAM6結(jié)合的CEACAM6多肽。在W02006/0404481和W00I/013937中已經(jīng)描述了這種多肽。
關(guān)于Gp96和OmpA所給出的抗體和多肽的定義也適用于可用作拮抗劑的CEACAM6 抗體和多肽。特別地，這些可以是多克隆或單克隆抗體，鼠、嵌合或人源化抗體，天然多肽或衍生物，全長或片段，嵌合多肽(例如融合多肽)等。
在另一實施方案中，CEACAM6/AIEC菌株相互作用的拮抗劑是甘露糖苷，例如D-甘露糖、甲基-D-甘露糖或者攜帶一個或更多個甘露糖單元的顆粒。因此，術(shù)語甘露糖苷定義為包括D-甘露糖和能夠通過水解釋放D-甘露糖的化合物(例如通過水解釋放D-甘露糖的多糖和寡糖(均多糖或雜多糖))，以及能夠與AIEC菌株的粘附素FimH相互作用的任何 D-甘露糖衍生物。攜帶一個或更多個甘露糖單元的顆?？梢岳缡嵌?性珠或顆?；蛘呋罨蛩兰毎?。
本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含Gp96與OmpA之間相互作用的拮抗劑和CEACAM6 受體與大腸桿菌AIEC菌株之間相互作用的拮抗劑，以及可藥用載體。
本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含Gp96與OmpA之間相互作用的拮抗劑和CEACAM6 受體與大腸桿菌AIEC菌株之間相互作用的拮抗劑，它們同時、單獨或分開施用。
因此，本發(fā)明可涉及包含第一組合物和第二組合物的藥盒，所述第一組合物包含 Gp96與OmpA之間相互作用的拮抗劑和可藥用載體，所述第二組合物包含CEACAM6受體與大腸桿菌AIEC菌株之間相互作用的拮抗劑和可藥用載體。
施用肽或多肽拮抗劑來預(yù)防或治療炎性腸病特別是克羅恩病的有效量和劑量取決于很多因素，例如取決于拮抗劑的性質(zhì)、患者的體形、疾病的階段、使用的具體藥物組合物以及主治醫(yī)生的觀察和結(jié)論。
例如,在經(jīng)口施用(例如片劑或膠囊)的情況下，合適劑量可以為約O. lmg/kg至約100mg/kg體重/天，優(yōu)選約O. 5mg/kg至約50mg/kg體重/天，更優(yōu)選約lmg/kg至約 10mg/kg體重/天,還優(yōu)選約2mg/至約5m g/kg體重/天的活性物質(zhì)。
為了闡明可如以上所述使用的口服途徑的日劑量范圍，如果認為代表性體重為IOkg至100kg,那么合適劑量為約1-1Omg至lOOO-lOOOOmg/天，優(yōu)選約5_50mg至 500-5000mg/ 天，還優(yōu)選約 10. 0-100. Omg 至 100. 0-1000. Omg/ 天，更優(yōu)選約 20. 0-200. Omg 至約50. 0-500. Omg/天的活性成分。
這些劑量范圍表示每天用于給定患者的活性成分的總量。每天的施用(施用一劑量)次數(shù)可有很大不同，特別是根據(jù)藥代動力學(xué)因素。
因此，本發(fā)明還涉及Gp96受體與大腸桿菌AIEC菌株之間相互作用的拮抗劑(優(yōu)選肽或多肽拮抗劑)在制備用于預(yù)防或治療炎性腸病或克羅恩病中的用途。尤其是將這種拮抗劑用作Gp96受體與大腸桿菌AIEC菌株(尤其是其外蛋白膜OmpA)之間相互作用的抑制劑。更特別地，為了預(yù)防或治療炎性腸病，例如潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(⑶)，將這種拮抗劑用作Gp96受體與大腸桿菌AIEC菌株(尤其是其外蛋白膜OmpA)之間相互作用的抑制劑。
因此，本發(fā)明還涉及抗Gp96抗體在制備用于預(yù)防或治療炎性腸病或克羅恩病的藥物中的用途。
因此，本發(fā)明還涉及抗OmpA抗體在制備用于預(yù)防或治療炎性腸病或克羅恩病的藥物中的用途。
與用途類似，本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療炎性腸病(例如潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD))的方法，其中向有此需要的患者施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的拮抗劑或藥物組合物。以上所示的各種特征也適用于本主題。因此，所述拮抗劑可以是本文公開的Gp96多肽、OmpA多肽、抗Gp96抗體、抗OmpA抗體、siRNA或其混合物。
