專利名稱：純化免疫球蛋白溶液的方法
純化免疫球蛋白溶液的方法本文報導了從溶液，例如細胞培養上清液或者蛋白質A層析洗脫液中除去宿主細胞DNA和宿主細胞蛋白質的方法，所述方法不需要告知多肽含量。通過將溶液的pH值降低到低于PH 6和在該pH值下溫育所述溶液實現此目的。
背景技術：
在多種診斷和治療領域中使用生物學大分子如重組單克隆抗體和其他的蛋白質。特別是單克隆抗體現在被廣泛使用在多種嚴重疾病如癌或者類風濕關節炎中。通常，通過使用細菌、酵母或者哺乳動物細胞的發酵過程產生這些復雜生物學大分子。傳統地，通過離心或者過濾從發酵培養液中除去微生物或者哺乳動物細胞，并且之后通過多種方法如過濾、沉淀和層析進一步純化不含細胞的上清液，以除去與發酵相關的雜質。除了培養基組分之外，來自發酵過程的主要雜質是來自產生生物學大分子的細胞 的殘余量的核酸(宿主細胞DNA(HCDNA)和RNA)和宿主細胞蛋白質(HCP)。為治療目的，在最終的藥品中宿主細胞DNA(HCDNA)或者宿主細胞蛋白質的可接受濃度非常低，以減少副作用并且保證患者的安全。在發酵工程中的近來的改進已經導致在生產的生物反應器中較高的細胞密度并且對純化方法提出了更高的要求，所述較高的細胞密度增加了 HCP和HCDNA在無細胞的上清液中的水平。因此非常希望得到從細胞培養上清液中除去大量的HCDNA和HCP的有效的和廉價的方法。O，Brien, W. D.，等人(J. Acoust. Soc. Am. 52 (1972) 1251-1255)報導了脫氧核糖核酸水溶液的超聲研究。Vorlickova, M.,等人(NucI. Acids Res. 27 (1999) 581-586)報導了 DNA的鳥嘌呤-腺嘌呤重復鏈的二聚化。Lydersen等人(Lydersen, B. K.，等人，Ann.N. Y. Acad. Sci. 745 (1994) 222-231)報導了哺乳動物細胞發酵培養液的酸沉淀。在WO2008/127305中報導了使用低pH和二價陽離子分離生物大分子的方法。在EPl 561 756和EPl 380 589中報導了純化蛋白質的方法。發明概沭本文報導了從細胞培養上清液中純化多肽的方法。已經發現通過調整pH值到酸性范圍內并且隨后在特定的時間內溫育酸化的溶液，宿主細胞核酸和宿主細胞蛋白質沉淀，但是目的多肽保留在溶液中。之后通過簡單的物理分離步驟可以除去沉淀物和污染的宿主細胞組分。在處理溶液的過程中，目的多肽保留在溶液中而宿主細胞污染物被沉淀。一方面，本文報導了產生或者獲得免疫球蛋白的方法，其包括以下步驟i)將由酸和水組成的溶液加入到已經被除去細胞和細胞碎片的細胞培養上清液中，用于調整PH值到pH4. 5-pH5. 5的值，其中溶液基本不含二價陽離子，ii)將pH被調整的細胞培養上清液溫育，并且iii)從溫育的細胞培養上清液中除去沉淀物從而產生或者獲得免疫球蛋白，其中所述細胞培養上清液包含不超過10mg/ml的濃度的免疫球蛋白，其中加入的酸的濃度是5. 5mol/l或者更低。在一個實施方案中，在溫育步驟中至少90%的免疫球蛋白保留在溶液中。在另一個實施方案中，在溫育步驟中至少95%的免疫球蛋白保留在溶液中。在另一個實施方案中，在溫育步驟中超過98%的免疫球蛋白保留在溶液中。在一個實施方案中，產生多肽的方法包括以下步驟a)培養包含編碼多肽的核酸的細胞，b)從細胞培養上清液中除去細胞和細胞碎片，c)調整細胞培養上清液的pH值到低于pH 5. 5的值，d)溫育pH被調整的細胞培養上清液，并且e)從經溫育的細胞培養上清液中除去沉淀物，從而產生所述多肽。
