呈pH依賴性抗原結合的抗體的制作方法

專利名稱：呈pH依賴性抗原結合的抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及抗體，例如全長抗體或其抗原結合部分，所述抗體呈PH依賴性結合，致使所述抗體在內涵體pH/生理性pH(例如pH 5. 5/pH7. 4或pH 6. 0/pH 7. 4)的Kd及/或koff比是2或2以上。
現有技術
單克隆抗體(mAb)已經成為多種疾病的重要治療選擇(Brekke and Sandlie, NatRev Drug Discov 2 :52-62, 2003;Maggon, Curr Med Chem 14 :1978-1987，2007)。目前市面上大部分mAb是IgG抗體。它們相對較長的半衰期是由FcRn結合所介導。經由液相胞飲作用發生細胞對IgG的攝取，接著，該IgG與內涵體區室內的酸性環境(pH 6. O)下的FcRn結合(Lobo et al. , J Pharm Sci 93 :2645-2668, 2004)。與 FcRn 結合的 IgG 被認為通過再循環至細胞表面而免于降解，該處的中性PH有助于I gG解離及釋放至循環中。相反地，一般認為未經結合的IgG被轉運至溶酶體,接著被降解(Lencer and Blumberg, Trends CellBiol 1515 5-9,2005)。最近，通過導入特定取代以優化IgG抗體的功能活性的各種技術已被使用以減少劑量及/或給藥頻率并改善療效及安全性(Presta, Curr. Opinion Immunol 20:460-470，2008)。通常，I gG抗體的優化可被分成影響抗體與FcRruFc y R及補體系統的結合的Fe恒定區的工程化及影響結合親和性的可變區的工程化。數個研究描述恒定區的工程化以增加與Fe Y -受體的結合，因此增進IgGl抗體的效應物功能(Stavenhagen et al. , Cancer Res 67 :8882-8890, 2007; Zalevsky etal.，Blood 113 :3735-3743, 2009)。IgGl 中的取代諸如 S239D/I332E/A330L 或 F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L已顯示出可改善與Fe Y -受體IIIa的結合并顯示相較于野生型IgGl更為優異的體外抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)活性及更為優異的體內療效。因此，相較于野生型抗體，預期具有這種取代的抗體可在人體中在相同劑量下取得較好療效或在較低劑量及/或較低給藥頻率下顯示相同療效。另一種減少劑量及/或給藥頻率的方法是減少IgG抗體的清除。報告指出，IgG抗體的長半衰期取決于其與FcRn的結合。因此，已廣泛研究了通過工程化恒定區以增加IgG與FcRn于pH 6. O的結合親和性但仍維持所述相互作用的pH依賴性的取代(Ghetie et al. , Nature Biotech. 15 :637-640, 1997;Hinton et al. , JBC 279 6213-6216，2004;Dali’Acqua et al. , J Immunol 117 :1129-1138, 2006)。變異體中的取代諸如M428L/N434S導致延長的半衰期及提高的藥物藥效學效應(Zalevsky et al.，NatureBiotech. 28 :157-159, 2010)。數個研究報告指出，通過導入諸如T250Q/M428L或M252Y/S254T/T256E的取代以增加在酸性pH下與FcRn的結合，進而成功地延長半衰期。在一項非人靈長動物的藥物動力學試驗中，IgGl的T250Q/M428L取代顯示出35天的半衰期，顯著延長了相較于野生型IgGl的14天的半衰期(Hinton et al. , J Immunol 176 346-356，2006)ο
雖然恒定區的取代可顯著改善治療性IgG抗體的功能，但在嚴格保守性的恒定區的取代可能具有在人體產生免疫原性的風險(Presta, supra, 2008;De Groot andMartin, Clin Immunol 131 :189-201，2009),而在高度多變性的可變區序列的取代可能較不具免疫原性。關于可變區的報告包括工程化CDR殘基以改善抗體與抗原的結合親和性(Rothe et al. , Expert Opin Biol Ther 6 :177-187, 2006;Bostrom et al. , MethodsMol Biol 525 :353-376,2009;Thie et al. ,Methods Mol Biol 525:309-322,2009)、工程化CDR及骨架殘基以改善抗體的穩定性(Worn and Pl uckthun, J Mol Biol 305 989-1010, 2001;Ewert et al. ,Methods 34 :184-199, 2004)及減少抗體免疫原性的風險(De Groot and Martin, supra, 2009;Jones et al. , Methods Mol Bio 525 405-423，xiv, 2009)。這些報告指出，利用噬菌體或核糖體展示的隨機文庫通過親和性成熟可實現針對抗原的親和性的改善。基于序列及基于結構的合理設計可合理地獲得改善的穩定性。可通過各種人源化方法及去除T細胞表位完成免疫原性風險降低(去免疫化)，其可利 用計算機技術預測或使用在體(insilico)技術或者通過體外分析測定。此外，可變區可經工程化以降低P〗。在這些抗體觀察到相較于野生型抗體較長的半衰期，雖然具有可相比的FcRn結合力(Igawa et al. , PEDS, Advance Access, doi 10. 1093/protein/gzq009, 2010)o本發明涉及工程化或選擇呈pH依賴性抗原結合的抗體以改良飾抗體及/或抗原半衰期。如果抗原介導的清除機制正常地降解抗體(當其與抗原結合時)，IgG2抗體的半衰期可能會被縮短。同樣地，該抗原一抗體復合物可能影響抗原的半衰期，不是通過防止抗原受到典型的降解過程以延長半衰期，就是經由抗體介導的降解以縮短半衰期。本發明涉及在pH 7. 4相較于內涵體pH下(即pH 5. 5至6. O)對抗原具有較高的親和性的抗體，致使在諸如pH 5. 5/pH 7. 4或在pH 6. 0/pH7. 4下的Kd比為2或2以上。本發明涉及對其抗原呈所述pH依賴性結合的抗體、及設計、制造及使用所述抗體的方法。有用的抗體實例以抗原諸如前蛋白轉化酶枯草溶菌素9 (PCSK9)亦稱為NARC-I、IgE、dickkopf-相關蛋白I (DKK1)、補體5 (C5)、硬化蛋白(SOST)及GMCSF受體為靶點。PCSK9是一種在某些形式的家族性高膽固醇血癥中被發現的基因突變蛋白質。PCSK9以酶原形式被合成，該酶原在內質網的特定模塊(motif)經自催化加工。族群試驗(population studies)顯示，某些PCSK9突變是“獲得功能”的突變且見于體染色體顯性高膽固醇血癥的個體，然而其他“失去功能(L0F)”的突變是與血漿膽固醇減少有關。此族群的發病率及死亡率試驗清楚地顯示，降低PCSK9的功能顯著地減少心血管疾病的風險。

發明內容