基于抑制腸上皮細胞與大腸桿菌AIEC之間的特異性相互作用，并且基于抑制這種微生物和/或可同時存在的其它病原體對這些細胞的潛在侵襲，這種方法允許預(yù)防和/ 或治療這些疾病。該方法可應(yīng)用于在腸上皮細胞上(尤其是在回腸水平，特別地在回腸上皮細胞的頂端質(zhì)膜處)具有Gp96表達的患者；更特別地可應(yīng)用于存在大腸桿菌AIEC或者也表達能夠識別Gp96之外膜蛋白A的其它病原菌的患者。
該方法可包括向該患者施用包含CEACAM6受體與大腸桿菌AIEC菌株之間相互作用的拮抗劑的如上公開的組合物。
本發(fā)明的另一方面是用于診斷炎性腸病或者確定人患炎性腸病的傾向的體外方法，其中測定待測試對象的生物樣品中Gp96表達水平是否高于對照樣品中的表達水平，其指示炎性腸病或測試對象患炎性腸病的傾向。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述方法用于診斷克羅恩病。
在本發(fā)明的上下文中，“生物樣品”可以是回腸或結(jié)腸活檢樣品，分離自回腸或結(jié)腸活檢樣品的腸細胞制備物、血液、口腔上皮細胞或糞便。詞語“回腸或結(jié)腸活檢樣品”應(yīng)理解為意指回腸或結(jié)腸(或者回腸或結(jié)腸粘膜)之一部分的樣品，例如在手術(shù)切除期間或內(nèi)窺鏡檢查期間得到的。
“對象”或“患者”為哺乳動物，優(yōu)選人，不考慮性別、年齡和一般情況。也包括兒童。 測試對象可以無癥狀，或者可被認為有患炎性腸病的風(fēng)險。
術(shù)語“診斷”指確定或證實感染炎性腸病的感染，無論其患病階段為何。更特別地 “診斷”可以是早期診斷或復(fù)發(fā)診斷。
本發(fā)明的方法涉及定量測定Gp96受體表達的絕對水平，然后與對照對象中受體的表達水平(平行地測定或以其它方式已知)進行比較，或者直接測定與對照樣品相比待測試生物樣品中Gp96受體的相對表達水平(在這種情況下可以使用表達的半定量檢測)。 “對照”樣品是來自“健康”對象或未患克羅恩病的對象或者未患有任何炎性腸病(IBD)或結(jié)直腸癌的對象的樣品。根據(jù)情況，“對照”樣品可以是具有外傷或感染性來源的小腸炎性病變的對象。為了確定克羅恩病的進展，可有用的是通過在例如幾周之后第二次測試對象來測定對象中Gp96的表達水平，并控制藥物作用或疾病的進展。在這種情況下，將第二次測試的結(jié)果與第一次測試的結(jié)果以及通常也與在“健康”對象中得到的結(jié)果進行比較。因此，“對照”樣品指同一測試對象或“健康”對象。
Gp96受體的表達水平可以以多種方式進行測定。尤其是可以通過測定Gp96受體或通過測量其轉(zhuǎn)錄水平(即編碼該受體的mRNA的量)進行確定。以下描述了用于檢測和 /或定量Gp96受體表達的多種方法。
根據(jù)第一實施方案，通過測量Gp96受體糖蛋白的量(通常通過使生物樣品與能夠選擇性與樣品中存在的Gp96受體相互作用的結(jié)合伴侶相接觸)來測定Gp96受體的表達水平。結(jié)合伴侶通常是抗體，其可以是多克隆或單克隆的，優(yōu)選單克隆的。其也可以是Gp96 受體的肽片段?？贵w可通過與上述相同的方法得到。
因此，優(yōu)選通過免疫學(xué)測試來測量Gp96受體糖蛋白的量，所述測試包括使生物樣品與(任選標記的)特異性識別Gp96的抗Gp96抗體相接觸,然后示出所形成的抗體_Gp96 受體復(fù)合物。
根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，生物樣品是回腸或結(jié)腸活檢樣品，免疫學(xué)測試為免疫組織化學(xué)測試。
本發(fā)明還提供了用于診斷炎性疾病或者確定人患炎性腸病的傾向的體外方法，其中測定待測試對象的生物樣品中Gp96受體和CEACAM6 (Cd66c)(參照W02006/040481)的表達水平是否高于對照樣品中的表達水平，其指示炎性腸病或測試對象患炎性腸病的傾向。
此外，本發(fā)明提供了篩選用于預(yù)防或治療炎性腸病的候選物質(zhì)的體外方法，其包括
(i)在待測試物質(zhì)的存在或不存在的情況下，使可溶形式或表達在細胞表面的 Gp96受體與至少一種大腸桿菌AIEC菌株相接觸；
(ii)測定所述物質(zhì)特異性抑制Gp96受體與所述菌株之間相互作用的能力，并且選擇和/或鑒定所述物質(zhì)。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述方法用于篩選預(yù)防或治療克羅恩病的候選物質(zhì)。