另一個方面，本文報導了純化細胞培養上清液的方法，其包括以下步驟a)將細胞培養上清液的pH值調整到低于pH 5. 5的值，b)溫育pH被調整的細胞培養上清液，并且c)從經溫育的細胞培養上清液中除去沉淀物，從而純化細胞培養上清液。另一個方面是產生多肽的方法，其包括以下步驟i)提供包含編碼多肽的核酸的哺乳動物細胞，ii)在無血清的條件下培養所述細胞，iii)回收細胞培養上清液，從細胞培養上清液任選地除去細胞或細胞碎片，和iv)通過以下的步驟純化細胞培養上清液，從而產生所述多肽a)將由酸和水組成的溶液加入到細胞培養上清液中，用于調整pH值到低于pH
5.5的值，所述溶液基本不含二價陽離子，b)溫育pH被調整的細胞培養上清液，并且c)從經溫育的細胞培養上清液中除去沉淀物，其中所述細胞培養上清液包含不超過10mg/ml的濃度的多肽，其中加入的酸的濃度是5. 5mol/l或者更低。在一個實施方案中，調整pH值到從pH 5. 5至pH 3. 5的值。在另一個實施方案中，調整pH值到從pH 5. 5至pH 4. 5的值。在一個實施方案中，將pH被調整的細胞培養上清液在1° C至30° C的溫度下溫育。在另一個實施方案中，將pH被調整的細胞培養上清液在2° C至10° C的溫度下溫育。在另一個實施方案中，將PH被調整的細胞培養上清液在約4° C的溫度下溫育。在一個實施方案中，將pH被調整的細胞培養上清液溫育約O. 5小時或者更長。在另一個實施方案中，將PH被調整的細胞培養上清液溫育約O. 5小時至約72小時。在另一個實施方案中，將PH被調整的細胞培養上清液溫育約2小時至約48小時。在另一個實施方案中，將PH被調整的細胞培養上清液溫育約20小時至約32小時。在另一個實施方案中，將PH被調整的細胞培養上清液溫育約24小時。在一個實施方案中，通過過濾、沉降或者離心除去細胞和細胞碎片和/或除去沉淀物。在另一個實施方案中，細胞培養上清液是哺乳動物細胞培養上清液。在一個實施方案中，多肽是免疫球蛋白。在另一個實施方案中，免疫球蛋白是G類免疫球蛋白。在另一個實施方案中，免疫球蛋白是G類的亞類IgGl或者亞類IgG4的免疫球蛋白或者它們的變體。
在一個實施方案中，免疫球蛋白是亞類IgGl，并且在pH 4. 5至pH 3. 5的pH值下溫育約2小時至約48小時。在一個實施方案中，免疫球蛋白是亞類IgG4，并且在pH 5. 5至pH 4. 5的pH值下溫育約2小時至約30小時。發明詳沭
本文報導了純化多肽的方法，其包括以下步驟a)調整含多肽的細胞培養上清液的pH值到pH3. 5至pH5. 5的值，b)將pH被調整的細胞培養上清液溫育，和c)從溫育的細胞培養上清液中除去沉淀物，從而純化所述多肽。可以用其中細胞和細胞碎片已經被除去的粗制的細胞發酵上清液直接進行本文報導的方法，也可以在一個或者多個初步純化步驟如蛋白質A親和層析之后進行本文報導的方法。術語“細胞培養上清液”表示通過培養分泌目的多肽的細胞獲得的溶液。除分泌的多肽以外，上清液也包含使用的細胞培養基組分和在培養中細胞分泌的除了目的多肽以外的代謝組分以及在培養中從死細胞釋放的培養細胞的其他組分或者在從細胞回收多肽的過程中來自解體細胞的培養細胞的其他組分。細胞培養上清液不含細胞碎片和/或完整細胞。該術語也包括已通過單一層析純化步驟如蛋白質A親和層析處理的細胞培養上清液。術語“多肽”表示多聚體，其由通過天然或者合成產生的肽鍵連接的氨基酸組成。少于約20個氨基酸殘基的多肽可以被稱作“肽”，而由兩個或者以上多肽組成的分子或者包含超過100個氨基酸殘基的一條多肽的分子可以被稱作“蛋白質”。多肽也可以包含非-氨基酸組分，如糖基、金屬離子或者羧酸酯類。通過細胞可以加入非氨基酸組分，在所述細胞內表達多肽，并且隨著細胞類型的不同表達可以不同。本文通過多肽的氨基酸主鏈結構或者編碼相同多肽的核酸方面定義多肽。附加物如糖基通常沒有被具體描述，但是仍然可以存在。在一個本文報導的方法的實施方案中是選自免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和免疫球蛋白綴合物的多肽。