本發明涉及抗體，所述抗體與其抗原呈pH依賴性結合，致使在生理性pH (即pH7. 4)的抗原結合親和性高于在內涵體pH (即pH 6. O或5. 5)的抗原結合親和性。換句話說，在 pH 5. 5/pH 7.4 或 pH 6· 0/ρΗ7· 4 的 Kd 或 Iitjff 比是大于或介于 2、3、4、8、10、16、20、30、40或100或100以上。這種pH依賴性抗體優先地在內涵體內與抗原解離。當抗原是經抗原介導清除的抗原的(例如PCSK9)時侯，相較于在pH 7. 4具有相等Kd值但無pH依賴性結合力的抗體，所述與抗原呈PH依賴性結合的抗體可具有增加的抗體半衰期。當與抗體(例如IL6)結合的抗原的清除減少時，呈pH依賴性結合的抗體可降低總抗原半衰期。呈pH依賴性結合的抗體亦可延長非與抗體結合的抗原的抗體介導性減少。此呈PH依賴性結合的抗體對于拮抗通常呈高量存在的標的抗原(例如IgE、DKKl、C5及SOST)而言可能是重要的。此外，當抗原是受體(例如GMCSF受體)且該受體與抗體結合時的清除增加時，所述抗體可增加抗原半衰期。本發明以下描述的任何實施方式中，Kd及kf可于25°C或37°C下測量。在優選的實施方式中，該呈pH依賴性結合的抗體在pH 7. 4相較于pH 6. O下以較高的親和性與抗原特異性結合，其中在pH 6. 0/pH 7. 4及25°C下的Kd比及/或kf比是大于或介于2、3、4、8、10、16或16以上，且其中當暴露于該抗原時，相較于在pH 7. 4對該抗原具有類似親和性但在pH 6.0/pH 7. 4的相當Kd及/或匕 比是小于2且不呈pH依賴性結合的抗體，該抗體具有減少的體內血漿清除率。優選地該抗原不是介白素-6受體(I L6R)，或優選地該抗體不是如WO 2010/106812或WO 2009/041621所揭示的抗-IL6R抗體Fv3_m73、Fv4-m73 或 H3pl/L73。在另一優選的實施方式中，該呈pH依賴性結合的抗體在pH 7. 4相較于pH 6. O下以較高的親和性與抗原特異性結合，其中在pH 6. 0/pH7. 4及25°C下的Kd比及/或kf比大于或介于2、3、4、8、10、16或16以上，其中該抗原于體內具膜結合性及可溶性，且其中相 較于在pH7. 4對該抗原具有類似親和性但在pH 6. 0/pH 7. 4的相當Kd及/或kf比是小于2的抗體，該抗體介導對細胞膜受體增加的定位。優選地該抗原不是IL6R，或優選地該抗體不是如 WO 2010/106812 或 W02009/041621 所揭示的抗-IL6R 抗體 Fv3_m73、Fv4_m73 或H3pl/L73。在另一優選的實施方式中，該抗原是非信號誘導的可溶性受體。在其他優選的實施方式中，該呈PH依賴性結合的抗體是介導抗體依賴性細胞介導性細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)的抗體藥物綴合物。本發明包括一種呈pH依賴性結合的抗體，該抗體在pH 7. 4相較于pH 6. O下以較高的親和性與抗原特異性結合，其中在pH 6. 0/pH 7. 4及25°C下的Kd比及/或kf比是大于或介于2、3、4、8、10、16或16以上，且其中當非抗體結合的抗原暴露于該抗體時，相較于暴露在PH7. 4對該抗原具有類似親和性但在pH 6. 0/pH 7. 4的相當Kd及/或kf比是小于2且不呈pH依賴性結合的抗體，該抗原于體內的量的減少被延長。本發明提供一種呈pH依賴性結合的抗體，該抗體在pH 7. 4相較于pH 6. O下以較高的親和性與抗原特異性結合，其中在pH 6. 0/pH 7. 4及25°C下的Kd比及/或kf比是大于或介于2、3、4、8、10、16或16以上，且其中相較于在pH 7. 4對與抗體結合的抗原具有類似親和性但在pH 6. 0/pH 7. 4的相當Kd及/或kf比是小于2且不呈pH依賴性結合的抗體，該抗原于體內的量減少。在優選的實施方式中，該抗原是骨橋素(osteopontin)。本發明還提供一種呈pH依賴性結合的激動劑抗體,該抗體在pH7. 4相較于pH 6.0下以較高的親和性與抗原特異性結合，其中在PH6. 0/pH 7. 4及25°C下的Kd比及/或Uf比是大于或介于2、3、4、8、10、16或16以上，且其中該抗原是受體，且該受體當暴露于該抗體時，相較于暴露于在PH 7. 4對該受體具有類似親和性但在pH 6. 0/pH7. 4的相當Kd及/或koff比是小于2的抗體，具有減少的體內清除率。在優選的實施方式中，該受體是GMCSF受體。在任何前述抗體的其他優選的實施方式中，于pH 6. 0/pH 7. 4的Kd比或Iitjff比是大于或介于20、30、40或100或100以上。在其他優選的實施方式中，優選的于pH 6.0/pH7. 4的Kd比或Iitjff比是介于2至3、2至4、2至8、2至10、2至16或2至20或2至20以上，或3至4、3至8、3至10、3至16或3至20，或4至8、4至10、4至16或4至20或4至20以上，或8至10、8至16、8至20或8至20以上，或10至16、10至20或10至20以上，或16至20或16至20以上。在其他先前所述抗體的優選的實施方式中，該于pH 7. 4及25°C下與抗原結合的抗體的Kd是介于約O. OlnM至約IOOnM,或更優選地介于約O. InM至約ΙΟηΜ。在其他先前描述抗體的較佳實施方式中，該抗體與抗原于pH 7. 4的結合的Iitjff是介于約Ix 10E_4s_l至約lxlOE-ls-l,更優選地介于約lxlOE-3 s_l至約IxlOE-I s_l。在前述抗體的另一優選的實施方式中，該抗原是PCSK9。在一優選的實施方式中，該抗-PCSK9抗體不是PCSK9抗體H1M300N (見US2010/0166768)。在其他優選的實施方式中，該抗原是IgE、C5或DKKl，且在優選的實施方式中，該Kd是介于I. OnM至約IOnM或介于I. OnM 至約 IOOnM0本發明還提供一種延長給藥間隔及/或減少治療劑量以利用治療性抗體治療病 患的方法，該方法包含對該病患施用治療有效量的先前所述的本發明的抗體中的任一抗體，其中相較于在PH 7. 4具有類似親和性但pH 6. 0/7. 4及25°C下的Kd比及/或koff比是小于2的抗體，該抗體具有延長的藥物藥效學效應及/或半衰期。本發明還包括通過pH依賴性調節抗體結合親和性以制備具有延長的半衰期及/或藥物藥效學效應的抗體的方法，該方法包含選擇可使影響PKa的微環境優化的抗體CDR組氨酸殘基或其他殘基，致使在PH6. 0/pH7. 4下抗體抗原結合的Kd比及/或I^ff比是大于或介于2、3、4、8、10、16或16以上。本發明還考慮藉此方法制備的抗體，包括具有1、2、3、4、5個或更多個組氨酸取代CDR殘基以使影響pKa的微環境優化的抗體。在上述方法的較優選的實施方式中，該方法另包含使抗體突變以達到在25°C及PH 7. 4測量時Kd為至少IOOnM的抗體親和性。在另一實施方式中，本發明提供一種抗體庫，其在CDR殘基或其他殘基富含組氨酸以使影響pKa的微環境優化。在其他優選的實施方式中，本發明提供一種分離的抗體，該抗體與PCSK9特異性結合且包含源自如SEQ ID NO :4或5所示的重鏈可變區(VH)氨基酸序列的VH互補決定區I (⑶R1)、VH⑶R2及VH⑶R3或在所述的⑶R1、⑶R2及/或⑶R3具有一、二、三或更多個保守性氨基酸取代的變異體。在優選的實施方式中，該抗體另包含如SEQ ID NO 3所示的輕鏈可變區(VL)氨基酸序列的VL⑶R1、⑶R2及⑶R 3或在所述的⑶R1、⑶R2及/或⑶R 3具有一、二、三或更多個保守性氨基酸取代的變異體。本發明還提供下述分離的抗體，其與PCSK9特異性結合且包含具有如SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列的重鏈可變區(VH)互補決定區I (⑶R1)、具有如SEQ ID NO :7所示的氨基酸序列的VH⑶R2、及/或具有如SEQ ID NO :8所示的氨基酸序列的VH⑶R3，或在所述的CDR1、CDR2及/或CDR3具有一或多個保守性氨基酸取代的變異體；以及下述分離的抗體，其與PCSK9特異性結合且包含具有如SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列的VH⑶R1、具有如SEQ ID NO :7所示的氨基酸序列的VH CDR2、及/或具有如SEQ ID NO :9所示的氨基酸序列的VH⑶R3，或在所述的⑶R1XDR2及/或⑶R3具有一、二、三個或更多個保守性氨基酸取代的變異體。在另一實施方式中，本發明考慮分離的抗體，該抗體包含具有如SEQ ID NO 10所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(VL)⑶R1、具有如SEQ ID NO :11所示的氨基酸序列的VL⑶R2及/或具有如SEQ ID NO : 12所示的氨基酸序列的VL⑶R3，或在所述的⑶R1XDR2及/或CDR3具有一、二、三個或更多個保守性氨基酸取代的變異體。