候選物質(zhì)可以是任何類型，包括天然或合成化合物、或者化合物的混合物。所述物質(zhì)可以是結(jié)構(gòu)確定的或者結(jié)構(gòu)·未知的，例如以生物提取物的形式。
為了測定候選物質(zhì)抑制大腸桿菌AIEC菌株與Gp96受體之間結(jié)合的能力，可以在表達Gp96受體的細胞培養(yǎng)物上進行標準競爭測試。例如，所述細胞可以是進行遺傳轉(zhuǎn)化以過表達所述受體的細胞，或者是分離自克羅恩病患者的回腸活檢樣品的腸細胞。它們可以是單層培養(yǎng)的腸上皮細胞(例如HT29、Caco-2、T84、腸-407)。在候選物質(zhì)是已確定化合物的情況下，它可以是標記的，例如用放射性或非放射性標志物(例如熒光素)。
然后，可以在濃度變化的所述候選物質(zhì)(例如10-10至10-5M)的存在下，對與 Gp96受體特異性結(jié)合的標志物進行定量?；蛘撸赏ㄟ^粘附測試監(jiān)測候選物質(zhì)與大腸桿菌 AIEC細菌對Gp96受體的競爭。
以下圖和實施例闡明本發(fā)明，而并不限制范圍。


圖1.⑶患者和對照的腸活檢樣品中的Gp96表達。在對照、⑶急性期或靜止期患者的結(jié)腸和回腸活檢樣品的TMA中，使用Spot Browser軟件進行Gp96免疫染色的定量，* 女 P < O. 01。
圖2. Caco-2細胞中的Gp96表達。A，使用RT-PCR，相對于未處理細胞(NT)，經(jīng) TNF- α或IFN- Y刺激24或48小時(h)之后，Caco-2細胞中Gp96mRNA水平的變化倍數(shù)。 測量gapdh mRNA水平作為對照。數(shù)據(jù)為三次單獨實驗的平均值土SEM。B_C，Western印跡分析，顯示經(jīng)TNF- α或IFN- Y刺激24或48小時之后⑶，或者用MOI為10或100的 AIEC LF82細菌感染3小時之后(C)，Caco-2細胞的Gp96表達水平。作為上樣對照，使用抗肌動蛋白多克隆抗體進行標記。
圖3. Gp96表達支持LF82侵襲。A，用抗Gp96抗體對腸-407上皮細胞進行預(yù)處理對LF82侵襲水平的影響。用針對Gp96的兔多克隆抗體(Gp96Ab)或者1: 200或1: 500 稀釋的兔多克隆抗體(同種型對照)對腸-407細胞進行預(yù)處理30分鐘，然后用LF82細菌感染。在感染3小時之后以及慶大霉素處理另一小時之后，測定侵襲。結(jié)果被表示為相對于菌株LF82對未處理細胞(NT)所得的細菌(看做100% )的胞內(nèi)細菌。每個值都是至少四個單獨實驗的平均值土SEM。與野生型菌株對未處理細胞相比* P < 0.05。B，使用抗 Gp96和抗β -肌動蛋白抗體對來自腸-407細胞的全蛋白提取物進行Western印跡分析。 腸-407細胞是未轉(zhuǎn)染的(NT)、用IOng阻斷Gp96的siRNA(Gp96siRNA)轉(zhuǎn)染的、或者用空載體(pSUPER)轉(zhuǎn)染的作為對照。C，gp96siRNA對野生型菌株LF82侵襲水平的作用。如A中所述對侵襲細菌進行定量。與野生型菌株對未處理細胞相比* * P < O. 01。
圖4. Gp96依賴性侵襲涉及AIEC OmpA15A, LF82-Λ ompA突變體、用克隆的LF82ompA 基因或克隆的K-12MG1655ompA基因或單獨的pBAD33載體轉(zhuǎn)化的LF82-AompA突變體對腸-407上皮細胞的侵襲能力。如圖3A中所述對侵襲細菌進行定量。與野生型菌株相比 * * P < O. 01。通過酵母凝集視檢確定I型菌毛的表達并且將滴度記錄為得到陽性凝集結(jié)果的最終稀釋度。生長在含L-阿拉伯糖的培養(yǎng)基中的LF82、用克隆的LF82ompA基因或克隆的K-12ompA基因或單獨的PBAD33載體轉(zhuǎn)化的LF82-AompA細菌的全細胞裂解物經(jīng) SDS-PAGE分離，并用考馬斯亮藍染色。標記OmpC/F和Omp A的位置。B，用OMV和抗Gp96抗體(Gp96Ab)對腸-407上皮細胞進行預(yù)處理對LF82-AompA侵襲水平的影響。用1: 500 稀釋的針對Gp96的兔多克隆抗體(Gp96Ab)對腸-407細胞進行預(yù)處理30分鐘，然后用來自WT或LF82- Δ ompA細菌的OMV進行預(yù)處理I小時，并且在洗滌之后，用細菌感染細胞。如圖3A中所述對侵襲細菌進行定量。
圖5. OmpA的氨基酸序列比對。胞外環(huán)氨基酸為黑體，AIEC LF820mpA(SEQ ID NO 2)與大腸桿菌K-12MG1655(SEQ ID NO :16)之間不同的氨基酸用下劃線和黑體表示。