術語“免疫球蛋白”表示由兩個或者以上多肽組成的蛋白質，所述多肽基本上由免疫球蛋白基因編碼。公認的免疫球蛋白基因包括不同的恒定區基因以及無數的免疫球蛋白可變區基因。免疫球蛋白通常包含兩個被稱作輕鏈的多肽(輕鏈)和兩個被稱作重鏈的多肽(重鏈)。每種重鏈和輕鏈多肽含有可變結構域(可變區)(通常是多肽鏈的氨基末端部分)，其包含能與抗原相互作用的結合區域。每種重鏈和輕鏈多肽包含恒定區(通常是羧基末端部分)。免疫球蛋白的輕鏈或者重鏈的可變結構域包含不同的區段，即四個框架區(FR)和三個高變區(CDR)。免疫球蛋白的恒定區不直接涉及與免疫球蛋白的抗原的結合，但是顯示出多種效應子功能。根據重鏈恒定區的氨基酸序列，將免疫球蛋白分成類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。將這些類中的一些進一步分成亞類(亞型)，即將IgG分成IgGl、IgG2、IgG3和IgG4，或者將IgA分成IgAl和IgA2。根據免疫球蛋白所屬的類將免疫球蛋白的重鏈恒定區分別稱作a (IgA)、δ (IgD)、ε (IgE), Y (IgG)和μ (IgM)。術語“免疫球蛋白綴合物”表示一種多肽，其包含的免疫球蛋白重鏈或者輕鏈的至少一種結構域通過肽鍵結合到另一種多肽。所述另一種多肽是非免疫球蛋白肽，如激素或者生長受體或者細胞毒性肽或者補體因子等。
在一個實施方案中，免疫球蛋白是G類免疫球蛋白。在另一個實施方案中，免疫球蛋白是G類的亞類IgGl或者亞類IgG4或者其變體。術語“變體”表示由于在親本多肽氨基酸序列中添加、缺失和/或取代一個或者多個氨基酸殘基產生的與親本多肽的氨基酸序列不同的多肽。在一個實施方案中變體具有氨基酸序列，其具有與親本多肽的氨基酸序列至少90%的氨基酸序列同一'I"生，在另一個實施方案中具有至少95%的氨基酸序列同一'丨生,并且在另一個實施方案中具有至少99%的氨基酸序列同一'丨生。本文使用的術語“調整pH值”表示將酸加入到溶液尤其是細胞培養上清液中，以便將溶液的PH值降低到低于pH7. O的值。通過加入酸性溶液，即酸，可以實現所述調整。在一個實施方案中，調整是通過加入選自鹽酸、磷酸、乙酸和檸檬酸的酸性溶液。本文使用的術語“溫育”表示在設定的pH值下維持各溶液。溫育可以保持特定的時間。在一個實驗方案中溫育是約O. 5小時或者以上。在另一個實施方案中，溫育是約O. 5小時至約72小時。在另一個實施方案中，溫育是約2小時至約48小時。在另一個實施方案中，溫育是約20小時至約32小時。在另一個實施方案中，溫育是約24小時。在一個實 驗方案中，在從PH3. 5至pH5. 5的pH值，尤其在pH4. 5至pH5. 5的pH值下溫育上述實施方案中限定的特定時間。本文使用的術語“約”表示直接連續值不是準確的值而是表示一個范圍。在一個實施方案中，所述范圍是所述值加或減20%，在另一個實施方案中，所述范圍是所述值加或減10%,在另一個實施方案中，所述范圍是所述值加或減5%。例如,術語“約24小時”表示從19. 2小時至28. 8小時。術語“基本不含”表示這種化合物沒有被加入到溶液中。但是該特定的化合物可以以少量存在，因為它在溶液中包含的其他化合物中存在。當這種化合物在溶液中以ImM或者更低的濃度，尤其是以I PM或者更低的濃度存在時，通常認為所述溶液基本不含該化合物。本領域已知產生多肽的方法并且其包括蛋白質在原核和真核細胞中的表達以及隨后的分離多肽和通常純化至可藥用的純度。例如，為在細胞中表達免疫球蛋白，通過標準方法將編碼各個輕鏈和重鏈的核酸插入到表達載體中。在合適的原核或真核宿主細胞如CHO細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、ΗΕΚ293細胞、COS細胞、PER. C6 (R)細胞、酵母或大腸桿菌細胞中進行表達，并且從細胞(上清液或裂解后的細胞)回收免疫球蛋白。