在上述的較佳實施方式中，該抗體另包含具有如SEQ ID NO :10所示的氨基酸序列的VL CDRl、具有如SEQ ID NO : 11所示的氨基酸序列的VL CDR2及/或具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的VIXDR3，或在所述的⑶R1、⑶R2及/或⑶R3具有一、二、三個或更多個保守性氨基酸取代的變異體，更佳地，該VH區包含SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 5且該VL 區包含 SEQ ID NO 3 或在所述的 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5 及 / 或 SEQ ID NO 3 具有一、二、三個或更多個保守性氨基酸取代的變異體。在本發明的PCSK9抗體的另一較優選的實施方式中，該抗體具有一或多個Fe突變，優選地 N434S、N434H、M428L-N434H 雙突變、M428L-N434A 雙突變、T250Q-M428L 雙突變或M428L-N434S雙突變。 在另一實施方式中，本發明提供抗體或其抗原結合部分，該抗體或其抗原結合部分是由保藏于美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection)且具有ATCC登記號PTA-10547或PTA-10548及/或PTA-10549的質粒所編碼。本發明還包括醫藥組合物,所述組合物包含治療有效量的任何前述的抗體、重組生產任何前述抗體的宿主細胞、編碼任何前述抗體的分離的核酸及編碼任何前述抗體的分離的核酸。本發明還包括一種減少有此需要的個體的血液LDL膽固醇的量的方法，該方法包含對該個體施用治療有效量的以PCSK9抗原為靶點的本發明的任何抗體。


圖I顯示不同時間的抗體濃度增加為Kd比的函數。圖2顯示不同時間的游離配體(抗原)減少為Kd比的函數。圖3A顯示Iitjff改變對不同時間的抗體濃度的影響，且圖3B顯示km改變對不同時間的抗體濃度的影響。圖4的熱圖顯示呈pH依賴性結合的抗體降低血清抗原濃度的天數多出多少天，抗原血清濃度的降低以Kd (R)、抗原的血清半衰期及抗原的血清濃度為函數。R相當于在內涵體pH比生理性pH下的Kd比。圖5證實該pH依賴性抗體模型的預測性。該模型成功地預測5A10的總抗體濃度(圖5A)。圖5B顯示5A10對LDL的時間效應。圖6亦證實該pH依賴性抗體模型的預測性。該模型成功地預測5L1721H23_6L3H3(6L3H3)的總抗體濃度(圖6A)。圖6B顯示6L3H3對LDL的時間變化效應。相較于5A10，該pH依賴性結合抗體6L3H3延長其中LDL被降低的期間。圖7顯示施用各種PCSK9抗體對總膽固醇效應的時間量程。圖7A顯示5A10對總膽固醇的劑量依賴性效應。圖7B顯示pH依賴性抗體5L1721H23_6H3的劑量依賴效應。此pH依賴性抗體的效應相較于5A10的效應持久。圖8顯示呈pH依賴性結合的抗體5L1721H23_6H3及5L1721H23_6L3H3相較于不呈PH依賴性結合的抗體具有減少的抗體降解及延長的半衰期。圖SB的圖顯示，圖8A顯示的效應是因標的介導性降解所致。在PCSK9基因敲除鼠體內的抗體降解在注射PCSK9后顯著增加。圖9的圖顯示pH敏感性PCSK9拮抗抗體及非pH敏感性PCSK9拮抗抗體對猴膽固醇量的效應。雖然未檢測到HDL量的顯著變化(圖9A)，該pH敏感性抗體相較于非pH依賴性抗體L1L3介導較長時間的LDL量的減少(圖9B)。圖10顯示呈pH依賴性結合的PCSK9抗體相較于非pH依賴性抗體具有延長的體內半衰期。圖11的熱圖顯示pH依賴性結合的常規模型。相較于不呈pH依賴性結合的抗體，所述以抗原DKK1、IgE或C5為標的的呈pH依賴性結合的抗體可顯著增加該抗原經歷減少
量的天數。圖12顯示在施用以抗原IgE為標的的呈pH依賴性結合的抗體后，IgE抗原濃度 的時間量程模型。圖13顯示在施用以抗原DKKl為標的的呈pH依賴性結合的抗體后，DKKl抗原濃度的時間量程模型。圖14顯示在施用以抗原C5為標的的呈pH依賴性結合的抗體后，C5抗原濃度的時間量程模型。圖15詳細說明用于建構模型的呈pH依賴性結合的抗體的穿越模型。本發明的詳細說明本發明涉及抗體，所述抗體與其抗原呈pH依賴性結合，致使在生理性pH (即pH7. 4)的抗原結合親和性高于在內涵體pH (即pH 6. O或5. 5)的抗原結合親和性。換句話說，在 pH 5. 5/pH 7.4 或 pH 6· 0/ρΗ7· 4 的 Kd 或 Iitjff 比是大于或介于 2、3、4、8、10、16、20、30、40或100或100以上。所述pH依賴性抗體優先地在內涵體內與抗原解離。當抗原是經抗原介導性清除者(例如PCSK9)時，相較于在pH 7. 4具有相等Kd值但無pH依賴性結合力的抗體，所述與抗原呈PH依賴性結合的抗體可具有增加的抗體半衰期。當與抗體(例如IL6)結合的抗原的清除減少時，呈PH依賴性結合的抗體可降低平均總抗原半衰期。呈pH依賴性結合的抗體亦可延長非與抗體結合的抗原的減少。此呈pH依賴性結合的抗體對于拮抗通常呈高量存在的標的抗原(例如IgE、DKKl、C5及S0ST)而言可能是重要的。此外，當抗原是受體(例如GMCSF受體)且該受體與抗體結合時的清除增加時，所述抗體可增加抗原半衰期。若抗原介導祀點介導性(target-mediated)降解,那么當以該抗原舉例來說進行靶點介導性清除時(例如PCSK9)，利用所述呈pH依賴性結合的抗體實現在內涵體內的解離可增加該抗體的藥物藥效學效應。該呈PH依賴性結合的抗體自該抗原解離后不再受抗原介導性降解，其可經FcRn結合后再循環至細胞外，且相較于在pH 7. 4具有類似Kd但無pH依賴性結合力的抗體，該呈pH依賴性結合的抗體將具有更長的半衰期。當可溶性抗原(例如IgE、C5、DKKl或SOST )以高濃度存在時，使用所述呈pH依賴性結合的抗體亦具有治療效用。當抗體與內涵體內的抗原解離且抗原在溶小體內降解時，該抗體可再循環至血漿以與其他游離抗原結合，相較于在PH 7. 4具有類似Kd但無pH依賴性結合力的抗體，此抗體可延長非抗體結合的抗原的減少且可減少該所需的治療劑量。此外，當抗原是以膜結合和可溶性兩種形式存在時，例如受體，使用呈pH依賴性結合的抗體可有效地增進抗體與該膜結合形式抗原的結合。通過與該可溶性形式抗原解離，抗體有更多與膜形式抗原再結合的機會，使更多抗體接近細胞膜。若抗體與膜形式抗原經雙價結合，經由親和力(avidity)的作用，可能使該抗體的有效親和性變高,或使該有效解離速率變慢。此可被應用于使用抗體藥物綴合物(ADC)標的以膜結合及可溶性二種形式存在的抗原。在包含FcRn的內皮細胞中，可溶性抗原將被再循環至血漿區室內的ADC清除，使抗體得以與膜結合抗原結合。使用呈PH依賴性結合的抗體時，增加與膜結合形式的抗原的雙價或單價性結合，將造成增加的抗體與膜結合抗原的內化及細胞死亡。若與該受體以雙價結合，親合力可能增加有效親和性或減緩有效解離速率。ADCC及補體依賴性細胞毒性(⑶C)的機轉亦可利用呈pH依賴性結合的抗體加以探討。在包含FcRn的內皮細胞中，可溶性抗原將被再循環至血漿區室內的ADC清除，使抗體得以與膜結合抗原結合。自可溶性受體釋放抗體將增加接著可與膜結合抗原結合的可用游離抗體，并增加細胞死亡。一般技術 除非另外說明，本發明的實施將采用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學的習用技術，這些技術是本領域的公知技藝。