實施例
材料和方法
A.患者和活檢標本
本研究包括的所有患者都在消化科(Archet II Hospital, University ofNice Sophia Antipolis, France)住院并且簽署了本研究的協(xié)議，Universityof Nice Sophia Antipolis的當?shù)貍惱砦瘑T會批準了本方案。從65名克羅恩病(⑶)患者(活躍⑶)的末端回腸和結(jié)腸的視檢發(fā)炎粘膜(macroscopically inflamed mucosa)以及從55名CD患者(疾病的靜止期)的末端回腸和結(jié)腸的視檢未發(fā)炎粘膜中得到腸活檢樣品。有67名男性和53名女性，平均年齡為40歲(范圍為19-60)，平均疾病持續(xù)時間為10年(范圍為2_23 年)?；颊叨际欠▏呒铀魅朔N。此外，從對照患者(由40名因大便習(xí)慣改變、腹痛、上消化道出血或癌癥監(jiān)督進行內(nèi)窺鏡檢查之后沒有顯著病變的個體組成)的回腸和結(jié)腸中取得活檢樣品。
B.組織微陣列(TM)構(gòu)建和免疫組織化學(xué)
從蘇木精和伊紅染色片選擇每個個體建造TMA的代表性腸活檢樣品。簡言之，從每個標本的粘膜上部得到一個組織芯(直徑為600 μ m)，凹部或腺體總是縱向切割。使用細鋼針將組織芯排列成新的石蠟塊。兩個最終的TMA由患者和對照回腸粘膜或結(jié)腸粘膜的 480、600 μ m直徑的組織芯組成。在如Hoffman等所述處理的系列4 μ m脫臘TMA片上進行免疫組織化學(xué)方法。在室溫下使用單克隆大鼠抗GP96 (9G10, SPA-850, Stressgen)處理45 分鐘。用PBS沖洗之后，將片用過氧物酶標記的抗大鼠Ig(DAK0 Envision System)孵育45 分鐘。為了測量組織學(xué)疾病活性，如Sandborn等[25]中所使用的，使用CD粘膜生物活檢標本中組織學(xué)異常情況的評分系統(tǒng)。如Hoffman等所述[24]，免疫染色之后，用圖像分析工作站(Spot Browser version 7 ；Alphelys)對切片進行分析。
C.細菌菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)條件
以下列出本研究使用的細菌菌株和質(zhì)粒。37°C下將細菌常規(guī)地在LB培養(yǎng)液中或LB上或者Mueller-Hinton瓊脂板上培養(yǎng)過夜。添加下述濃度的抗生素氨芐青霉素 (50 μ g/ml)、卡那霉素(50yg/ml)和氯霉素(25yg/ml)。使用 Datsenko 和 Wanner [26]所述并且由Chaveroche等[27]進行修改的方式用PCR產(chǎn)物產(chǎn)生LF82-Λ ompA等基因突變體 (表I)。對于反式回補測定，將包含AIEC LF82或大腸桿菌K-12MG1655菌株完整ompA基因的PCR產(chǎn)物克隆到pBAD33載體中(表I)。
菌株或質(zhì)粒
-LF82 :大腸桿菌分離自CD患者的回腸活檢樣品[6]
-LF82- Δ ompA :缺失ompA基因的LF82等基因突變體
-K-12MG1655 :非病原性大腸桿菌菌株(實驗室儲藏種)
-pKOBEG:攜帶λ噬菌體red Y β α操縱子的pBAD克隆載體，氯霉素r [27]
-PBAD33 :大腸桿菌克隆載體，氯霉素r [29]
-PPBI13 :具有菌株LF82的完整ompA基因的攜帶1.1kb HindII1-SaII片段的PBAD33
-PPBI14 :具有菌株MG1655的完整ompA基因的攜帶1.1kbHindII1-SaII片段的PBAD33
-pSUPER. neo :用于表達短干擾RNA的載體系統(tǒng)(Oligoengine)
-gp96siRNA :攜帶對gp96mRNA特異的寡核苷酸的pSUPER. neo
表1:用于PCR實驗的寡核苷酸
權(quán)利要求