在本申請中使用的術語“細胞”表示任何類型的能被改造以生產多肽的細胞系統。在一種實施方案中，細胞是哺乳動物細胞。在另一種實施方案中，細胞選自HEK細胞和CHO細胞。已經發現，如果將細胞培養上清液的pH值調整到低于pH 5. 5的值并且隨后將溶液在該PH值下溫育特定的時間，那么培養細胞的核酸和細胞蛋白質沉淀，而分泌的多肽保留在溶液中。之后通過簡單的物理分離步驟即可以除去污染的宿主細胞組分。本文報導的方法可以用于細胞培養上清液的任何類型，S卩，用于真核細胞培養上清液和原核細胞培養上清液。在一個實施方案中，細胞培養上清液是真核細胞培養上清液。在另一個實施方案中，細胞培養上清液是哺乳動物細胞培養上清液。在另一個實施方案中，細胞培養上清液是CHO、HEK或Sp2/0細胞培養上清液。如今，幾乎所有細胞培養方法都在沒有添加的動物血清的情況下進行。因此，在一個實施方案中，在沒有血清的條件下從細胞培養物獲得細胞培養上清液。額外地，由于沒有被添加的動物血清排除了來自動物血清中存在的未知化合物的潛在干擾，并且也降低了在細胞培養上清液中的多肽濃度。這是有利的，因為通常在利用沉淀純化的方法中可能發生目的多肽的共沉淀，由此降低了純化方法的產率。在培養細胞或者細胞碎片的存在下可以觀察到相同的效應。因此，在一個實施方案中，在調整PH值之前從細胞培養上清液除去細胞和細胞碎片。在本文報導的方法中待純化的多肽濃度不超過10mg/ml。在一個實施方案中，細胞培養上清液中的多肽濃度是從O. lmg/ml至約10mg/ml。在另一個實施方案中，細胞培養上清液中的多肽濃度是從lmg/ml至約8mg/ml。在另一個實施方案中，細胞培養上清液中的多肽濃度是從lmg/ml至約5mg/ml。為調整細胞培養上清液的pH值，必須將酸加入到細胞培養上清液中。這種酸可以是任何酸，只要這種酸不與多肽不可逆地相互作用。在一種實施方案中，所述酸選自鹽酸、磷酸、硫酸、甲酸、乙酸、丙酸、丙二酸、丁二酸、肥酸、乳酸和檸檬酸。必須指出，當被加入到 細胞培養上清液時，酸是水溶液。該溶液由作為游離酸的各種酸和水組成并且基本不含其他的物質，尤其是二價陽離子。術語“游離酸”表示所述酸以一種形式存在，其中存在酸性的氫原子并且所述氫原子例如不與不同的陽離子交換。這包括了用于制備溶液的酸的形式也是游離酸；同樣地排除了以鹽形式使用的酸。在一個實施方案中，酸選自鹽酸、磷酸、乙酸和檸檬酸。在一個實施方案中，在各自溶液中的酸濃度是5. 5mol/l或者更低。在另一個實施方案中酸濃度是從lmol/1至5. 5mol/l。在另一個實施方案中酸濃度是從I. 5mol/l至4mol/l。或者在一個實施方案中，在各自溶液中的酸濃度是以重量計30%或者更低。在一個實施方案中，酸濃度是從以重量計的1%至以重量計的30%。在另一個實施方案中，濃度是從以重量計的5%至以重量計的25%。在另一個實施方案中，酸濃度是從以重量計的10%至以重量計的20%。通常，如果本文給出了值的范圍，那么該范圍明確包括列出的邊界點。在調整了 pH值之后，將被調整了 pH值的細胞培養上清液溫育特定的時間。在一個實施方案中，特定的時間至少是O. 5小時或者以上。在另一個實施方案中，特定的時間是從約O. 5小時至約72小時。在另一個實施方案中，特定的時間是從約2小時至約48小時。在另一個實施方案中，特定的時間是從約20小時至約32小時。在另一個實施方案中，特定的時間是約24小時。在一個實施方案中，將pH被調整的細胞培養上清液在1° C至30° C的溫度下溫育。在另一個實施方案中，將PH被調整的細胞培養上清液在2° C至10° C的溫度下溫育。在另一個實施方案中，將PH被調整的細胞培養上清液在約4° C的溫度下溫育。用本文報導的方法可以從細胞培養上清液沉淀(即，除去)宿主細胞核酸和宿主細胞蛋白質而不降低產生的多肽的濃度。約兩小時的溫育時間可以足夠除去大量的宿主細胞核酸。因此，在一個實施方案中，溫育是保持約2小時。為沉淀宿主細胞蛋白質，根據調整的PH值和多肽，約2小時至約48小時的溫育時間可以是足夠的。因此，在一個實施方案中，在約pH 5的pH值下在約4° C的溫度下溫育約2小時。在另一個實施方案中，在約5的PH值下在約4° C的溫度下溫育約2小時至約48小時。在一個實施方案中，所述多肽是免疫球蛋白。