所述技術是于文獻中充分解釋，諸如 Molecular Cloning A Laboratory Manual, second edition(Sambrook et al. , 1989) Cold Spring Harbor Press ；01igonucleotide Synthesis(M.J. Gait, ed. , 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press ；Cell Biology ALaboratory Notebook (J. E. Cellis, ed. , 1998)Academic Press ；Animal Cell Culture(R.I. Freshney,ed. , 1987)；Introduction to Cell and Tissue CultureCJ. P. Mather andP. E. Roberts, 1998)Plenum Press ；Cell and Tissue Culture-Laboratory Procedures(A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds. , 1993-1998) J. Wiley and Sons ；Methodsin Enzymology (Academic Press,Inc. ) ；Handbook of Experimental Immunology(D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds. )；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J. M. Miller and M. P. Calos, eds. , 1987) ；Current Protocols in Molecular Biology(F. M. Ausubel et al. , eds. , 1987) ；PCR The Polymerase Chain Reaction, (Mullis etal.,eds.,1994)；Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al. , eds. , 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999) ；Immunobiology(C. A. Janeway and P.Travers, 1997) ；Antibodies (P. Finch,1997) ；Antibodies apractical approach (D. Catty. , ed. , IRL Press, 1988-1989) ；Monoclonal antibodies apractical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds. , Oxford University Press,2000)；Using antibodies alaboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring HarborLaboratory Press, 1999) ；The Antibodies (M. Zanetti and J.D.Capra, eds. , HarwoodAcademic Publishers, 1995)。定義“抗體”是免疫球蛋白分子，其可透過位于該免疫球蛋白分子的可變區的至少一個抗原辨認區特異性地與標的結合，諸如碳水化合物、多核苷酸、脂肪、多肽等。此處所使用的該用語不僅包含完整的多株或單克隆抗體，但亦包含其的任何抗原結合片段(即「抗原結合部分」)或其的單鏈、包含抗體的融合蛋白、及任何其他含有抗原辨認區的經修飾構型的免疫球蛋白分子，包括例如但不限于單鏈(scFv)及結構域抗體(例如人、駱駝或鯊魚結構域抗體)、大型抗體(maxibodies)、迷你抗體(minibodies )、細胞內抗體(intrabodies)、雙價抗體、三價抗體、四價抗體、vNAR及bis_scFv(見例如Hollinger and Hudson, Nature Biotech23 :1126-1136, 2005)。抗體包括任何類型的抗體，諸如IgG, IgA或IgM (或其亞型)，且該抗體不需要是任何特定類型。根據其重鏈的恒定結構域的抗體氨基酸序列，免疫球蛋白可被分成不同類型。有五種主要的免疫球蛋白類型IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其中某些類型可進一步分成亞型(同型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。對應不同類型的免疫球蛋白的重鏈恒定結構域分別被稱為α、δ、ε、Y和μ。不同類型的免疫球蛋白的次單位結構及三維構型是眾所周知。術語抗體的“抗原結合部位”在此處是指完整抗體是一個或多個片段，該片段保留與給定抗原(例如標的X)特異性結合的能力。抗體的抗原結合功能可通過完整抗體的片段實現。術語抗體的“抗原結合片段”所涵蓋的結合片段的實例包括Fab、Fab’、F (ab’)2、由VH及CHl結構域組成的Fd片段、由抗體單臂的VL及VH結構域組成的Fv片段、單一結構域抗體(dAb)片段(Ward et al. , Nature 341 :544-546, 1989)及分離的互補決定區(CDR)。
此處所使用的“Q)R”可能根據任何卡巴(Kabat )、柯西亞(Chothia)、擴展、AbM、完整及/或構形定義加以定義。在特定抗體中組成CDR的氨基酸殘基的特性可利用本領域眾所周知的方法加以測定。此處所使用的抗體CDR可能被識別為原本由卡巴等人所定義的超變異區。見例如 Kabat et al. , 1992, Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, 5th ed. , Public Health Service, NIH, Washington D. C.。CDR 的位置亦可能被識別為最早由柯西亞等人所描述的結構性環圈結構。見例如Chothia et al. , Nature 342 877-883，1989。其他識別⑶R的方法包括“AbM定義”，該法為卡巴法及柯西亞法的折衷，是源自利用牛津分子(Oxford Molecular)的AbM抗體模型軟件(現為Acce I ryS ),或如MacCallum et al.，J. Mol. Biol. 262 =732-745, 1996 所述根據觀察到的抗原接觸的 CDR 的“接觸定義”。在此處稱為CDR的“構形定義”的另一方法中，CDR的位置可能被鑒別為對抗原結合造成焰■貢獻的殘基。見例如Makabe et al. , Journal of Biological Chemistry, 283 1156-1166,2008。雖然其他⑶R邊界定義可能不嚴格遵守上述的方法，但將與至少部分的卡巴CDR重迭，不過它們可能根據特定殘基或殘基群或甚至整個CDR不顯著影響抗原結合的預測或實驗結果被縮短或延長。此處所使用的CDR可能指由任何本領域已知的方法(包括多種方法的組合)所定義的CDR。此處所使用的“單克隆抗體”是指自實質上同源的抗體族群獲得的抗體，意即除了可能少量存在的可能天然發生的突變以外，組成該族群的個別抗體是相同的。單克隆抗體具高度專一性，其是以單一抗原部位為標的。另外，和通常包含拮抗不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑不同的是，各單克隆抗體是以抗原上的單一決定簇為標的。修飾語「單株」表示抗體是自實質上同源的抗體族群獲得的特征，不應被視為需要通過任何特定的方法生產該抗體。舉例來說，本發明所使用的單克隆抗體可通過最早由Kohlerand Milstein, 1975, Nature 256 :495所描述的雜交瘤方法制備，或可通過重組DNA方法諸如美國專利第4，816，567號所述者制備。該單克隆抗體亦可自例如利用McCafferty etal. , 1990, Nature 348 :552-554描述的技術所生產的卩遼菌體庫分尚。此處所使用的“人源化”抗體是指非人(例如鼠)抗體的形式，其為包含源自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合性免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其的片段(諸如Fv、Fab、Fab，、FCabO2或抗體的其他抗原結合子序列)。