1.針對Gp96受體與大腸桿菌(E.coli)AIEC菌株之間相互作用的拮抗劑，其用于預(yù)防或治療炎性腸病。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的拮抗劑，其用于特異性阻斷或降低Gp96受體與大腸桿菌AIEC菌株外膜囊泡(OMV)之間的相互作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的拮抗劑，其用于特異性阻斷或降低Gp96受體與大腸桿菌AIEC菌株的外蛋白膜OmpA之間的相互作用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的拮抗劑，其是抗Gp96抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的拮抗劑,其是抗OmpA抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的拮抗劑，其是Gp96多肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的拮抗劑，其是OmpA多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的拮抗劑，其是使gp96基因沉默的siRNA。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的拮抗劑，其用于預(yù)防或治療克羅恩病。
10.藥物組合物，其包含根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的拮抗劑和可藥用載體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其還包含針對CEACAM6受體與大腸桿菌AIEC菌株之間相互作用的拮抗劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其特征在于所述針對CEACAM6受體與大腸桿菌AIEC菌株之間相互作用的拮抗劑為抗CEACAM6抗體、CEACAM6多肽、或者甘露糖苷或攜帶一個或更多個甘露糖單元的顆粒。
13.用于診斷炎性腸病或者確定人患炎性腸病的傾向的體外方法，其中測定待測試對象的生物樣品中Gp96受體的表達水平是否高于對照樣品中的表達水平，其指示炎性腸病或所述測試對象患炎性腸病的傾向。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述生物樣品是回腸活檢樣品、結(jié)腸活檢樣品、血液、口腔上皮細胞或糞便。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法，其中所述Gp96受體的表達水平通過測量Gp96受體糖蛋白的量來測定。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述Gp96受體蛋白的量通過免疫學(xué)測試來測量，所述測試包括使所述生物樣品與任選標記的特異性識別Gp96的抗Gp96抗體相接觸，然后示出所形成的抗體_Gp96受體復(fù)合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述生物樣品為回腸或結(jié)腸活檢樣品，以及所述免疫學(xué)測試為免疫組織化學(xué)測試。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述Gp96受體的表達水平通過測量所述生物樣品中Gp96mRNA的量來測定。
19.篩選用于預(yù)防或治療炎性腸病的候選物質(zhì)的體外方法，其包括 (i)在待測試物質(zhì)的存在下，使可溶形式或表達在細胞表面的Gp96受體與至少一種大腸桿菌AIEC菌株相接觸； ( )測定所述物質(zhì)特異性抑制所述Gp96受體與所述菌株之間相互作用的能力，并且選擇和/或鑒定所述物質(zhì)。
全文摘要
Gp96受體與大腸桿菌(E.coli)AIEC菌株之間相互作用的拮抗劑，其用于預(yù)防或治療炎性腸病。所述拮抗劑特異地阻斷或降低Gp96受體與大腸桿菌AIEC菌株的外膜囊泡(outer membrane vesicle，OMV)(通常為外蛋白膜OmpA)之間的相互作用。本發(fā)明提供了包含這種拮抗劑的藥物組合物，所述拮抗劑可以是針對gp96或OmpA的抗體，或者gp96或OmpA多肽。它可以與CEACAM6受體與大腸桿菌AIEC菌株之間相互作用的拮抗劑(例如抗CEACAM6抗體、CEACAM6多肽或者甘露糖苷或具有甘露糖單元的顆粒)組合。本發(fā)明還涉及用于診斷炎性腸病或者確定人患炎性腸病的傾向的方法。
文檔編號C07K16/18GK103003299SQ201180024289
公開日2013年3月27日 申請日期2011年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月15日
發(fā)明者阿萊特·達爾弗耶-米肖, 保羅·霍夫曼, 納塔莉·羅利恩 申請人:奧佛涅-克萊蒙第一大學(xué)