在一個實施方案中，所述免疫球蛋白是亞類IgGl的免疫球蛋白。在另一個實施方案中，在約PH4. 5至pH3. 5的pH值下溫育2小時至48小時，并且免疫球蛋白是亞類IgGl的免疫球蛋白。在特定的實施方案中溫育2小時至30小時。在一個實施方案中，所述免疫球蛋白是亞類IgG4的免疫球蛋白。在另一個實施方案中，在約PH5. 5至pH4. 5的pH值下溫育2小時至48小時，并且免疫球蛋白是亞類IgG4的免疫球蛋白。在特定的實施方案中在約PH5的pH值下溫育。溫育之后必須除去沉淀。為除去沉淀，可以使用本領域技術人員已知的任何方法。示例性的方法是過濾、沉積和傾析、離心和沉降。在一個實施方案中通過選自沉積、過濾、沉降和離心的方法除去沉淀。除去沉淀之后，例如用本領域技術人員已知的層析方法可以進行多肽的進一步純化。因此在一個實施方案中，本文報導的方法包括用一個或者多個層析步驟純化多肽的步
驟。 為純化免疫球蛋白，可以利用不同柱層析步驟的組合。在一個實施方案中，在蛋白質A親和層析之后是一種或者兩種額外的層析分離步驟，例如離子交換層析步驟。很好地建立并且廣泛使用了用于蛋白質回收和純化的不同的方法，如用微生物蛋白的親和層析(例如蛋白質A或蛋白質G親和層析)、離子交換層析(如陽離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(氨基乙基樹脂)和混合模式的交換)、親硫吸附(例如用β_巰基乙醇和其他的SH配體)、疏水相互作用或芳香吸附層析(如苯基瓊脂糖、Aza-arenophilic樹脂、或間-氨基苯基硼酸)、金屬螯合親和層析(例如用鎳(II)和銅(II)-親和材料)、尺寸排阻層析和電泳方法(如凝膠電泳、毛細管電泳)。提供了下面的實施例和附圖來幫助理解本發明，在所附權利要求中給出了本發明的真實范圍。應當理解，可以對給出的方法進行修改，只要不背離本發明的精神。
圖I用本文報導的方法獲得的抗-EGFR抗體發酵培養上清液中的宿主細胞DNA含量。圖2用本文報導的方法獲得的抗-EGFR抗體發酵培養上清液中的宿主細胞蛋白質含量。圖3用本文報導的方法獲得的抗-EGFR抗體發酵培養上清液中的抗體含量。圖4用本文報導的方法獲得的抗-PLGF抗體發酵培養上清液中的宿主細胞DNA含量。圖5用本文報導的方法獲得的抗-PLGF抗體發酵培養上清液中的宿主細胞蛋白質含量。圖6用本文報導的方法獲得的抗-PLGF抗體發酵培養上清液中的抗體含量。圖7用本文報導的方法獲得的抗-P-選擇素抗體發酵培養上清液中的宿主細胞DNA含量。圖8用本文報導的方法獲得的抗-P-選擇素抗體發酵培養上清液中的宿主細胞蛋白質含量。圖9用本文報導的方法獲得的抗-P-選擇素抗體發酵培養上清液中的抗體含量。
圖10用本文報導的方法根據pH值和溫育時間獲得的抗-PLGF抗體發酵培養上清液中的抗體含量。圖11用本文報導的方法根據pH值和溫育時間獲得的抗-P-選擇素抗體發酵培養上清液中的抗體含量。圖12用本文報導的方法根據pH值和溫育時間獲得的抗-HER3抗體發酵培養上清液中的抗體含量。實施例I材料和方法杭體 用WO 2008/017963中報導的抗-EGFR抗體例證本文報導的方法。另一種示例性的免疫球蛋白是WO 2006/099698中報道的抗-PLGF抗體。另一種示例性的免疫球蛋白是WO 2005/100402中報道的抗_P_選擇素抗體。另一種示例性的免疫球蛋白是PCT/EP2010/070062中報道的抗-HER3抗體。