優選地，人源化抗體是其中源自接受者的互補決定區(CDR)的殘基被源自諸如具有該所欲特異性、親和性及能力的小鼠、大鼠或兔等非人物種(捐贈者抗體)的CDR的殘基所取代的人免疫球蛋白(接受者抗體)。在一些情況中，人免疫球蛋白的Fv骨架區(FR)殘基被對應的非人殘基取代。另外，該人源化抗體可能包含不在接受者抗體或經導入的CDR或骨架序列中的殘基，但這些殘基被包括以進一步改善及優化抗體的表達。整體而言，該人源化抗體將包含實質上所有的至少一個且通常兩個可變結構域，其中所有或實質上所有的CDR區對應非人免疫球蛋白的CDR區且所有或實質上所有的FR區是人免疫球蛋白共同序列的FR區。該人源化抗體亦將理想地包含至少部分的免疫球蛋白恒定區或結構域(Fe)，通常為人免疫球蛋白的該部分。優選地是具有如WO 99/58572所述的修飾的Fe區的抗體。其他形式的人源化抗體具有一或多個相對于原始抗體經改變的 CDR (CDRLl、CDR L2、CDR L3、CDR HI、CDR H2 及 / 或 CDR H3)，所述 CDR 亦被稱為“源自”原始抗體之一或多個⑶R之一或多個⑶R。此處所使用的“人抗體”是指具有對應可由人生產及/或利用任何本領域的技術 人員所知或此處所揭示的制造人抗體的技術所制備的抗體的氨基酸序列的氨基酸序列的抗體。此定義的人抗體包括含有至少一個人重鏈多肽或至少一個人輕鏈多肽的抗體。一個所述實例是包含鼠輕鏈及人重鏈多肽的抗體。人抗體可利用本領域已知的多種技術制備。在一實施方式中，該人抗體是選自曬菌體庫，其中該曬菌體庫表達人抗體(Vaughan etal.，1996，Nature Biotechnology, 14 :309-314;Sheets et al.，1998，Proc. Natl. Acad.Sci. (USA) 95 :6157-6162;Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol. , 227 381 ;Markset al., 1991, J. Mol. Biol. , 222 :581 )。人抗體亦可通過免疫接種動物加以制備，該動物體內的內源性基因座(loci)已被轉基因導入的人免疫球蛋白基因座所取代，例如內源性免疫球蛋白基因已被部分或完全不活化的鼠。此方法是于美國專利第5，545，807,5, 545，806、5，569，825,5, 625，126,5, 633，425及5，661，016號中描述。或者，該人抗體可通過永生化生產以標的抗原為標靶的抗體的人B淋巴細胞加以制備(該B淋巴細胞可自個體收集或可能在體外被免疫)。見例如 Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, AlanR. Liss, p. 77, 1985 ；Boerner et al. , 1991, J. Immunol. , 147 (I) :86-95 及美國專利第5，750，373 號。抗體的“可變區”是指單獨或經組合的抗體輕鏈的可變區或抗體重鏈的可變區。如本領域所知，重鏈及輕鏈的可變區各由四個骨架區(FR)及連接該四個骨架區的含有超變異區的三個互補決定區(⑶R)組成。各鏈中的⑶R被FR拉近在一起，并與來自其他鏈中的CDR導致形成抗體的抗原結合部位。至少有兩種技術用于決定CDR : (I)根據跨種序列變異性的方法(即 Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5thed.，1991，National Institutes of Health, Bethes da MD));及(2)根據抗原-抗體復合物的結晶學試驗的方法(Al-lazikani et al, 1997，J. Molec. Biol. 273 :927_948)。此處所使用的CDR是指以任一方法或兩種方法的組合所定義的CDR。該技藝中所謂的抗體的“恒定區”是指單獨或經組合的抗體輕鏈的恒定區或抗體重鏈的恒定區。此處所使用的用語“PCSK9”是指保留至少部分的PCSK9活性的任何形式的PCSK9及其變異體。除非不同地指明諸如特別指涉人PCSK9，否則PCSK9包括所有哺乳動物物種的天然序列PCSK9，例如人、犬、貓、馬及牛。一個示范性的人PCSK9是見于Uniprot登記號Q8NBP7 (SEQ ID NO :16)。此處所使用的“PCSK9拮抗抗體”是指能抑制PCSK9生物活性及/或抑制由PCSK9信號所介導的下游途徑的抗體，包括PCSK9介導的LDLR下調及PCSK9介導的LDL血液清除減少。PH依賴性PCSK9拮抗抗體包含阻斷、拮抗、抑制或減少(至任何程度包括顯著地)PCSK9生物活性的抗體，包括由PCSK9信號介導的下游途徑，諸如LDLR相互作用及/或誘發對PCSK9的細胞反應。就本發明的目的而言，應清楚了解的是，用語「PCSK9拮抗抗體」包含所有前述用以實質上廢止、降低或中和PCSK9本身、PCSK9生物活性(包括但不限于彼所介導的與LDLR的相互作用、下調LDLR及血液LDL清除減少的任何態樣的能力)或該生物活性的后果至任何有意義的程度的確定用語、標題及功能狀態及特征。在一些實施方式中，PH依賴性PCSK9拮抗抗體與PCSK9結合且防止與LDLR的相互作用。本發明提供PCSK9拮抗抗體的實例。
用語“多肽”、“寡肽”、“肽”及“蛋白質”在此處可交換使用以指稱任何長度的氨基酸鏈，優選地是相對短鏈(例如10至100個氨基酸)。該鏈可為線性或分支，其可能包含經修飾的氨基酸及/或可能被非氨基酸中斷。所述用語亦包含經天然或人為干預修飾的氨基酸鏈；例如雙硫鍵形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操縱或修飾，諸如與標記成份綴合。該定義亦包括例如包含一或多個氨基酸類似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本領域公知的其他修飾的多肽。應了解的是該多肽可以單鏈或相連的鏈存在。如本領域所知的“多核苷酸”或“核酸”在此處可交換使用，是指任何長度的核苷酸的鏈，包括DNA及RNA。該核苷酸可為脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾的核苷酸或堿基及/或其的類似物，或任何可通過DNA或RNA聚合酶被納入鏈中的底物。多核苷酸可包含經修飾的核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其的類似物。若存在的話，對核苷酸結構的修飾可在該鏈組合的前或的后進行。核苷酸的序列可被非核苷酸成份中斷。多核苷酸在聚合的后可進一步被修飾，諸如與標記成份綴合。其它類型的修飾包括例如“加帽(caps)”、以類似物取代一或多個天然發生的核苷酸、核苷酸間修飾諸如舉例來說這些具有不帶電鍵結(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物、胺基甲酸酯等)及帶電鍵結(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)者、這些含有側基團者，諸如例如蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚賴氨酸等)、這些具有嵌入劑(intercalator)者(例如吖啶、補骨脂素等)、這些含有螯合劑者(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)、這些含有烷化劑者、這些具有經修飾的鍵結者(例如α異位性核酸等)以及未經修飾的多核苷酸形式。另外，任何通常存在于糖類中的羥基可能被例如膦酸基、磷酸基取代、被標準保護基保護或被活化以制備與其他核苷酸的額外鍵結，或可能與固體支持物綴合。該5’及3’端OH可被磷酸化或被胺類或自I至20個碳原子的有機加蓋基團取代。其他羥基亦可被衍生成為標準保護基。多核苷酸亦可包含本領域通常已知的類似形式的核糖或脫氧核糖糖類包括例如2’ -O-甲基-核糖、2’ -O-烯丙基核糖、2’_氟代-核糖或2’-迭氮基-核糖、碳環糖類似物、α或β異位性糖類、差向異構體糖類諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、批喃糖糖類、呋喃糖糖類、景天酮庚糖、非環類似物及無堿基核苷類似物諸如甲基核糖苷。一或多個磷酸二酯鍵結可被替代性連接基團取代。這些替代性連接基團包括但不限于其中磷酸鹽被P (O)S (「硫代鹽」)、P (S)S (「二硫代鹽」)、(O) NR2 (「酰胺化物」)、P (O)R, P (O) OR’、CO或CH2 (「甲縮醛」)取代的實施方式，其中各R或R’是獨立地H或經取代或未經取代的烷基(I至20個碳)，該烷基可選擇地含有醚(-0-)鍵結、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基。在多核苷酸中的所有鍵結不需要完全相同。前面的敘述適用于此處所指涉的所有多核苷酸，包括RNA及DNA。若抗體以相較于彼與其他物質結合時更高的親和性、親合力(avidity)、更快速及/或更長時間地與標的結合時，該抗體與標的“特異性結合”或“優先地結合”。舉例來說，與PCSK9表位特異性或優先地結合的抗體是指相較于彼與其他PCSK9表位或非PCSK9表位結合時以更高的親和性、親合力、更快速及/或更長時間地與此表位結合的抗體。由閱讀此定義亦可了解，舉例來說與第一標的特異性或優先地結合的抗體(或基團或表位)可能與第二標的或不與第二標的特異性或優先地結合。因此，“特異性結合”或“優先地結合”不一定需要(雖然其可包括)排他性結合。一般來說(但不必然)，所謂的結合是指優先地結合。“非信號誘導(non — signalling decoy)”是隔離配體與其同源受體的可溶性受體異構體或結合蛋白質。
此處所使用的“實質上純的”是指其為至少50%純的(也就是不含污染物)，更優選地至少90%純的，更優選地至少95%純的，甚至更優選地至少98%純的，且最優選地至少99%純的物質。“宿主細胞”包括可作為或已作為導入多核苷酸插入物的載體的接受者的個別細胞或細胞培養。宿主細胞包括單一宿主細胞的后代，且該后代可能因為天然、意外或蓄意突變而不一定與原始親代細胞完全相同(在形態學或基因學DNA互補性上)。宿主細胞包括經本發明的多核苷酸在體內轉染的細胞。如本領域所知，用語“Fe區”是用于定義免疫球蛋白重鏈的C端區域。該“Fe區”可能為天然序列Fe區或變異體Fe區。雖然免疫球蛋白重鏈的Fe區的邊界可能不同，人IgG重鏈Fe區通常被定義為從Cys226處的氨基酸殘基或從Pro230延伸至其羧基端。Fe區中的殘基編號是如卡巴(Kabat)所述的EU指數。Kabat et al. , Sequences of Proteinsof Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesdaj Md.，1991.免疫球蛋白的Fe區通常包含兩個恒定結構域CH2及CH3。本領域所使用的“Fe受體”或“FcR”描述與抗體的Fe區結合的受體。優選地FcR是天然序列的人FcR。另外，優選地FcR是與IgG抗體結合的受體(Y受體)且包括FcyRI, FcyRII及Fe Y RIII亞型的受體，包括等位基因變異體及可選擇的所述受體的剪切形式。Fe Y RII受體包括Fe Y RIIA (“活化受體”)及Fe Y RIIB (“抑制受體”)，其具有類似的氨基酸序列但主要差異在于細胞質結構域。FcR是于Ravetch and Kinet, 1991, Ann.Rev. Tmmunol · , 9 :457-92 ； Cape I et al. , 1994, Immunomethods, 4 :25-34 ；及 de Haas etal.，1995，J. Lab. Clin. Med.，126 :330-41 中回顧。「FcR」亦包括新生兒受體 FcRn，該受體負責轉運母體 I gG 至胎兒(Guyer et al. , 1976, J. Immunol. , 117 587;and Kim etal. , 1994, J. Immunol. , 24 :249)。此處關于抗體所使用的用語“競爭”是指第一抗體或其抗原結合部分與表位結合的方式充份類似于第二抗體或其抗原結合部分的結合，使得第一抗體與其同源表位在第二抗體存在時的結合結果相較于第二抗體不存在時第一抗體的結合可偵測地降低。或者，該情況可為但不一定是該第二抗體與其表位的結合亦因第一抗體的存在而可偵測地降低。也就是說，第一抗體可抑制第二抗體與其表位的結合，但第二抗體不抑制該第一抗體與其個別表位的結合。然而，當各種抗體不論以相同、較高或較低程度可偵測地抑制另一抗體與其同源表位或配體結合時，所述抗體被稱為彼此“交叉競爭”與其個別表位的結合。本發明包含競爭抗體及交叉競爭抗體。不論該競爭或交叉競爭所藉以發生的機轉為何(例如空間位阻、構形變化或與共同表位或其部分結合)，技術人員將了解根據此處所提供的揭示，本發明包含競爭及/或交叉競爭抗體且其可被用于此處所揭示的方法。“功能性Fe區”具有天然序列Fe區的至少一種效應功能。示范性「效應功能」包括Clq結合、補體依賴性細胞毒性、Fe受體結合、抗體依賴性細胞介導性細胞毒性、吞噬作用、下調細胞表面受體(例如B細胞受體)等。所述效應功能通常需要Fe區與結合結構域(例如抗體可變結構域)結合且可利用本領域已知的各種用于評估所述抗體效應功能的測定檢測。“天然序列Fe區”包含與在天然中發現的Fe區的氨基酸序列完全相同的氨基酸序列。“變異體Fe區”包含與天然序列Fe區有至少一個氨基酸修飾的差異的氨基酸序列，但 仍保留該天然序列Fe區的至少一種效應功能。優選地，該變異體Fe區相較于天然序列Fe區或親代多肽的Fe區具有至少一個氨基酸取代，例如在天然序列Fe區或親代多肽的Fe區中自約I至約10個氨基酸取代，且優選地自約I至約5個氨基酸取代。此處的變異體Fe區將優選地具有與天然序列Fe區及/或與親代多肽的Fe區至少約80%的序列一致性，最優選地具有至少約90%的序列一致性，更優選地具有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%的序列一致性。“最小預期生物效應量(MABEL)”是指在人導致最小生物效應的最小預期劑量。安全因素通常被應用于自MABEL計算人的首次劑量。MABEL的計算應利用所有相關的體外及體內藥物動力學及藥物藥效學信息。此處所使用的“治療”及“治療有效性”是指得到益處或所期望的臨床結果的方法。就本發明的關于PH依賴性PCSK9拮抗抗體的目的而言，益處或所期望的臨床結果包括但不限于下列一或多項增進LDL清除及減少發生或改善異常膽固醇及/或脂蛋白的量，該異常膽固醇及/或脂蛋白的量是因代謝及/或飲食失調所致或包括家族性高膽固醇血癥、致動脈粥樣化異常脂血癥、動脈粥樣硬化及更普遍地心血管疾病(CVD)。“減少發生”是指任何嚴重性的減少，其可包括減少通常用于治療該狀況的其他藥物及/或治療的需求及/或量(例如暴露量)。如本領域的技術人員所了解的，就個體對治療的反應而言可能有所不同，因此舉例來說，“減少發生的方法”反映出施用PH依賴性抗體是根據該施用可能造成特定個體的發生減少的合理預期。“改善”是指施用治療后一或多種癥狀相較于未施用治療時減輕或改善。“改善”亦包括縮短或減少癥狀的持續時間。此處所使用的藥物、化合物或醫藥組合物的“有效劑量”或“有效量”是指足以影響任一或多種益處或所期望的結果的量。就預防性用途而言，益處或所期望的結果包括消除或減少風險、減輕嚴重性或延遲疾病的開始，包括疾病的生化學、組織學及/或行為學的癥狀、其并發癥及在疾病發展期間所表達的中間病理學表型。就PH依賴性PCSK9拮抗抗體的治療用途而言，益處或所期望的結果包括諸如減少高膽固醇血癥或一或多種異常脂血癥、動脈粥樣硬化、CVD或冠狀動脈心臟病的癥狀、降低治療該疾病所需的其他藥物的劑量、增進其他藥物的效果及/或延緩病患的疾病進展的臨床結果。有效劑量可分一或多次施用。就本發明的目的而言，藥物、化合物或醫藥組合物的有效劑量是足以直接或間接完成預防性或治療性治療的量。如在臨床背景下所了解的，藥物、化合物或醫藥組合物的有效劑量可能與或可能不與另一藥物、化合物或醫藥組合物組合達到。