DNA通過Q-PCR(定量聚合酶鏈反應)測量殘余的DNA濃度。因此，在高溫下溫育樣品使樣品中的DNA變性。根據制造商說明書，通過硅基質從溶液中捕獲DNA并且用緩沖液洗脫DNA。使用包括QIAamp病毒RNA試劑盒的QIAcube自動機械(二者都來自Qiagen，希爾登，德國)用于提取。因此，將樣品、裂解緩沖液和載體RNA混合并且溫育10分鐘。將乙醇加入到每支管中并且用樣品-乙醇溶液裝載QIAamp病毒RNA試劑盒的柱并且離心。之后將不同的洗滌溶液施加到柱上，并且再次離心柱。將洗脫緩沖液施加到柱之后，離心兩次。使用LightCycler 2. O (羅氏診斷公司，曼海姆，德國)用于DNA的定量。在表I中概述了 PCR參數。表1:PCR 參數
權利要求
1.產生免疫球蛋白的方法，其包括以下步驟 i)將由酸和水組成的溶液加入到已經被除去細胞和細胞碎片的細胞培養上清液中，用于將PH值調整到pH 4. 5-pH5. 5的值，其中溶液基本不含二價陽離子， )溫育PH被調整的細胞培養上清液，和 iii)從被溫育的細胞培養上清液中除去沉淀物從而產生免疫球蛋白， 其中所述細胞培養上清液包含不超過10mg/ml的濃度的免疫球蛋白， 其中加入的酸的濃度是5. 5mol/l或者更低。
2.根據權利要求I的方法，其特征在于在溫育步驟中至少90%的免疫球蛋白保留在溶液中。
3.根據上述權利要求任一項的方法，其特征在于在2°C至10° C的溫度下溫育。
4.根據權利要求3的方法，其特征在于pH被調整的細胞培養上清液在約4°C的溫度下溫育。
5.根據上述權利要求任一項的方法，其特征在于將PH被調整的上清液溫育約至少2小時。
6.根據權利要求5的方法，其特征在于溫育是約2小時至約72小時。
7.根據權利要求6的方法，其特征在于溫育是約2小時至約48小時。
8.根據權利要求7的方法，其特征在于溫育是約24小時。
9.根據上述權利要求任一項的方法，其特征在于免疫球蛋白是亞類IgGl，并且在pH4. 5至pH3. 5的pH值下溫育約2小時至約48小時。
10.根據權利要求I至8的任一項的方法，其特征在于免疫球蛋白是亞類IgG4，并且在pH5. 5至pH4. 5的pH值下溫育約2小時至約30小時。
11.根據上述權利要求任一項的方法，其特征在于通過選自沉積、傾析、過濾、沉降和離心的方法除去沉淀物。
12.根據上述權利要求任一項的方法，其特征在于所述酸選自乙酸、檸檬酸、鹽酸和磷酸。
13.根據上述權利要求任一項的方法，其特征在于所述酸的濃度是從I.5mol/l至5.5mol/l。
14.根據權利要求12至13的任一項的方法，其特征在于所述酸是具有I.5mol/l至4mol/l的濃度的乙酸。
15.根據上述權利要求任一項的方法，其特征在于免疫球蛋白的濃度是lmg/ml至5mg/ml ο
16.根據上述權利要求任一項的方法，其特征在于所述細胞是CHO細胞。
17.根據上述權利要求任一項的方法，其特征在于在約4°C的溫度下在約pH5或約PH4的pH值下溫育約2小時。
18.根據權利要求I至16的任一項的方法，其特征在于在約4°C的溫度下在約pH5或約PH4的pH值下溫育約2小時至約48小時。
全文摘要
本文報導了直接在發酵之后或者在一個或多個初步純化步驟如蛋白質A親和層析之后純化細胞培養上清液的方法。通過將pH值調整到酸性范圍內和隨后溫育酸化的溶液，宿主細胞核酸和宿主細胞蛋白質可以被沉淀，而目的多肽保留在溶液中。之后通過簡單的物理分離步驟可以除去沉淀物和污染的宿主細胞組分。
文檔編號C07K1/30GK102791726SQ201180013130
公開日2012年11月21日 申請日期2011年3月9日 優先權日2010年3月10日
發明者C·哈克邁爾, F·施瓦茨, V·賓德爾 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司