因此，在施用一或多種治療劑的情況下考慮 “有效劑量”及若單一劑與一或多種其他劑組合時考慮給予有效量，可能或是經達成所欲的結果。“個體”或“對象”是哺乳動物，更佳地人。哺乳動物亦包括但不限于農場動物、競賽動物、寵物、靈長動物、馬、犬、貓、小鼠及大鼠。此處所使用的“載體”是指建構物，其能在宿主細胞中遞送及優選地表達一或多種感興趣的基因或序列。載體的實例包括但不限于病毒性載體、裸DNA或RNA表達載體、質體、黏質體或噬菌體載體、與陽離子縮合劑有關的DNA或RNA表達載體、包封于脂質體內的DNA或RNA表達載體及某些真核細胞諸如生產細胞。此處使用的“表達控制序列”是引導核酸轉錄的核酸序列。表達控制序列可為啟動子，諸如組成性或誘導性啟動子或增強子。表達控制序列是可操作地與所期望轉錄的核酸序列連接。此處所使用的“醫藥上可接受的載體”或“醫藥上可接受的賦形劑”包括任何當與活性成分組合時能使該成分保留生物活性且不與個體的免疫系統反應的任何物質。實例包括但不限于任何標準醫藥載體諸如磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水、乳液諸如油/水乳液及各種類型的潤濕劑。優選地用于氣霧劑或非經腸施用的稀釋劑是磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或生理(O. 9%)鹽水。包含所述載體的組合物是由眾所周知的公知方法調制(見例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th edition, A. Gennaro, ed. , Mack PublishingCo. , Easton, PA, 1990;and Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20thEd. , Mack Publishing, 2000)。此處所使用的用語“k。/是指抗體與抗原結合的速率常數。具體地說，該速率常數(1^和kf)及平衡解離常數是利用Fab抗體片段(即單價)與抗原測量。此處所使用的用語“kf”是指抗體自抗體/抗原復合物解離的速率常數。此處所使用的用語“KD”是指抗體-抗原相互作用的平衡解離常數。分別測定結合及解離速率常數匕及^以決定Kd及kf比值，利用基于表面等離子共振的生物傳感器，在與配體結合的分析物是單價的條件下表征分析物/配體的相互作用，該配體是經捕捉試劑以低量固定在傳感器表面上。該分析是利用如Karlsson etal.，Anal. Biochem 349，136-147，2006所描述的動力學滴定方法進行。在給定測試中所采用的感應芯片、捕捉試劑及測定緩沖液是按照Myszka，J. Mol. Recognit 12，279-284，1999的建議選擇以提供穩定的捕捉配體至傳感器表面、最小化分析物與表面的非特異性結合及產生適用于動力學分析的分析物結合反應。該按照分析物/配體相互作用的分析物結合反應被雙重參照及帶入I :1蘭繆爾(Langmuir)的“質量傳輸限制模型”，其中ka、kd及Rmax為全局參數如 Myszka&Morton et al. , Biophys. Chem 64,127-137 (1997)所述。平衡解離常數Kd是自動力學速率常數的比值推算，即KD=kd/ka。所述測定優選地在25°C或37°C下進行。A.用于預防或治療疾病的方法在關于pH依賴性PCSK9拮抗抗體的一個方面，本發明提供一種治療或預防個體的高膽固醇血癥及/或異常脂血癥、動脈粥樣硬化、CVD或冠狀動脈心臟病的至少一種癥狀的方法，該方法包含對該個體施用有效量的拮抗循環PCSK9的pH依賴性PCSK9拮抗抗體。在另一方面，本發明提供有效量的拮抗循環PCSK9的pH依賴性PCSK9拮抗抗體以用于治療或預防個體的高膽固醇血癥及/或異常脂血癥、動脈粥樣硬化、CVD或冠狀動脈心臟病的至少一種癥狀。本發明另提供有效量的拮抗細胞外或循環PCSK9的pH依賴性PCSK9拮抗抗體于制造藥物以治療或預防個體的高膽固醇血癥及/或異常脂血癥、動脈粥樣硬化、CVD或冠狀動脈心臟病的至少一種癥狀的用途。有利地，治療性施用該抗體導致較低的血液膽固醇及/或較低的血液LDL。優選的是，血液膽固醇及/或血液LDL相較于施用前至少降低約10%或15%。更優選地，血液膽固醇及/或血液LDL相較于施用該抗體前至少降低約20%。仍更優選地，血液膽固醇及/或血液LDL相較于施用該抗體前至少降低30%。有利地,血液膽固醇及/或血液LDL相較于施用 該抗體前至少降低40%。更有利地，血液膽固醇及/或血液LDL相較于施用該抗體前至少降低50%。仍更優選地,血液膽固醇及/或血液LDL相較于施用該抗體前至少降低60%。最優選地,血液膽固醇及/或血液LDL相較于施用該抗體前至少降低70%。就此處所描述的所有方法而言，提及針對任何適當抗原的pH依賴性抗體還包括包含一或多種添加劑的組合物。所述組合物可能進一步包含適當的賦形劑，諸如醫藥上可接受的賦形劑包括本領域眾所周知的緩沖劑。本發明可被單獨使用或與其他公知的治療方法組合使用。該pH依賴性抗體可經由任何適當的途徑對個體施用。對本領域的技術人員顯而易見的是，此處所描述的實例不應意圖限制而是可用技術的示例。因此在一些實施方式中，該pH依賴性抗體是根據已知方法對個體施用,諸如靜脈內施用例如一次性注射(bolus)或在一段時間內連續輸注、肌肉內、腹腔內、腦脊髓腔內、經皮、皮下、關節內、舌下、滑膜內、經噴入、脊椎鞘內、經口、吸入或局部途徑。施用可為是統性例如靜脈內施用或局部施用。自商業途徑獲得的使用液體制劑的噴霧器包括噴射噴霧器及超音波噴霧器可被用于施用。液體制劑可經直接噴霧，冷凍干燥的粉末可在重構后經噴霧施用。或者，pH依賴性抗體可利用氟碳制劑及定量吸入器加以氣霧化或以經冷凍干燥及磨細粉末的形式吸入。在一實施方式中，pH依賴性抗體是經定點或靶向性局部遞送技術施用。定點或靶向性局部遞送技術的實例包括各種PH依賴性抗體的植入式貯劑來源或局部遞送導管，諸如輸注導管、留置導管、或針頭導管、合成性移植物、外膜層包覆、分流器及支架或其他植入式裝置、定點載體、直接注射或直接施用。見例如PCT公開號WO 00/53211及美國專利第5，981，568 號。pH依賴性抗體的各種制劑可被用于施用。在一些實施方式中，可僅施用該pH依賴性抗體。在一些實施方式中，pH依賴性抗體及醫藥上可接受的賦形劑可呈各種制劑的形式。醫藥上可接受的賦形劑是為本領域所知，且是有助于施用藥理有效物質的相對惰性物質。舉例來說，賦形劑可提供外形或稠度，或作為稀釋劑。適當的賦形劑包括但不限于穩定齊U、潤濕劑、乳化劑、用于改變滲透性的鹽類、包封劑、緩沖劑及皮膚穿透增進劑。用于非經腸及經腸藥物遞送的賦形劑以及制劑是闡述于Remington, The Science and Practice ofPharmacy, 20th Ed. , Mack Publishing (2000)。所述劑可與醫藥上可接受的載體(諸如鹽水、林格(Ringer)氏液、葡萄糖溶液及該類似物)組合。特定給藥配方即劑量、時間及重復性將依特定個體及該個體的醫學病史而定。如此處所述，呈pH依賴性結合的抗體亦可經吸入施用。通常在施用pH依賴性抗體時，初始候選劑量可為約2毫克/公斤。就本發明的目的而言，典型的每日劑量可根據上述因子介于約3微克/公斤至30微克/公斤至300微克/公斤至3毫克/公斤、至30毫克/公斤、至100毫克/公斤或100毫克/公斤以上的任何范圍內。舉例來說，可使用約I毫克/公斤、約2. 5毫克/公斤、約5毫克/公斤、約10毫克/公斤及約25毫克/公斤的劑量。視狀況而重復施用數天或更久時，該治療被持續進行直到發生所欲的癥狀抑制或直到達成足夠的治療量，例如減少血液LDL的量。示范性給藥配方包含施用初始劑量約2毫克/公斤的抗體，隨后每周約I毫克/公斤的維持劑量，或隨后隔周約I毫克/公斤的維持劑量。然而，其他給藥配方可根據醫師所希望達成的藥物動力學衰減模式使用。舉例來說，在一些實施方式中，每周給藥一至四次是經考慮。在其他實施方式中，每月給藥一次或隔月或每三個月給藥一次是經考慮。此治療的進展可通過公知技術及檢測加以輕易地監測。該 給藥配方(包括所使用的抗體)可隨時間而異。就本發明的目的而言，該PH依賴性抗體的適當劑量將依所采用的抗體(或其組合物)、所欲治療的癥狀的類型及嚴重性、該劑是以預防性或治療性目的施用、先前治療、該病患的臨床病史及對該劑的反應、該病患的血液抗原的量、該病患合成及清除抗原的速率、該病患清除該經施用的劑的速率及主治醫師的考慮而定。通常醫師將施用PH依賴性抗體直到達到可完成所欲結果的劑量。劑量及/或頻率可依治療療程而異。經驗性考慮諸如半衰期通常將影響該劑量的決定。舉例來說，可兼容于人免疫系統的抗體諸如人源化抗體或全人抗體可被用以延長該抗體的半衰期及防止該抗體被宿主的免疫系統攻擊。給藥頻率可根據治療的療程加以決定及調整，通常但不一定根據癥狀例如高膽固醇血癥的治療及/或抑制及/或改善及/或延緩。或者，抗體的持續性連續釋放制劑可為適當。各種用于達成持續釋放的制劑及裝置是本領域所知。在一實施方式中，拮抗抗體的劑量在已經給予一或多次拮抗抗體的個體中可憑經驗決定。個體是經給予漸增劑量的抗體。為了評估療效可追蹤疾病的指標。根據本發明的方法施用pH依賴性抗體可為連續性或間歇性，此依例如接受者的生理狀況、該給藥的目的是治療性或預防性及技術人員所知的其他因素而定。PH依賴性抗體的施用可為實質上連續一段預先決定的時間，或可為一系列間隔劑量。在一些實施方式中，可能存在超過一種拮抗抗體。可能存在至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種不同或更多種拮抗抗體及/或肽。通常，所述抗體或肽可能具有不會互相不良影響的互補活性。pH依賴性抗體亦可與其他治療劑組合使用。pH依賴性抗體亦可與其他劑一起使用，以用于增進及/或補充所述劑的有效性。。可接受的載體、賦形劑或穩定劑在所采用的劑量及濃度下對接受者不具毒性，可能包括例如緩沖劑諸如磷酸鹽、朽1檬酸鹽及其他有機酸；鹽諸如氯化鈉；抗氧化劑包括抗壞血酸及甲硫氨酸；保存劑(諸如十八基二甲基芐基氯化銨、六甲氯胺、氯化苯甲烴銨、氯化芐乙氧銨、酚醇、丁醇、芐醇、烷基對羥苯甲酸酯類諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇及間甲酚)；低分子量(小于約10個殘基)多肽；蛋白質諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物諸如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸諸如甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰氨、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或聚葡萄糖；螯合劑諸如EDTA ;糖類諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；鹽形成反離子諸如鈉；金屬復合物(例如鋅蛋白質復合物)'及/或非離子性界面活性劑諸如TWEEN 、PLURONICS 或聚乙二醇(PEG)。含有pH依賴性抗體的脂質體是以本領域已知的方法制備，諸如于Epstein, etal.，1985，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :3688 ；Hwang, et al.，1980，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 77 :4030及美國專利第4，485，045及4，544，545號中所述。循環時間延長的脂質體是揭露于美國專利第5，013，556號。特別有用的脂質體可利用逆相蒸發方法以包含磷脂酰膽堿、膽固醇及PEG-衍生性磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質組合物生產。脂質體被擠壓通過定義孔徑大小的濾網以產生具有所欲直徑的脂質體。該活性成分亦可被包封于通過例如凝聚技術或通過界面聚合化所制備的微膠囊中例如分別于羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(異丁烯酸甲酯)微膠囊中、于膠體藥物 遞送系統中(例如脂質體、白蛋白微球、微乳化液、奈米微粒及奈米微囊)或于巨乳化液中。所述技術是揭不于 Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. , MackPublishing (2000)。可能制備持續釋放性制劑。持續釋放制劑的適當實例包括含有該抗體的固相疏水性聚合物的半透性基體，該基體是呈形狀對象的形式(例如膜或微膠囊)。持續釋放基體的實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚交酯(美國專利第3，773，919號)、L-天門冬酰氨及7乙基-L-天門冬酰氨鹽的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEP0T (由乳酸-乙醇酸共聚物及柳菩林(leuprolide acetate)所組成的注射型微球)、鹿糖乙酸異丁酸酯及聚-D- (-)_3_輕丁酸。希望用于體內施用的制劑必須為無菌。此可輕易地通過例如無菌過濾膜的過濾達成。治療性PH依賴性抗體組合物通常被置放于具有無菌接口的容器中，例如具有可被皮下注射針穿刺的塞子的靜脈溶液袋或小瓶。適當的乳液可利用自商業途徑獲得的脂肪乳液制備，諸如Intralipid 、Liposyn 、Infonutrol 、Lipofundin 及Lipiphysan 。該活性成分可被溶解于預先混合的乳液組合物中，或者可被溶解于油中(例如大豆油、紅花籽油、棉花籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)再與磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)及水混合以形成乳液。將了解的是可添加其他成分例如甘油或葡萄糖以調整該乳液的張力。適當的乳液通常將含有最高20%例如介于5至20%的油。該脂肪乳液可包含介于0. I至I. O微米特別是0. I至0. 5微米的脂肪液滴，且具有介于5. 5至8. O的pH。該乳液組合物可為這些通過混合pH依賴性抗體與Intralipid 或其成份(大豆油、卵磷脂、甘油及水)所制備者。用于吸入或噴入的組合物包括在醫藥上可接受的水性或有機溶劑或其的混合物中的溶液及懸浮液和粉末。該液體或固體組合物可能包含如前述的適當的醫藥上可接受的賦形劑。在一些實施方式中，該組合物是以經口或經鼻呼吸途徑施用以提供局部或系統性效應。在醫藥上可接受的較佳無菌溶劑中的組合物可通過使用氣體加以噴霧化。經噴霧化的溶液可從噴霧裝置直接吸入，或該霧化裝置可與面罩、帷幕或間歇性正壓呼吸器連接。溶液、懸浮液或粉末組合物可自裝置優選地經口或經鼻施用，該裝置以適當方式遞送制劑。B. pH依賴性抗體本發明所使用的抗體可包含單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等)、嵌合抗體、雙特異性抗體、異源綴合抗體、單鏈(ScFv)、其突變物、包含抗體部位的融合蛋白(例如結構域抗體)、人抗體、人源化抗體及任何其他含有該所需特異性的抗原辨認區的免疫球蛋白分子的經修飾構型，包括抗體的糖基化變異體、抗體的氨基酸序列變異體及經共價修飾的抗體。該抗體可為小鼠、大鼠、人或任何其他來源(包括嵌合或人源化抗體)。在一些實施方式中，該pH依賴性抗體是單克隆抗體。該pH依賴性抗體亦可為人源化抗體。在其他實施方式中，該抗體是人抗體。在一些實施方式中，該抗體包含經修飾的恒定區，諸如免疫惰性的恒定區，亦即具有減少的引發免疫反應的能力。在一些實施方式中，該恒定區是經如Eur. J. Immunol.，1999，29 :2613-2624 ；PCT
發明者J·龐斯, J·R·沙博特, J·F·查帕羅里格斯, B·C·戈梅斯, H·梁, K·馬亞瓦拉, J·T·梅特托爾二世, A·拉吉帕爾, D·L·謝爾頓 申請人:瑞納神經科學公司, 輝瑞大藥廠